Western blottingTransfering the gel

Western blotting
Transfering the gel
1. While the gel is running, prepare the transfer buffer, and cut out a piece of
nitrocellulose and four pieces of Whatmann filter paper for the transfer.
Our Biorad tank takes about 3 liters of transfer buffer.
2. Cut out the Whatmann filter papers so they each are slightly larger than
the gel in each dimension--about 1/4 to 1/2 cm larger. Cut out the
nitrocellose so that it is slightly smaller than the Whatmann filter papers
but still covers the entire surface of the gel.3. Float the nitrocellulose filter on the surface of a tray of deionized water and
allow it to wet from beneath by capillary action. Then, submerge the filter
in the water for five minutes to displace trapped air bubbles.
4. Remove the plates from the apparatus. Remove the spacers and pry off
one of the plates by inserting a spatula and twisting the plate up. The gel
should now be stuck to one of the plates.
5. Carefully float the gel off the plate into a tupperware container containing
transfer buffer. Let it equilibrate in the transfer buffer for 15 minutes.
6. When the gel has equilibrated, construct a "sandwich" for the transfer as
follows:
a. Place some transfer buffer in a large glass or tupperware container
and place the plastic frame inside so the green side is lying in the
buffer and the white side is folded out.
b. Place a sponge on top of the green side, then stack two sheets of
the Whatmann paper you cut out on top. These things should be
submerged in the buffer so that they become completely wet.
c. Place the nitrocellulose filter, labeled appropriately, on top, then
carefully position the gel on top of this.
d. Add two more pieces of Whatmann filter paper, then a second
sponge. Then press everything down into the buffer and squeeze
out any air bubbles that might be trapped in the sandwich using a
pipette as a roller.
e. Close the sandwich by folding the white side over onto the green
and locking it in place. Then immerse the sandwich in our transfer
tank to which transfer buffer has been added. Since the proteins
will migrate toward the positive end, make sure that the
nitrocellulose side is closest to the positive electrode. That is, the
green side of the sandwich should be facing the red side of the
tank.
7. Transfer the gel by running at 25 V overnight. Make sure to have the
cooling unit on at 4 C so that cold water can circulate through the tank
while the transfer is taking place. Otherwise, if the buffer gets hot, bubbles
of air may come out of solution and become trapped in the sandwich.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Blotting วิธีตะวันตกโอนเจ1. ใช้เจ เตรียมบัฟเฟอร์ที่โอน และตัดออกจากชิ้นส่วนของnitrocellulose และสี่ชิ้นส่วนของกระดาษกรอง Whatmann สำหรับการโอนย้ายถัง Biorad เราใช้บัฟเฟอร์โอนประมาณ 3 ลิตร2. ตัดออก Whatmann ตัวกรองเอกสารเพื่อให้แต่ละเล็กน้อยมากกว่าเจลในแต่ละมิติ - ใหญ่ประมาณ 1/4 1/2 ซม. ตัดออกจากการnitrocellose เพื่อจะเล็กกว่า Whatmann ตัวกรองเอกสารแต่ยังครอบคลุมทั่วพื้นผิวของ gel.3 ลอยตัว nitrocellulose บนพื้นผิวของถาดน้ำ deionized และอนุญาตให้เปียก โดยแรงยกจากข้างใต้ การจมตัวลงใต้น้ำแล้วในน้ำ 5 นาทีเพื่อเลื่อนติดฟองอากาศ4. เอาแผ่นออกจากเครื่อง เอาที่ spacers และ pry ปิดหนึ่งแผ่นโดยแทรกการพาย และบิดจานค่า เจควรตอนนี้จะติดอยู่แผ่นหนึ่ง5. ระมัดระวังลอยเจปิดจานเป็นแบบ tupperware คอนเทนเนอร์ประกอบด้วยโอนย้ายบัฟเฟอร์ ให้มัน equilibrate ในบัฟเฟอร์โอน 15 นาที6. เมื่อมี equilibrated เจ สร้าง "แซนด์วิช" สำหรับการโอนย้ายเป็นดังนี้: อ.ทำบัฟเฟอร์โอนบางในภาชนะแก้วหรือ tupperware ขนาดใหญ่และวางให้ด้านสีเขียวจะอยู่ในกรอบพลาสติกภายในบัฟเฟอร์และด้านขาวจะพับออกb. ทำฟองน้ำด้านข้างสีเขียว แล้วกองสองแผ่นกระดาษ Whatmann ที่คุณตัดออกด้านบน สิ่งเหล่านี้ควรsubmerged in the buffer so that they become completely wet. c. Place the nitrocellulose filter, labeled appropriately, on top, thencarefully position the gel on top of this. d. Add two more pieces of Whatmann filter paper, then a secondsponge. Then press everything down into the buffer and squeezeout any air bubbles that might be trapped in the sandwich using apipette as a roller. e. Close the sandwich by folding the white side over onto the greenand locking it in place. Then immerse the sandwich in our transfertank to which transfer buffer has been added. Since the proteinswill migrate toward the positive end, make sure that thenitrocellulose side is closest to the positive electrode. That is, thegreen side of the sandwich should be facing the red side of thetank.7. Transfer the gel by running at 25 V overnight. Make sure to have thecooling unit on at 4 C so that cold water can circulate through the tankwhile the transfer is taking place. Otherwise, if the buffer gets hot, bubblesof air may come out of solution and become trapped in the sandwich.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เวสเทิร์ซับ
โอนเจล
1 ในขณะที่เจลกำลังทำงานเตรียมความพร้อมบัฟเฟอร์โอนและตัดออกจากชิ้นส่วนของ
nitrocellulose และสี่ชิ้นส่วนของกระดาษกรอง Whatmann สำหรับการถ่ายโอน.
ถัง Biorad ของเราจะใช้เวลาประมาณ 3 ลิตรบัฟเฟอร์โอน.
2 ตัดออกจากกระดาษกรอง Whatmann เพื่อให้พวกเขาแต่ละคนมีขนาดใหญ่กว่า
เจลในแต่ละมิติ - ประมาณ 1/4 ถึง 1/2 ซม. ขนาดใหญ่ ตัดออก
nitrocellose เพื่อให้มีขนาดเล็กกว่ากระดาษกรอง Whatmann
แต่ยังคงครอบคลุมพื้นผิวทั้งหมดของ gel.3 ลอยกรอง nitrocellulose บนพื้นผิวของถาดน้ำปราศจากไอออนและ
อนุญาตให้เปียกจากใต้โดยการกระทำของเส้นเลือดฝอย จากนั้นจมลงใต้น้ำตัวกรอง
ในน้ำเป็นเวลาห้านาทีเพื่อไล่ฟองอากาศติด.
4 นำแผ่นจากเครื่อง ลบ spacers และแงะออก
หนึ่งของแผ่นโดยการใส่ไม้พายและบิดจานขึ้น เจล
ควรจะติดอยู่กับหนึ่งในแผ่น.
5 ระมัดระวังลอยออกแผ่นเจลลงในภาชนะทัปเปอร์แวร์ที่มี
การถ่ายโอนบัฟเฟอร์ ปล่อยให้มันสมดุลในบัฟเฟอร์โอนเป็นเวลา 15 นาที.
6 เมื่อเจลได้ equilibrated สร้าง "แซนวิช" สำหรับการถ่ายโอนเป็น
ดังนี้
สถานที่การถ่ายโอนบัฟเฟอร์บางอย่างในแก้วขนาดใหญ่หรือภาชนะทัปเปอร์แวร์
และวางกรอบพลาสติกด้านในเพื่อให้ด้านสีเขียวจะนอนอยู่ใน
กันชนและด้านสีขาวพับออก.
ข ฟองน้ำวางอยู่ด้านบนของด้านข้างสีเขียวแล้วสแต็คสองแผ่น
กระดาษ Whatmann คุณตัดออกจากด้านบน สิ่งเหล่านี้ควรจะ
จมอยู่ใต้น้ำในบัฟเฟอร์เพื่อให้พวกเขากลายเป็นเปียกอย่างสมบูรณ์.
ค วางกรอง nitrocellulose ป้ายเหมาะสมด้านบนแล้ว
อย่างระมัดระวังเจลวางตำแหน่งบนนี้.
d เพิ่มสองชิ้นอื่น ๆ จาก Whatmann กระดาษกรองแล้วสอง
ฟองน้ำ จากนั้นกดปุ่มทุกอย่างลงไปในกันชนและบีบ
ออกฟองอากาศใด ๆ ที่อาจจะติดอยู่ในแซนวิชโดยใช้
ปิเปตเป็นลูกกลิ้ง.
อี ปิดแซนวิชโดยพับด้านข้างสีขาวมากกว่าสีเขียวบน
และล็อคไว้ในสถานที่ แล้วแช่แซนวิชในการถ่ายโอนของเรา
ถังที่บัฟเฟอร์โอนได้รับการเพิ่ม เนื่องจากโปรตีน
จะโยกย้ายไปยังปลายบวกให้แน่ใจว่า
ด้าน nitrocellulose ใกล้เคียงกับขั้วบวก นั่นคือ
ด้านสีเขียวของแซนวิชที่ควรจะหันหน้าไปทางด้านข้างสีแดงของ
รถถัง.
7 โอนเจลโดยการทำงานที่ 25 V ในชั่วข้ามคืน ให้แน่ใจว่ามี
การระบายความร้อนในหน่วยที่ 4 องศาเซลเซียสเพื่อให้น้ำเย็นสามารถหมุนเวียนผ่านถัง
ขณะที่การถ่ายโอนที่เกิดขึ้น มิฉะนั้นถ้าบัฟเฟอร์ได้รับความร้อนฟอง
อากาศอาจจะออกมาของการแก้ปัญหาและกลายเป็นติดอยู่ในแซนวิช

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

Western blotting
ส่งเจล
1 ในขณะที่เจลใช้ เตรียมโอน บัฟเฟอร์ และตัดเป็นชิ้นสี่ชิ้น whatmann
ไนโตร และกระดาษกรองสำหรับการโอน
ถัง biorad ของเราใช้เวลาประมาณ 3 ลิตร บัฟเฟอร์โอน .
2 ตัด whatmann กรองเอกสารเพื่อให้พวกเขาแต่ละมีขนาดใหญ่กว่า
เจลในแต่ละมิติ -- ประมาณ 1 / 4 ถึง 1 / 2 เซนติเมตร ขนาดใหญ่ ตัด
nitrocellose เพื่อให้มันมีขนาดเล็กกว่า whatmann กรองกระดาษ
แต่ยังครอบคลุมพื้นผิวทั้งหมดของเจล 3 . กรองไนโตรลอยบนพื้นผิวของน้ำและถาดคล้ายเนื้อเยื่อประสาน
ให้มันเปียกใต้สำหรับการกระทำ แล้วจุ่มในน้ำกรอง
5 นาทีแทนที่ติดกับดักฟองอากาศ .
4 เอาแผ่นออกจากเครื่องเอา spacers และแงะ
หนึ่งแผ่นใส่ไม้พายและบิดแผ่นขึ้น เจล
ควรจะติดไปหนึ่งจาน .
5 ค่อยๆลอยปิดแผ่นเจลในทัปเปอร์แวร์ภาชนะที่มี
บัฟเฟอร์การถ่ายโอน ให้มันสมดุลกันในการบัฟเฟอร์สำหรับ 15 นาที .
6 เมื่อเจลได้ equilibrated สร้าง " แซนด์วิช " สำหรับการโอนเป็นดังนี้ :

aบางโอนบัฟเฟอร์ในแก้วที่มีขนาดใหญ่หรือภาชนะ Tupperware
วางกรอบพลาสติกภายในดังนั้นด้านข้างสีเขียวอยู่ใน
บัฟเฟอร์ และด้านสีขาวที่พับออก
B วางฟองน้ำด้านบนของด้านสีเขียว แล้วซ้อนสองแผ่น
whatmann กระดาษที่คุณตัดด้านบน สิ่งเหล่านี้ควรจะ
มิดในบัฟเฟอร์เพื่อให้พวกเขากลายเป็นเปียกไปหมด .
Cวางกรอง ไนโตรข้อความอย่างเหมาะสม ด้านบนแล้ว
อย่างระมัดระวังตำแหน่งเจลด้านบนนี้ .
D เพิ่มอีก 2 ชิ้น whatmann กระดาษกรอง แล้วฟองน้ำสอง

แล้วกดทุกอย่างลงในบัฟเฟอร์และบีบ
ออกฟองอากาศใด ๆที่อาจจะติดอยู่ในแซนด์วิชที่ใช้
เปตเป็นลูกกลิ้ง .
E ปิดแซนวิชพับด้านสีขาวลงบนสีเขียว
และล็อคในสถานที่ แล้วแช่ในถังส่งแซนวิช
ของเราที่บัฟเฟอร์รับถูกเพิ่ม เนื่องจากโปรตีน
จะโยกย้ายไปยังจุดสิ้นสุด บวกให้แน่ใจว่า
ไนโตรด้านใกล้ขั้วไฟฟ้าบวก นั่นคือ
เขียวด้านของแซนวิชควรจะหันหน้าด้านข้างสีแดงของถัง
.
7 โอนเจลโดยการวิ่งที่ 25 ในชั่วข้ามคืนให้แน่ใจว่าได้
เย็นหน่วยที่ 4 องศาเซลเซียส ดังนั้นน้ำที่เย็นจะไหลเวียนผ่านถัง
ในขณะที่การถ่ายโอนเป็นสถานที่ถ่าย มิฉะนั้นถ้าบัฟเฟอร์ได้รับร้อนฟอง
อากาศอาจออกมาแก้ปัญหา และกลายเป็นติดอยู่ในแซนด์วิช