RNA in samples collected after 72 h

RNA in samples collected after 72 h of fermentation was isolated
according to procedures (Santos et al., 2008). 2100 Bioanalyser (Agilent
Technologies) was used to analyze the integrity and concentration of
RNA. All RNA samples were diluted to the same concentration. The potential
DNA contamination was removed by digestion with DNase I
(DNA-free; Ambion). cDNA was synthesized by using oligo(dT)18 and
2 μg of total RNA treated with RNase-free DNase I and M-MLV Reverse
Transcriptase. To quantify the differential expression of the B12 biosynthesis
gene in different fermentations, we performed Q-RT-PCR. Amplification
was carried out in 96-well plates in an ABI Prism 7700 (Applied
Biosystems). Fluorescent agent SYBR Green was used for detection.
Reactions were set up by using the SYBR Green Master Mix from the
same manufacturer, following its recommendations. Primers of cobT,
cbiA, and rpsO (Housekeep gene) were listed here according to Santos
et al. (2008).
The specificity of annealing was checked by the melting curve
analysis. Comparisons were made between different culture media.
To determine relative fold differences for each sample, the threshold
cycle (Ct) value was normalized to the Ct value for rpsO and calculated
relative to a calibrator by using the formula 2−ΔΔCT.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

อาร์เอ็นเอในตัวอย่างที่เก็บรวบรวมหลังจาก h 72 ของหมักดองได้แยกตามขั้นตอน (ซานโตส et al., 2008) Bioanalyser 2100 (Agilentเทคโนโลยี) ใช้ในการวิเคราะห์ความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอ ตัวอย่างอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกทำให้เจือจางให้ความเข้มข้นเดียวกัน ศักยภาพดีเอ็นเอปนเปื้อนถูกเอาออก โดยย่อยอาหารกับ DNase ฉัน(ฟรีดีเอ็นเอ Ambion) มีสังเคราะห์ cDNA โดย oligo (dT) 18 และΜg 2 ของอาร์เอ็นเอรวมรับฟรี RNase DNase ฉันและกลับ M MLVTranscriptase วัดปริมาณค่าที่แตกต่างของการสังเคราะห์ B12ยีนในหมักแหนมที่แตกต่างกัน เราทำ Q-RT-PCR ขยายได้ดำเนินการในแผ่นดี 96 ในการ 7700 ปริซึม ABI (ประยุกต์Biosystems) ตัวแทนฟลูออเรส SYBR Green ใช้สำหรับตรวจสอบปฏิกิริยาถูกตั้งค่า โดยใช้ผสม SYBR Green หลักจากการเดียวกันผู้ผลิต ทำตามคำแนะนำของ ไพรเมอร์ของ cobTcbiA และ rpsO (Housekeep ยีน) ถูกแสดงที่นี่ตามซานโตสal. ร้อยเอ็ด (2008)Specificity ของการอบเหนียวถูกตรวจสอบ โดยโค้งละลายวิเคราะห์ แปลงเปรียบเทียบระหว่างสื่อวัฒนธรรมแตกต่างกันเพื่อกำหนดความแตกต่างสัมพัทธ์พับสำหรับแต่ละตัวอย่าง ขีดจำกัดตามปกติค่า Ct สำหรับ rpsO และคำนวณค่าวงจร (Ct)สัมพันธ์กับเครื่องสอบเทียบโดย 2−ΔΔCT สูตร

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

อาร์เอ็นเอในตัวอย่างที่เก็บรวบรวมได้หลังจาก 72
ชั่วโมงของการหมักที่แยกได้ตามขั้นตอน(ซานโตส et al., 2008) 2100 Bioanalyser (Agilent
เทคโนโลยี)
ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ความสมบูรณ์และความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอ ตัวอย่าง RNA ทั้งหมดถูกปรับลดความเข้มข้นเดียวกัน ที่มีศักยภาพการปนเปื้อนดีเอ็นเอถูกลบออกโดยการย่อยอาหารที่มี DNase ฉัน (DNA ฟรี; Ambion) ยีนสังเคราะห์โดยใช้ Oligo (dT) 18 และ2 ไมโครกรัมของอาร์เอ็นเอรวมการรักษาด้วย RNase ฟรี DNase I และ M-MLV ย้อนกลับTranscriptase ปริมาณการแสดงออกที่แตกต่างกันของการสังเคราะห์บี 12 ยีนในกระบวนการหมักที่แตกต่างกันเราดำเนินการ Q-RT-PCR ขยายได้ดำเนินการในแผ่น 96 หลุมใน ABI ปริซึม 7700 (Applied Biosystems) ตัวแทนเรืองแสงสีเขียว SYBR ถูกนำมาใช้สำหรับการตรวจสอบ. ปฏิกิริยาถูกตั้งขึ้นโดยใช้สีเขียว SYBR ผสมนายจากผู้ผลิตเดียวกันตามคำแนะนำของ ไพรเมอร์ของ cobT, CBIA และ rpsO (ยีน Housekeep) ถูกแสดงไว้ที่นี่ตามที่ซานโตสและอัล (2008). ความจำเพาะของการหลอมที่ได้รับการตรวจสอบโดยโค้งละลายวิเคราะห์ เปรียบเทียบได้ทำสื่อระหว่างวัฒนธรรมที่แตกต่าง. เพื่อตรวจสอบความแตกต่างเท่าญาติแต่ละตัวอย่างเกณฑ์วงจร (กะรัต) มูลค่าเป็นปกติค่ากะรัตสำหรับ rpsO และคำนวณเทียบกับสอบเทียบโดยใช้สูตร2 ΔΔCT

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

อาร์เอ็นเอในการเก็บตัวอย่างหลังจาก 72 ชั่วโมงของการหมักคือแยก
ตามขั้นตอน ( ซานโตส et al . , 2008 ) 2100 bioanalyser ( Agilent
เทคโนโลยี ) เพื่อวิเคราะห์ความสมบูรณ์และความเข้มข้นของ
RNA ตัวอย่างอาร์เอ็นเอทั้งหมดเพื่อลดความเข้มข้นเดียวกัน การปนเปื้อนดีเอ็นเออาจถูกลบออกโดยการย่อยด้วย

( DNA ตรวจหา ADNase ผมฟรี ambion )ยีนสังเคราะห์โดยใช้โอลิโก ( DT ) 18
2 μกรัมรวม RNA การตรวจหา ADNase เลสฟรีและ m-mlv ย้อนกลับ
อาการ . ที่มีความแตกต่างในการแสดงออกของยีนใน fermentations 12
แตกต่างกัน เราก็แสดง q-rt-pcr . (
ได้ดําเนินการใน 96 ดีจานใน ABI ปริซึมหน้า ( ใช้
Biosystems ) ตัวแทนเรืองแสงสีเขียว SYBR ใช้ตรวจจับ .
ปฏิกิริยาที่ถูกสร้างขึ้นโดยการใช้สีเขียว SYBR Master Mix จาก
ผู้ผลิตเดียวกัน ตามคำแนะนำของ ไพรเมอร์ของ cobt
cbia , และ rpso ( ยีนดูแลบ้าน ) อยู่ตามซานโตส
et al . ( 2551 ) .
ความจำเพาะของการหลอมละลายถูกตรวจสอบโดยการวิเคราะห์เส้นโค้ง

การเปรียบเทียบระหว่างสื่อวัฒนธรรมที่แตกต่างกัน พบว่าญาติ
พับแต่ละตัวอย่างวัฏจักรธรณี
( CT ) มูลค่าปกติค่า CT และคำนวณ rpso
เทียบกับคาลิเบรเตอร์ โดยใช้สูตร 2 −ΔΔ ct