2.6. Image analysisThe 2-DE gels we

2.6. Image analysis
The 2-DE gels were scanned with a high-resolution image scanner (GE Healthcare) at a resolution of 300 dpi and 24-bit color. The scanned gels were saved as TIF images for subsequent analysis. Spot detection, measurement, background subtraction and matching were performed using ImageMaster 2D Platinum 7.0 (GE Healthcare). Spot intensity was quantified by the total spot volume normalization and the resulting spot volume percentage was used for comparison. Only those with significant and reproducible changes in the spots were considered to be differentially expressed proteins.
2.7. In-gel protein digestion
The differentially expressed protein spots were cut from the 2-DE gels, transferred into a 0.5 mL microcentrifuge tube and rinsed twice with Mill-Q water, then destained for 1 h at room temperature using a freshly prepared wash solution consisting of 30 mM of K3Fe(CN)6/ 100 mM of Na2S2O4(V/V = 1:1). Discarded the destained solution and washed the gel pieces three times with 200 μL of Mill-Q water, then added 400 μL of 100% acetonitrile for 15 min and dried the gels in a Speedvac for 10 min. Then the gel pieces were rehydrated in enough sequencing grade trypsin (Promega, USA) solution (20 μg/mL in 25 mM NH4HCO3) and incubated at 37 °C overnight. The supernatants were transferred into a 200 μL microcentrifuge tube and the gel pieces were extracted once with extraction buffer (67% acetonitrile containing 1% trifluoroacetic acid). The peptide extracted and the supernatants of the gel pieces were combined and then completely dried in a SpeedVac.
2.8. MALDI-TOF/TOF MS analysis and database search
Digested peptides were resuspended with 5 μL of 0.1% trifluoroacetic acid and then the peptide samples were mixed with a matrix consisting of a saturated solution of α-cyano-4-hydroxy-trans-cinnamic acid in 50% acetonitrile-1% trifluoroacetic acid (1:1). 0.8 μl of liquots were spotted onto stainless steel sample target plates. Peptide mass spectra were obtained using a 4800 MALDI-TOF/TOF mass spectrometer (an Applied Biosystems MDS Sciex, Foster City, CA). Data were acquired in positive MS reflector using a CalMix5 standard to calibrate the instrument (ABI4700 Calibration Mixture). Mass spectra were obtained from each sample spot by accumulation of 900 laser shots in an 800–4000 Da mass range. For MS/MS spectra, the 8 most abundant precursor ions per sample were selected for subsequent fragmentation and 2000 laser shots were accumulated per precursor ion. The criterion for precursor selection was a minimum S/N of 50. Both the MS and MS/MS data were interpreted and processed by using the GPS Explorer software (V3.6, Applied Biosystems). Then the obtained MS and MS/MS spectra per spot were combined and exported to peaklist files. The peaklist files were then submitted to MASCOT search engine(http:// www.matrixscience.com) on line to identify the proteins in MS/MS ion search pattern with the following parameters: NCBInr and EST databases, taxonomy of Metazoa (Animals), trypsin of the digestion enzyme, one missed cleavage site, fixed modification of cysteine carboamido methylated and partial modification of methionine
28 L. Fan et al. / Aquaculture 454 (2016) 27–34 oxidized, MS tolerance of 0.1 Da, MS/MS tolerance of 0.25 Da. Known contaminant ions (keratin) were excluded. MASCOT MS/MS ion score of greater than 47 was considered statistically significant (p ≤ 0.05).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6 การภาพที่วิเคราะห์เจลเดอ 2 ถูกสแกน ด้วยเครื่องสแกนภาพความละเอียดสูง (GE สุขภาพ) ที่ความละเอียด 300 dpi และสี 24 บิต เจสแกนถูกบันทึกเป็นรูปภาพ TIF สำหรับวิเคราะห์ในภายหลัง จุดตรวจ การวัด การลบพื้นหลัง และจับคู่ถูกดำเนินการโดยใช้แพลทินัม 2D ImageMaster 7.0 (GE ดูแลสุขภาพ) ความเข้มที่จุดถูกวัด โดยปกติปริมาตรจุดรวม และจุดปริมาณเปอร์เซ็นต์ผลใช้สำหรับเปรียบเทียบ เฉพาะผู้ที่ มีการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญ และจำลองในจุดถูกถือเป็นโปรตีนที่แสดงแตกต่างกัน2.7. ย่อยโปรตีนเจลจุดที่แสดงแตกต่างกันโปรตีนถูกตัดจากเจ 2 DE โอนเข้าท่อไมโคร 0.5 mL และล้างน้ำ Q มิลล์สองครั้ง แล้ว destained สำหรับ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องใช้โซลูชันเตรียมสดใหม่ล้างประกอบด้วย 30 มม.ของ K3Fe (CN) 6 / 100 มม.ของ Na2S2O4(V/V = 1:1) ละทิ้งการแก้ปัญหา destained และล้างชิ้นเจสามเท่ากับ 200 μL น้ำมิลล์-Q แล้วเพิ่ม μL 400 ของ acetonitrile 100% 15 นาที และแห้งเจใน Speedvac 10 นาที แล้ว ชิ้นเจ rehydrated ในโซลูชันพอทริปซิน (Promega, USA) เกรดลำดับ (20 μ/มิลลิลิตรใน 25 มม. NH4HCO3) และได้รับการกกที่ 37 ° C ค้างคืน Supernatants การถ่ายโอนลงในหลอดไมโคร μL 200 และชิ้นเจที่สกัดครั้งเดียว ด้วยบัฟเฟอร์สกัด (acetonitrile 67% ประกอบด้วยกรด trifluoroacetic 1%) เปปไทด์ที่สกัดและ supernatants ชิ้นเจรวม และสมบูรณ์อบแห้งในแบบ SpeedVac2.8 ค้นหาวิเคราะห์และฐานข้อมูล MS MALDI-TOF/TOFเปปไทด์ย่อยมี resuspended กับ μL 5 ของ 0.1% กรด trifluoroacetic และเปปไทด์รวมตัวกับเมทริกซ์ที่ประกอบด้วยสารละลายอิ่มตัวกรด α-cyano-4-hydroxy-trans-cinnamic ในกรด trifluoroacetic acetonitrile - 1% 50% (1:1) Μl 0.8 ของ liquots ถูกส่องลงบนแผ่นสแตนเลสตัวอย่างเป้าหมาย เปปไทด์มวลสเปกตรัมได้รับใช้เป็น 4800 MALDI-TOF/TOF มวลสเปกโตรมิเตอร์ (การประยุกต์ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ MDS Sciex ฟอสเตอร์ซิตี้ CA) ข้อมูลที่ได้รับมาในรีเฟลกเตอร์ MS บวกที่ใช้ CalMix5 มาตรฐานการปรับเทียบเครื่องมือ (ABI4700 สอบเทียบผสม) มวลสเปกตรัมได้รับจากตัวอย่างแต่ละจุด โดยสะสมของเลเซอร์ 900 ภาพในช่วงมวลดา 800-4000 สำหรับสเปกตรัม MS/MS ไอออนสารตั้งต้นสุด 8 ต่อตัวอย่างถูกเลือกสำหรับการกระจายตัวตามมา และจับเลเซอร์ 2000 ถูกสะสมต่อไอออนของสารตั้งต้น เกณฑ์การคัดเลือกสารตั้งต้นคือ S/N ต่ำสุดที่ 50 ข้อมูลทั้ง MS และ MS/MS ถูกตีความ และประมวลผล โดยใช้ซอฟต์แวร์ GPS Explorer (V3.6 ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ) แล้วได้รับ MS และ MS/MS สเปกตรัมต่อจุดถูกรวม และส่งออกไปยังแฟ้ม peaklist แฟ้ม peaklist แล้วส่งมาที่เครื่องมือค้นหามิ่งขวัญ (http:// www.matrixscience.com) บนบรรทัดเพื่อระบุโปรตีนในรูปแบบการค้นไอออน MS/MS กับพารามิเตอร์ต่อไปนี้: NCBInr และเอสฐานข้อมูล ระบบภาษี Metazoa (สัตว์), ทริปซินของเอนไซม์ย่อยอาหาร ไซต์หนึ่งพลาดความแตกแยก แก้ไขปรับเปลี่ยน carboamido cysteine ที่ methylated และปรับเปลี่ยนบางส่วนของเมไทโอนีน28 ลิตรพัดลมร้อยเอ็ด / 454 เพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ (2016) 27 – 34 ออกซิไดซ์ MS ค่าเผื่อดา 0.1, 0.25 Da. รู้จักสารปนเปื้อนไอออน (keratin) ได้รวมค่าเผื่อ MS/MS มิ่งขวัญ MS/MS ไอออนคะแนนมากกว่า 47 เป็นนัยสำคัญทางสถิติ (p ≤ 0.05)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 การวิเคราะห์ภาพ
เจล 2 ที่ถูกสแกนด้วยภาพสแกนเนอร์ความละเอียดสูง (GE Healthcare) ที่ความละเอียด 300 dpi และสี 24 บิต เจลสแกนได้รับการบันทึกเป็นภาพ TIF สำหรับการวิเคราะห์ในภายหลัง การตรวจสอบจุดที่การวัดการลบพื้นหลังและการจับคู่ได้ดำเนินการโดยใช้ ImageMaster 2D ลาตินั่ม 7.0 (GE Healthcare) ความเข้มของจุดที่ถูกวัดโดยการฟื้นฟูปริมาณจุดรวมและร้อยละปริมาณจุดที่เกิดถูกนำมาใช้สำหรับการเปรียบเทียบ เฉพาะผู้ที่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญและสามารถทำซ้ำในจุดที่ได้รับการพิจารณาให้เป็นโปรตีนที่แสดงความแตกต่างกัน.
2.7 ในเจลย่อยอาหารโปรตีน
ที่แสดงออกแตกต่างกันจุดโปรตีนถูกตัดออกจากเจล 2-de โอนลงในหลอดไมโคร 0.5 มิลลิลิตรและล้างสองครั้งด้วยน้ำ Mill-Q แล้ว destained เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องโดยใช้วิธีการแก้ปัญหาล้างปรุงสดใหม่ประกอบด้วย 30 มิลลิเมตร K3Fe (CN) 6/100 มม Na2S2O4 (v / v = 1: 1) ทิ้งทางออก destained และล้างชิ้นเจลสามครั้งกับ 200 ไมโครลิตรน้ำ Mill-Q แล้วเพิ่ม 400 ไมโครลิตรของแท้ 100% acetonitrile นาน 15 นาทีและแห้งเจลใน Speedvac สำหรับ 10 นาที จากนั้นชิ้นเจลได้รับการคืนรูปในพอ trypsin ลำดับชั้นประถมศึกษาปี (Promega, สหรัฐอเมริกา) วิธีการแก้ปัญหา (20 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรใน 25 มม NH4HCO3) และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในชั่วข้ามคืน supernatants ถูกโอนลงในหลอดไมโคร 200 ไมโครลิตรและชิ้นเจลสกัดครั้งเดียวกับกันชนสกัด (67% acetonitrile มีกรด TRIFLUOROACETIC 1%) เปปไทด์ที่สกัดและ supernatants ชิ้นเจลมารวมกันแล้วแห้งสนิทใน SpeedVac.
2.8 MALDI-TOF / TOF MS วิเคราะห์และค้นหาฐานข้อมูล
แบบสอบถามเปปไทด์ที่ถูก resuspended 5 ไมโครลิตรของกรด TRIFLUOROACETIC 0.1% แล้วตัวอย่างเปปไทด์ที่ถูกผสมกับเมทริกซ์ประกอบด้วยสารละลายอิ่มตัวของกรดα-cyano-4-ไฮดรอกซี-Trans-ซินนามิก ใน 50% acetonitrile-1% กรด TRIFLUOROACETIC (1: 1) 0.8 ไมโครลิตรของ liquots เป็นด่างลงบนแผ่นสแตนเลสเป้าหมายตัวอย่าง เปปไทด์สเปกตรัมมวลที่ได้รับใช้ 4800 MALDI-TOF / TOF มวลสเปกโตรมิเตอร์ (เป็น Applied Biosystems MDS Sciex, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย) ข้อมูลที่ได้มาในเชิงบวก MS สะท้อนแสงโดยใช้มาตรฐาน CalMix5 การสอบเทียบเครื่องมือ (ABI4700 สอบเทียบผสม) สเปกตรัมมวลที่ได้รับจากแต่ละจุดที่กลุ่มตัวอย่างโดยการสะสมของ 900 ภาพเลเซอร์ในช่วง 800-4,000 มวลดา สำหรับ MS / MS สเปกตรัม, 8 ไอออนสารตั้งต้นที่มีมากที่สุดต่อตัวอย่างถูกเลือกสำหรับการกระจายตัวที่ตามมาและ 2000 เลเซอร์ภาพสะสมต่อปูชนียบุคคลไอออน เกณฑ์สำหรับการเลือกสารตั้งต้นเป็นขั้นต่ำ S / N 50 ทั้ง MS และ MS / MS ข้อมูลตีความและประมวลผลโดยใช้ซอฟแวร์จีพีเอส Explorer (v3.6, Applied Biosystems) จากนั้นได้รับ MS และ MS / MS สเปกตรัมต่อจุดมารวมกันและส่งออกไป peaklist ไฟล์ ไฟล์ peaklist ที่ถูกส่งมาจากนั้นไปยังเครื่องมือค้นหา MASCOT (http: // www.matrixscience.com) ในบรรทัดเพื่อแจ้งโปรตีนใน MS / MS รูปแบบการค้นหาไอออนที่มีพารามิเตอร์ต่อไปนี้: NCBInr และ EST ฐานข้อมูลอนุกรมวิธานของ Metazoa (สัตว์) , trypsin เอนไซม์ย่อยอาหารซึ่งเป็นหนึ่งในเว็บไซต์ที่ไม่ได้รับความแตกแยกการปรับเปลี่ยนคงที่ของการปรับเปลี่ยน cysteine ​​carboamido แอลกอฮอล์และบางส่วนของ methionine
28 ลิตรพัดลม, et al / เพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ 454 (2016) 27-34 ออกซิไดซ์อดทน MS 0.1 อดทนดา, MS / MS 0.25 ดา หรือเป็นที่รู้จักไอออนสารปนเปื้อน (เคราติน) ได้รับการยกเว้น คะแนนไอออน MASCOT MS / MS มากกว่า 47 ได้รับการพิจารณาอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p ≤ 0.05)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 การวิเคราะห์ภาพมีแผ่นเจลถูกสแกนด้วยเครื่องสแกนภาพความละเอียดสูง ( GE Healthcare ) ที่ความละเอียด 300 dpi และสี 24 บิต สแกนเจลถูกบันทึกเป็น TIF ภาพสำหรับการวิเคราะห์ในภายหลัง การตรวจสอบ การวัดจุด ลบพื้นหลัง และการจับคู่การใช้ imagemaster 2D แพลทินัม 7.0 ( GE Healthcare ) จุดตรวจความเข้มโดยรวมจุดปริมาณการฟื้นฟูและเกิดจุดปริมาณใช้ค่าร้อยละเปรียบเทียบ เฉพาะผู้ที่มีการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญและ ) ในจุดที่เป็นแสดงออกแตกต่างกันโปรตีน2.7 . ในการย่อยโปรตีน เจลที่แสดงออกแตกต่างกันโปรตีนจุดถูกตัดจากแผ่นเจล , โอนลง 0.5 มล. หลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ และล้างด้วยน้ำ mill-q สองครั้งแล้ว destained 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องที่ใช้เตรียมสดล้างสารละลายประกอบด้วย 30 มม. k3fe ( CN ) 6 / 100 มม. na2s2o4 ( V / V = 1 : 1 ) บริษัทโซลูชั่น destained ล้างเจลชิ้นสามครั้ง 200 μ l mill-q น้ำแล้วเพิ่ม 400 μ L 100% ไน 15 นาทีและเจลในการทำให้แห้งนาน 10 นาที จากนั้นได้ทำการ รีไฮเดรทมในเจลชิ้นพอลำดับเกรดซิน ( promega , USA ) สารละลาย ( 20 μกรัม / มิลลิลิตร ใน 25 มม. nh4hco3 ) บ่มที่ 37 ° C ในชั่วข้ามคืน การ supernatants ถูกถ่ายโอนลงในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ 200 μผมและเจลชิ้นสกัดเมื่อบัฟเฟอร์การสกัด ( 67 เปอร์เซ็นต์ไนที่มี 1% กรดไตรฟลูออโรอะซิติก ) เปปไทด์ที่สกัดและ supernatants ของเจลชิ้นรวมกันแล้วทำให้แห้งอย่างสมบูรณ์ใน .2.8 . maldi-tof / tof การวิเคราะห์ MS และฐานข้อมูลการค้นหาเปปไทด์ คือ resuspended ย่อย 5 μ L 0.1% กรดไตรฟลูออโรอะซิติกและเปปไทด์จำนวนผสมกับเมทริกซ์ที่ประกอบด้วยสารละลายอิ่มตัวของ cyano-4-hydroxy-trans-cinnamic กรดแอลฟา 50% acetonitrile-1 % กรดไตรฟลูออโรอะซิติก ( 1 : 1 ) μ 0.8 ลิตร liquots ถูกพบบนสแตนเลสเหล็กแผ่นตัวอย่างเป้าหมาย . เปปไทด์มวลสเปกตรัมได้ใช้ 4800 / tof แมสสเปกโทรมิเตอร์ maldi-tof ( Applied Biosystems MDS sciex ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย ) ข้อมูลที่ได้มาบวก MS สะท้อนโดยใช้มาตรฐาน calmix5 เพื่อสอบเทียบเครื่องมือ ( abi4700 สอบเทียบผสม ) มวลสเปกตรัมที่ได้จากแต่ละตัวอย่างจุด โดยการยิงเลเซอร์ใน 800 – 900 , 000 ดาช่วงมวล . สำหรับ MS / MS spectra , 8 มากที่สุด มากมายสารไอออนต่อกลุ่มตัวอย่างสุ่มการกระจายตัวตามมาและ 2000 ยิงเลเซอร์ถูกสะสมต่อสารไอออน เกณฑ์สำหรับการเลือกสารตั้งต้นถูกสุด S / N ของ 50 ทั้ง MS และ MS / MS ข้อมูล ตีความ และประมวลผลโดยการใช้จีพีเอสสำรวจซอฟต์แวร์ ( v3.6 ประยุกต์ Biosystems ) จากนั้นนำ MS และ MS / MS spectra ต่อจุดถูกรวมและส่งออกไปยัง peaklist ไฟล์ ไฟล์ peaklist แล้วส่งไปยังเครื่องมือค้นหามิ่งขวัญ ( http : / / www.matrixscience . com ) บนบรรทัดระบุโปรตีนใน MS / MS รายละเอียดรูปแบบการค้นหาด้วยพารามิเตอร์ต่อไปนี้ : ncbinr และ EST ฐานข้อมูลอนุกรมวิธานของสัตว์ ( สัตว์ ) , ทริปของการย่อยอาหารเอนไซม์ตัวหนึ่งพลาดเว็บไซต์ แก้ไขดัดแปลง ซิสเทอีน carboamido methylated บางส่วนและการปรับเปลี่ยนของเมทไธโอนีน28 . พัดลม et al . 454 / เพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ ( 2016 ) 27 - 34 จาก MS ความอดทน 0.1 ดา , MS / MS ความอดทนต่อ 0.25 ดา . รู้จักการไอออน ( keratin ) ไม่รวม สำหรับ MS / MS รายละเอียดคะแนนมากกว่า 47 มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ( P ≤ 0.05 )