The bacterial spore suspensions wer

The bacterial spore suspensions were fixed in 2.5% glutaraldehyde
in 0.1MPIPES (pH 7.4) buffer in 1.5ml polypropylene tubes for
a minimum of 2 h. The suspensions were centrifuged (5400  g,
2 min) and resuspended in 0.1 M PIPES (pH 7.4) buffer three times.
After the final centrifugation, the buffer was removed to leave a
pellet.
For TEM, the cell pellets were mixed 1:1 with molten 2% low
gelling temperature agarose (Type VII, A-4018, Sigma), which was
solidified by chilling, then chopped into small pieces (approximately
1 mm3). The sample pieces were post-fixed in 1% aqueous
osmium tetroxide for 2 h then, after buffer washes, dehydrated
through a series of ethanol solutions (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,
90, 3  100%). After the third change of 100% ethanol, the ethanol
was replaced with a 1:1 mix of 100% ethanol to LR White medium
grade resin and put on a rotator for 1 h. This was followed by a 1:2
and a 1:3 mix of 100% ethanol to LR White resin and finally 100%
resin, with at least 1 h between each change. The resinwas changed
twice more with fresh 100% resin with periods of at least
8 h between changes. The sample pieces were each transferred into
BEEM embedding capsules with fresh resin and polymerised
overnight at 60
C. Sections approximately 90 nm thick were cut
using an ultra-microtome (Ultracut E, Reichert-Jung) with a glass
knife, collected on formvar/carbon coated copper grids, and stained
sequentially with uranyl acetate and lead citrate. The sections were
examined and imaged in a FEI Tecnai G2 20 Twin transmission
electron microscope at 200 kV.
For SEM, each cell pellet was transferred onto the centre of a
small square of filter paper which had been folded into three equal
parts in both directions and then opened out. The filter paper was
then folded and inserted into a critical point drying capsule and
dehydrated in a series of ethanol solutions (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,
80, 90, 3  100%). Samples were dried in a Leica EM CPD300 Critical
Point Dryer using liquid carbon dioxide as the transition fluid. The
parcels were carefully unfolded in a clean plastic Petri dish and the
dry cells were mounted onto SEM stubs via sticky tabs by flicking
the back of the filter paper in the direction of the stub. The samples
were coated with gold in an Agar high resolution sputter-coater
apparatus. Scanning electron microscopy was carried out using a
Zeiss Supra 55 VP FEG SEM, operating at 3 kV.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

บริการสปอร์แบคทีเรียได้ถาวรใน 2.5% glutaraldehydeใน 0.1MPIPES (pH 7.4) บัฟเฟอร์ใน 1.5 ml ผลิตท่อสำหรับน้อย 2 h พักถูก centrifuged (5400 กรัม2 นาที) และ resuspended ใน 0.1 M ท่อ (pH 7.4) บัฟเฟอร์สามครั้งหลังจาก centrifugation สุดท้าย บัฟเฟอร์ถูกเอาออกจากการเม็ดสำหรับยการ ขี้เซลล์ถูกผสม 1:1 หลอมเหลว 2% ต่ำสุดagarose อุณหภูมิ gelling (ชนิด VII, A-4018 ซิก), ซึ่งเป็นหล่อ โดยถือ แล้ว สับเป็นชิ้นเล็ก ๆ (ประมาณ1 mm3) ชิ้นส่วนตัวอย่างถูกหลังคงอควี% 1ออสเมียมเทโตรไซด์สำหรับ 2 h แล้ว หลังจากบัฟเฟอร์ต่อผิวหน้า อบแห้งผ่านชุดของเอทานอลโซลูชั่น (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 8090, 3 100%) หลังจากการเปลี่ยนแปลง 100% เอทานอล เอทานอลสามถูกแทนที่ ด้วยเอทานอล 100% LR ขาวปานกลางผสม 1:1เกรดยาง และใส่ในตัวหมุนสำหรับ 1 h นี้ถูกตาม ด้วย 1:2และ 1:3 ผสมเอทานอล 100% ยางขาว LR และสุดท้าย 100%เรซิ่น มีอย่างน้อย 1 ชั่วโมงระหว่างการเปลี่ยนแปลง Resinwas ที่เปลี่ยนแปลงสองสด 100% เพิ่มเติม resin ด้วยเวลาน้อยh 8 ระหว่างการเปลี่ยนแปลง ชิ้นตัวอย่างแต่ละโอนเข้าBEEM ฝังแคปซูล ด้วยเรซินสด และ polymerisedค้างคืนที่ 60 C. ส่วนประมาณ 90 nm หนาถูกตัดมีอัลตร้า-microtome (Ultracut E, Reichert Jung) ด้วยแก้วมีด รวบรวมบนกริดทองแดง formvar/คาร์บอน เคลือบ และสีตามลำดับ ด้วย uranyl acetate และตะกั่วซิเต ส่วนถูกตรวจสอบ และ imaged ในส่งหุย Tecnai G2 20 คู่กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนที่ 200 kVสำหรับ SEM เม็ดแต่ละเซลล์มีการโอนย้ายไปยังศูนย์กลางของการสี่เหลี่ยมเล็ก ๆ ของกระดาษกรองที่มีการพับเป็นสามเท่าส่วนในทั้งสองทิศทาง และจากนั้น เปิดออก กระดาษกรองได้พับ แล้วใส่เข้าไปในจุดสำคัญแห้งแคปซูล และอบแห้งในชุดโซลูชั่นของเอทานอล (10, 20, 30, 40, 50, 60, 7080, 90, 3 100%) ตัวอย่างที่แห้งในการไล EM CPD300 สำคัญชี้เป่าโดยใช้คาร์บอนไดออกไซด์เหลวเป็นของเหลวเปลี่ยน ที่หีบห่อถูกกางออกอย่างระมัดระวังในจานเพาะเชื้อพลาสติกสะอาดและเซลล์แห้งถูกติดตั้งลงใน SEM สตับผ่านแท็บเหนียว โดย flickingด้านหลังของกระดาษกรองในทิศทางของขั้ว ตัวอย่างถูกเคลือบ ด้วยทองมี Agar ความละเอียดสูง sputter-coaterเครื่องมือการ การสแกน microscopy อิเล็กตรอนถูกดำเนินการโดยใช้การZeiss Supra 55 VP FEG SEM ปฏิบัติการที่ 3 kV

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

แขวนลอยสปอร์ของเชื้อแบคทีเรียได้รับการแก้ไขใน glutaraldehyde 2.5%
ใน 0.1MPIPES (pH 7.4) buffer ใน 1.5ml
หลอดโพรพิลีนสำหรับอย่างน้อย2 ชั่วโมง สารแขวนลอยถูกหมุนเหวี่ยง (5400 กรัม?
2 นาที) และ resuspended ใน 0.1 M ท่อ (pH 7.4) buffer สามครั้ง. หลังจากที่ปั่นสุดท้ายบัฟเฟอร์จะถูกลบออกที่จะออกจากเม็ด. สำหรับ TEM เม็ดเซลล์ถูกผสม 1: 1 หลอมเหลว 2% ต่ำอุณหภูมิก่อเจลagarose (ชนิดปกเกล้าเจ้าอยู่หัว, A-4018, ซิก) ซึ่งได้รับการเสริมความมั่นคงโดยหนาวแล้วสับเป็นชิ้นเล็กๆ (ประมาณ1 mm3) ชิ้นตัวอย่างที่ได้รับการโพสต์การแก้ไขใน 1% น้ำtetroxide ออสเมียมเป็นเวลา 2 ชั่วโมงแล้วหลังจากที่ล้างบัฟเฟอร์แห้งผ่านชุดของการแก้ปัญหาเอทานอล(10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 3 หรือไม่? 100%) หลังจากที่การเปลี่ยนแปลงในสามของเอทานอล 100% เอทานอลถูกแทนที่ด้วย1: 1 ผสมเอทานอล 100% ถึงปานกลาง LR สีขาวเม็ดพลาสติกเกรดและวางบนกระสวยสำหรับ1 ชั่วโมง นี้ตามมาด้วย 1: 2 และ 1: 3 ผสมเอทานอล 100% เป็นเรซิน LR สีขาวและในที่สุดก็ 100% เรซินที่มีอย่างน้อย 1 ชั่วโมงระหว่างการเปลี่ยนแปลงในแต่ละ resinwas มีการเปลี่ยนแปลงอีกครั้งกับเรซินสด100% มีระยะเวลาอย่างน้อย8 ชั่วโมงระหว่างการเปลี่ยนแปลง ชิ้นตัวอย่างแต่ละคนโอนเข้าBEEM แคปซูลฝังด้วยเรซินสดและ polymerised ค้างคืนที่ 60 องศาเซลเซียส ส่วนประมาณ 90 นาโนเมตรหนาถูกตัดโดยใช้อัลตร้าmicrotome (Ultracut E, แชร์จัง) กับแก้วมีดที่รวบรวมไว้ในformvar / คาร์บอนเคลือบกริดทองแดงและสีตามลำดับด้วยอะซิเตทuranyl และนำซิเตรต ส่วนที่ได้รับการตรวจสอบและถ่ายภาพในเฟ Tecnai G2 20 ส่งคู่กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนที่200 kV. สำหรับ SEM เม็ดแต่ละเซลล์ถูกโอนไปยังศูนย์กลางของตารางเล็กๆ ของกระดาษกรองซึ่งได้รับการพับเป็นสามเท่ากันส่วนในทั้งสองทิศทางและแล้วเปิดออก กระดาษกรองพับแล้วใส่เข้าไปในจุดที่สำคัญแคปซูลการอบแห้งและขาดน้ำในซีรีส์ของการแก้ปัญหาเอทานอล(10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 3 หรือไม่? 100%) ตัวอย่างแห้งใน Leica EM CPD300 สำคัญจุดโดยใช้เครื่องเป่าก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์เหลวเป็นน้ำเปลี่ยนแปลง พัสดุถูกกางออกอย่างระมัดระวังในการทำความสะอาดพลาสติกจานเลี้ยงเชื้อและเซลล์แห้งถูกติดตั้งลงบนต้นขั้ว SEM ผ่านทางแท็บเหนียวโดย flicking หลังของกระดาษกรองในทิศทางของต้นขั้วที่ กลุ่มตัวอย่างที่ถูกเคลือบด้วยทองในความละเอียดสูงวุ้นปะทุ-Coater อุปกรณ์ กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนสแกนได้ดำเนินการโดยใช้Zeiss Supra 55 VP FEG SEM, การดำเนินงานที่ 3 กิโลโวลต์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สารแขวนลอยสปอร์ของแบคทีเรียมีคงที่ 2.5% glutaraldehyde ใน 0.1mpipes
( pH 7.4 ) บัฟเฟอร์ในท่อโพลิโพรพิลีน 1.5ml สำหรับ
อย่างน้อย 2 ชั่วโมง ช่วงล่างเป็นระดับ ( 5 , 400  G ,
2 นาที ) และ resuspended ใน 0.1 M ท่อ ( pH 7.4 ) บัฟเฟอร์สามครั้ง .
หลังจากปั่นสุดท้าย บัฟเฟอร์ ถูกทิ้ง

แบบเม็ด สำหรับ มือถือ เม็ดผสม 1 : 1 กับ 2 % ต่ำ
หล่อgelling , อุณหภูมิ ( ประเภท vii , a-4018 , Sigma ) ซึ่ง
ก้อนหล่อแข็ง โดยถือ แล้วสับเป็นชิ้นเล็กๆ ( ประมาณ
1 มม. ) ตัวอย่างชิ้นถูกโพสต์คงที่ในสารละลาย 1 %
2 H tetroxide ออสเมียมแล้วหลังจากล้างบัฟเฟอร์แห้ง
ผ่านชุดของโซลูชั่นเอทานอล ( 10 , 20 , 30 , 40 , 50 , 60 , 70 , 80 , 90
3  100% ) หลังจากเปลี่ยนสามของเอทานอล 100 เปอร์เซ็นต์ เอทานอล
ถูกแทนที่ด้วยอัตราส่วนผสมของเอทานอล 100 % ใน LR สีขาวขนาดกลาง
เกรดเรซิน และ ใส่ในเบ้า 1 ชั่วโมง นี้ตามด้วย 1 : 2 และ 1 : 3
ผสมเอทานอล 100 % ใน LR สีขาวเรซินและสุดท้าย 100%
เรซิ่น มีอย่างน้อย 1 ชั่วโมงในแต่ละช่วงการเปลี่ยนแปลง การ resinwas เปลี่ยน
อีกสองครั้งด้วยเรซิน 100% สดระยะเวลาอย่างน้อย
8 H ระหว่างการเปลี่ยนแปลง ตัวอย่างแต่ละชิ้นถูกโอนเข้ามา
9 การฝังแคปซูลด้วยเรซินสด และ polymerised
ค้างคืนที่ 60
C ส่วนประมาณ 90 nm หนาถูกตัด
ใช้ Ultra เครื่องตัดชิ้นเนื้อ ( ultracut E ไรเคิร์ตจอง ) กับมีดแก้ว
, เก็บใน formvar / คาร์บอนผสมทองแดงเคลือบและสีตามลำดับกับยูเรนิลและตะกั่วอะซิเตท
ซิเตรต . ส่วนที่เป็น
ตรวจสอบและอื่นๆในเฟย tecnai G2
20 คู่ ส่งกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนที่ 200 KV .
สำหรับ SEM , แต่ละเซลล์เม็ดถูกย้ายไปยังศูนย์กลางของ
สี่เหลี่ยมเล็กของกรองกระดาษที่ถูกพับเป็นสามส่วนเท่ากัน
ในทั้งสองทิศทาง แล้วเปิดประตูออกไป เครื่องกรองกระดาษ
แล้วพับและแทรกลงในจุดวิกฤตและแคปซูล
แห้งในชุดของโซลูชั่นเอทานอลแห้ง ( 10 , 20 , 30 , 40 , 50 , 60 , 70 ,
80 , 90 , 3  100% )ตัวอย่างแห้งในไลก้าเอ็ม cpd300 วิกฤต
จุดแห้งโดยใช้คาร์บอนไดออกไซด์เหลว เช่น เปลี่ยนของเหลว
หีบห่อเป็นอย่างสะอาด ในห่อพลาสติกจานเพาะเชื้อและ
เซลล์แห้งติดบน SEM ตอผ่านแท็บเหนียวโดย flicking
ด้านหลังของกรองกระดาษในทิศทางของต้นขั้ว ตัวอย่าง
ถูกเคลือบด้วยทองในความละเอียดสูงละล่ำละลัก coater
วุ้นอุปกรณ์ กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด พบการใช้
Zeiss Supra 55 VP FEG SEM , ปฏิบัติการที่ 3 KV .