Establishment of a PCR-RFLP assayBl

Establishment of a PCR-RFLP assay
Blood was sampled from plumage veins and was stored in tubes containing EDTA
as an anticoagulant. DNA was isolated by a slightly modified standard salting out procedure
described by Miller et al. (1988). Fragments of 400 and 250 bp of the GnRHR and NPY genes,
respectively, were amplified by polymerase chain reaction (PCR) in a total of 25 μL, which
included 1μL pooled DNA, 1 μL each primer (10 μM), 0.5 μL dNTPS (10 mM), 2.5 μL 10X
PCR buffer, and 1 U TaqDNA polymerase, using special primers (Table 1). Cycles applied
were: initial denaturation at 94°C for 5 min; 30 cycles consisting of 60 s at 94°C, 60 s at
59.7°C and 60 s at 72°C for denaturation, annealing and extension steps, respectively; and a
final extension at 72°C for 7 min. PCR products of the GnRHR and NPY genes were digested
by 1 μL Bpu1102I and DarI enzymes, respectively, and electrophoresed on a 2% agarose gel
stained with ethidium bromide.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

จัดทดสอบ PCR-RFLPเป็นตัวอย่างจากขนเส้นเลือด และเก็บในหลอดที่ประกอบด้วย EDTAเป็นสารกันเลือดแข็งตัว ดีเอ็นเอที่ถูกแยก โดยการเปลี่ยนมาตรฐานหมักเกลือออกกระบวนการอธิบายโดยมิลเลอร์ et al. (1988) ชิ้นส่วนของ 400 และ 250 bp ของยีน GnRHR และ NPYตามลำดับ ถูกขยาย โดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) จำนวน 25 μL ซึ่งพู 1μL รวมดีเอ็นเอ 1 μL แต่ละสีรองพื้น (10 ไมครอน), 0.5 μL dNTPS (10 มิลลิเมตร), 2.5 μL 10 XPCR บัฟเฟอร์ และพอลิเมอเรส 1 U TaqDNA ใช้ไพรเมอร์พิเศษ (ตารางที่ 1) วงจรที่ใช้ถูก: denaturation เริ่มต้นที่ 94° C 5 นาที 30 รอบประกอบด้วย 60 s ที่ 94° C, 60 s ที่59.7° C และ 60 s ที่อุณหภูมิ 72° C denaturation การหลอม และการขยายขั้นตอน ลำดับ และการนามสกุลสุดท้าย 72° c สำหรับผลิตภัณฑ์ PCR 7 นาทีของยีน GnRHR และ NPY ถูกย่อยสลายโดย 1 μL Bpu1102I และดารีเอนไซม์ ตามลำดับ และ electrophoresed ในเจ 2% agaroseเลอะโบรไมด์ ethidium

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สถานประกอบการของการทดสอบ PCR-RFLP
เลือดตัวอย่างจากหลอดเลือดดำขนนกและถูกเก็บไว้ในหลอดที่มี EDTA
เป็นสารกันเลือดแข็ง ดีเอ็นเอที่แยกได้จากมาตรฐานการแก้ไขเล็กน้อยเกลือการตามขั้นตอน
ที่อธิบายไว้โดยมิลเลอร์, et al (1988) ชิ้นส่วนของ 400 และ 250 bp ของ GnRHR และ NPY ยีน
ตามลำดับขยายโดยวิธี Polymerase chain reaction (PCR) ในจำนวน 25 ไมโครลิตรซึ่ง
รวม1μLรวบรวมดีเอ็นเอ 1 ไมโครลิตรแต่ละไพรเมอร์ (10 ไมครอน), 0.5 ไมโครลิตร dNTPS ( 10 มิลลิเมตร) 2.5 ไมโครลิตร 10X
PCR บัฟเฟอร์และ 1 U TaqDNA โพลิเมอร์โดยใช้ไพรเมอร์พิเศษ (ตารางที่ 1) รอบนำมาใช้
คือ: denaturation เริ่มต้นที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที; 30 รอบซึ่งประกอบด้วย 60 s ที่ 94 ° C, 60 s ที่
59.7 องศาเซลเซียสและ 60 s ที่ 72 ° C เป็นเวลาสูญเสียสภาพธรรมชาติ, การอบและการขยายขั้นตอนตามลำดับ; และ
ขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ของ GnRHR และ NPY ยีนถูกย่อย
โดย 1 ไมโครลิตร Bpu1102I และ Dari เอนไซม์ตามลำดับและ electrophoresed บน agarose gel ที่ 2%
ย้อมด้วย ethidium bromide