For depuration assays, oysters were

For depuration assays, oysters were sampled prior to the HS shock treatment, following the temperature treatment, and up to 48 h of depuration. The exposure isolates correspond to sampling animals immediately after the 18 h exposure bath. The post HS isolates correspond to animals coming out of either the 18 °C (ambient) or 37 °C (sub-lethal HS) exposure. The remaining time points are during the depuration phase. At each time point, four V. parahaemolyticus contaminated oysters and two uncontaminated controls were individually sampled from each treatment group. Animals was sprayed with 70% ethanol, aseptically shucked, sampled for hemolymph and then homogenized. For hemolymph collection, a 20 g needle and 1 ml syringe were used and hemolymph was collected from the pericardial cavity through the adductor muscle and 10-fold serial dilutions were performed for bacterial enumeration. For the whole oyster homogenate, after hemolymph was collected, the oyster meat plus liquor were weighed and diluted 1:3 with sterile ASW. The mixtures were homogenized in a laboratory blender (Waring Laboratory, Torrington, CT) for 1 min and 10-fold serial dilutions performed to enumerate bacteria present in the homogenate. The hemolymph and whole oyster homogenates from the natural microbiota animals were plated on TSA 2% and TCBS (Vibrio selective media) plates while the V. parahaemolyticus exposed animals were plated on TSA 2% streptomycin and incubated at 37 °C for 18 h. The TSA 2% isolates will enumerate the total aerobic bacterial population present while the TCBS will select for Vibrio species. The amount of bacteria in the oyster tissues is presented as log CFU/g of oyster tissue while in the hemolymph it is presented as log CFU/ml of hemolymph.

The hemocyte assay methods used were modifications of what has been previously described (Duperthuy et al., 2011, Harris-Young et al., 1993 and Zampini et al., 2003). Briefly, hemolymph was collected from 24 animals and pooled on ice to prevent aggregation. To enumerate hemocytes, hemolymph was mixed 1:1 with 0.4% Trypan Blue and the concentration of hemocytes per ml of hemolymph was determined using the Neubauer hemocytometer. Approximately 106 hemocyte cells were added to each well of a 48 well tissue culture plate (Falcon) and set for 30 min at 18 °C to form an adherent monolayer. Wells containing settled hemocytes were gently washed three times with sterile artificial seawater (ASW). Extra hemolymph was collected and spun for 300 × g for 15 min at 4 °C to pellet hemocytes. The cell-free hemolymph was filter sterilized with a .2 um filter (Millipore). The V. parahaemolyticus strain mixture were resuspended in sterile, cell free hemolymph prior to exposure to the hemocyte monolayer and 10-fold serial dilutions were performed to enumerate the starting amount of bacteria (CFU/ml). Hemocyte monolayers were exposed to approximately 106 CFU of V. parahaemolyticus cells. Uninfected control monolayers received an equivalent volume of sterile, cell free hemolymph. Additionally, an equivalent volume of V. parahaemolyticus resuspended in sterile hemolymph was added to empty wells to measure changes in CFU/ml resulting from hemolymph exposure alone. Plates were gently spun at 850 rpm for 5 min and incubated at 18 °C (control) or 37 °C (HS) for 2 h, followed by 2 h at 18 °C. Hemocyte monolayers were sampled at the 2 h and 4 h time points to enumerate the amount of V. parahaemolyticus present. At each time point, the monolayer supernatants were collected and cold DI water was added to the well with slight agitation for 10 min to disrupt the monolayer. After disruption, the DI water mixture was collected, combined with the supernatants for 10-fold serial dilutions. The wells containing V. parahaemolyticus were plated on TSA 2% streptomycin while the uninfected control monolayers were plates on TSA 2%. The concentration of V. parahaemolyticus recovered in the hemocyte assays are presented as LOG CFU/ml.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สำหรับการตรวจ depuration หอยนางรมเก็บตัวอย่างก่อนที่จะมีช็อต hs, ต่อไปนี้การรักษาอุณหภูมิและถึง 48 ชั่วโมง depuration สัมผัสแยกสอดคล้องกับสัตว์สุ่มตัวอย่างทันทีหลังจากที่อาบน้ำสัมผัส 18 ชั่วโมง โพสต์ HS แยกสอดคล้องกับสัตว์ที่ออกมาจากทั้ง 18 °สัมผัส C (รอบ) หรือ 37 ° C (ย่อยตาย HS)จุดเวลาที่เหลืออยู่ในระหว่างขั้นตอน depuration ที่จุดในแต่ละครั้งที่สี่โวลหอยนางรมปนเปื้อน parahaemolyticus และควบคุมทั้งสองโสโครกทำการเก็บตัวอย่างจากแต่ละกลุ่มการรักษาแต่ละ สัตว์ที่ถูกพ่นด้วยเอทานอล 70% shucked ปลอดเชื้อ, เก็บตัวอย่างเลือดและหดหายแล้ว ในการเก็บรวบรวมเลือด,20 เข็มกรัมและ 1 เข็มฉีดยา มล. ถูกนำมาใช้และถูกเก็บรวบรวมเลือดจากช่องเยื่อผ่าน adductor กล้ามเนื้อและ 10 เท่าเจือจางอนุกรมได้ดำเนินการนับเชื้อแบคทีเรีย สำหรับบดหอยนางรมทั้งหลังจากเลือดถูกเก็บรวบรวมเนื้อหอยนางรมใส่เหล้าถูกชั่งน้ำหนักและเจือจาง 1:03 กับหมัน ASWผสมถูกหดหายในห้องปฏิบัติการเครื่องปั่น (Waring ห้องปฏิบัติการ, ทอร์ริง ct) เป็นเวลา 1 นาทีและ 10 เท่าเจือจางอนุกรมดำเนินการเพื่อระบุเชื้อแบคทีเรียที่มีอยู่ในบด เลือดและ homogenates หอยนางรมทั้งหมดจากสัตว์ microbiota ธรรมชาติถูกชุบเมื่อ tsa 2% และ TCBS แผ่น (Vibrio เลือกสื่อ) ในขณะที่โวลต์สัตว์สัมผัส parahaemolyticus ถูกชุบกับ streptomycin 2% tsa และบ่มที่อุณหภูมิ 37 ° C เป็นเวลา 18 ชั่วโมง tsa เชื้อ 2% จะแจกแจงทั้งหมดปัจจุบันประชากรแบคทีเรียแอโรบิกในขณะที่ TCBS จะเลือกชนิดวิบริโอ ปริมาณของแบคทีเรียในเนื้อเยื่อของหอยนางรมจะนำเสนอเป็น log CFU / g ของเนื้อเยื่อหอยนางรมในขณะที่เลือดจะนำเสนอตาม log CFU / มล. ของเลือด.

วิธีการทดสอบเม็ดเลือดใช้คือการปรับเปลี่ยนของสิ่งที่ได้รับการอธิบายก่อนหน้านี้ (duperthuy et al. 2011, แฮร์ริส-young, et al., 1993 และ zampini et al., 2003) ชั่วครู่เลือดถูกเก็บรวบรวมจาก 24 สัตว์และ pooled บนน้ำแข็งเพื่อป้องกันการรวมตัว ให้ระบุเม็ดเลือด, เลือดผสม 1:01 กับ 04% trypan สีฟ้าและความเข้มข้นของเม็ดเลือดต่อมิลลิลิตรของเลือดที่ได้รับการคำนวณโดยใช้ Neubauer hemocytometer ประมาณ 106 เซลล์เม็ดเลือดที่ถูกเพิ่มเข้ากันดีของ 48 จานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อได้ดี (เหยี่ยว) แต่ละคนและการตั้งค่าสำหรับ 30 นาทีที่ 18 ° C ถึงรูปแบบ monolayer สานุศิษย์ หลุมที่มีเม็ดเลือดตัดสินถูกล้างเบา ๆ สามครั้งด้วยน้ำทะเลเทียมที่ผ่านการฆ่าเชื้อ (ASW)เลือดพิเศษถูกเก็บรวบรวมและหมุนได้ 300 × g เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 ° C ถึงเม็ดเลือดเม็ด เลือดเซลล์ฟรีได้ผ่านการฆ่าเชื้อด้วยการกรอง 0.2 ไมครอนกรอง (Millipore) โวลต์ผสมสายพันธุ์ parahaemolyticus ถูก resuspended ในการฆ่าเชื้อ,เซลล์ในเลือดฟรีก่อนที่จะมีการสัมผัสกับ monolayer เม็ดเลือดและ 10 เท่าเจือจางอนุกรมได้ดำเนินการให้ระบุจำนวนเงินที่เริ่มต้นของแบคทีเรีย (CFU / ml) monolayers เม็ดเลือดได้สัมผัสกับประมาณ 106 โคโลนีของโวลต์เซลล์ parahaemolyticus monolayers การควบคุมที่ไม่ติดเชื้อที่ได้รับปริมาณที่เท่าเทียมกันของการฆ่าเชื้อในเลือดฟรีเซลล์ นอกจากนี้ปริมาณเทียบเท่าจากโวลต์parahaemolyticus resuspended ในเลือดเป็นหมันถูกบันทึกอยู่ในหลุมที่ว่างเปล่าในการวัดการเปลี่ยนแปลงใน CFU / ml ที่เกิดจากการสัมผัสเลือดเพียงอย่างเดียว แผ่นกำลังหมุนเบา ๆ ที่ 850 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาทีและบ่มที่อุณหภูมิ 18 ° C (ควบคุม) หรือ 37 ° C (HS) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงตามด้วยเวลา 2 ชั่วโมงที่ 18 ° C monolayers เม็ดเลือดเก็บตัวอย่างที่ 2 ชั่วโมงและ 4 ชั่วโมงจุดเวลาที่จะระบุปริมาณของเชื้อ V. parahaemolyticus ปัจจุบันที่จุดในแต่ละครั้ง supernatants monolayer ถูกเก็บรวบรวมและน้ำเย็น di ถูกบันทึกอยู่กันด้วยความตื่นเต้นเล็กน้อยเป็นเวลา 10 นาทีที่จะทำลาย monolayer หลังจากที่หยุดชะงักน้ำผสม di ถูกเก็บรวมกับ supernatants สำหรับเจือจางอนุกรม 10 เท่า หลุมที่มีโวลต์parahaemolyticus ถูกชุบกับ streptomycin 2% tsa ในขณะที่การนำไปควบคุมที่ไม่ติดเชื้อเป็นแผ่นเมื่อ tsa 2% ความเข้มข้นของเชื้อ V. parahaemolyticus กู้คืนในการตรวจวิเคราะห์เม็ดเลือดจะถูกนำเสนอตาม log CFU / ml

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สำหรับ depuration assays หอยนางรมมีความก่อนรักษาช็อค HS รักษาอุณหภูมิ ต่อไปนี้ และขึ้นอยู่กับ h 48 ของ depuration Isolates แสงตรงไปสุ่มตัวอย่างสัตว์ทันทีหลังจากอาบน้ำแสง 18 h Isolates HS ลงตรงกับสัตว์ที่มาจาก 18 ° C (ล้อม) หรือแสง 37 ° C (HS ย่อยยุทธภัณฑ์) สถานเวลาที่เหลืออยู่ระหว่างขั้นตอน depuration ในแต่ละจุดของเวลา 4 V. parahaemolyticus ปนเปื้อนหอยนางรม และควบคุมสองดื่มได้ทีละตัวอย่างจากแต่ละกลุ่มการรักษา สัตว์ฉีดพ่น ด้วย 70% เอทานอล aseptically shucked ตัวอย่างสำหรับ hemolymph และ homogenized แล้ว สำหรับคอลเลกชัน hemolymph ใช้ 20 g เข็มและเข็มฉีดยา 1 ml และ hemolymph รวบรวมจากช่อง pericardial ผ่านกล้าม adductor และ dilutions 10-fold ประจำดำเนินการแจงนับแบคทีเรีย หลังสำหรับหอยนางรมทั้ง homogenate จาก hemolymph รวบรวม เนื้อหอยนางรมพร้อมเหล้าได้ชั่งน้ำหนัก แล้วผสม 1:3 ด้วย ASW กอซ น้ำยาผสมจะถูก homogenized ในเบลนเดอร์ห้องปฏิบัติการ (ปฏิบัติการ Waring, Torrington, CT) 1 นาทีและ 10-fold dilutions ประจำดำเนินการระบุเชื้อแบคทีเรียที่อยู่ใน homogenate Hemolymph และหอยนางรมทั้ง homogenates จากสัตว์ธรรมชาติ microbiota ถูกชุบบน TSA แผ่น TCBS (ต่อใช้สื่อ) และ 2% ในขณะที่ V parahaemolyticus สัมผัสสัตว์ถูกชุบบน TSA streptomycin 2% และ incubated ที่ 37 ° C สำหรับ 18 h Isolates 2% TSA จะระบุแอโรบิกแบคทีเรียประชากรปัจจุบันในขณะ TCBS จะเลือกพันธุ์ต่อ จำนวนแบคทีเรียในเนื้อเยื่อหอยแสดงเป็นล็อก CFU/g ของเนื้อเยื่อหอยในขณะ hemolymph มันแสดงเป็น CFU/ml ของ hemolymph ล็อก

วิธีทดสอบ hemocyte ใช้ถูกปรับเปลี่ยนอะไรได้รับก่อนหน้านี้อธิบาย (Duperthuy et al., 2011 ห้องหนุ่มร้อยเอ็ด al., 1993 และ Zampini และ al., 2003) สั้น ๆ hemolymph ถูกรวบรวมจากสัตว์ 24 และทางถูกพูบนน้ำแข็งเพื่อป้องกันการรวม ระบุ hemocytes, hemolymph ถูกผสม 1:1 กับ 04% Trypan Blue และความเข้มข้นของ hemocytes ต่อ ml hemolymph ถูกกำหนดโดยใช้ Neubauer hemocytometer Hemocyte ประมาณ 106 เซลล์ถูกเพิ่มไปยังแต่ละดีของจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อดี 48 (เหยี่ยว) และตั้งใน 30 นาทีที่ 18 ° C เพื่อเป็น monolayer นฤมล บ่อประกอบด้วยแล้ว hemocytes ถูกล้างสามครั้งเบา ๆ ด้วยน้ำทะเลเทียมกอซ (ASW) Hemolymph เสริมถูกรวบรวม และปั่นสำหรับ 300 × g สำหรับ 15 นาทีที่ 4 ° C ถึง pellet hemocytes Hemolymph ฟรีเซลล์ถูกกรอง sterilized กับ 2 อุ่มกรอง (มาก) ส่วนผสมต้องใช้ V. parahaemolyticus มี resuspended ในกระบอก เซลล์ hemolymph ฟรีก่อนที่จะสัมผัสกับ hemocyte monolayer dilutions 10-fold ประจำดำเนินการแจงนับจำนวนแบคทีเรีย (CFU/ml) เริ่มต้น Hemocyte monolayers ได้สัมผัสประมาณ 106 CFU ของ V. parahaemolyticus เซลล์ ควบคุมเชื้อ monolayers ได้รับปริมาณเทียบเท่าของกอซ เซลล์ hemolymph ฟรี นอกจากนี้ การเทียบเท่าปริมาณของ V parahaemolyticus resuspended ในกอซ hemolymph ถูกเพิ่มเข้าไปบ่อว่างเพื่อวัดการเปลี่ยนแปลงใน CFU/ml ผลจาก hemolymph แสงเพียงอย่างเดียว จานเบา ๆ ที่ 850 รอบต่อนาทีสำหรับ 5 นาทีปั่น และ incubated ที่ 18 ° C (ระบบควบคุม) หรือ 37 ° C (HS) สำหรับ h 2 ตาม ด้วย h 2 ที่ 18 องศาเซลเซียส Hemocyte monolayers ได้ตัวอย่างที่ 2 h และ 4 h จุดเวลาระบุจำนวน V. parahaemolyticus ปัจจุบัน ในแต่ละจุดของเวลา monolayer supernatants ถูกเก็บรวบรวม และเพิ่มน้ำ DI จะดีมีอาการกังวลต่อเล็กน้อยสำหรับ 10 นาทีการรบกวนแบบ monolayer หลังจากทรัพย ผสมน้ำ DI รวบรวม รวมกับ supernatants สำหรับ dilutions 10-fold ประจำ บ่อที่ประกอบด้วย V parahaemolyticus ที่ชุบบน TSA streptomycin 2% ขณะ monolayers ควบคุมเชื้อ แผ่นบน TSA 2% ความเข้มข้นของ V. parahaemolyticus กู้ใน hemocyte แสดง assays เป็นล็อก CFU/ml

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สำหรับ assays depuration หอยนางรมเป็นตัวอย่างก่อนที่จะการบำบัดด้วยไฟฟ้า HS ที่ต่อไปนี้การรักษา อุณหภูมิ และได้ถึง 48 ชั่วโมงของ depuration ความเสี่ยงที่แยกซึ่งตรงกับสัตว์การสุ่มตัวอย่างในทันทีหลังจาก 18 ชั่วโมงที่ความเสี่ยงอ่างอาบน้ำ HS หลังที่แยกสอดคล้องกับสัตว์ต่างๆออกมาจากทั้งที่ความเสี่ยง C ( ภายนอก )หรือ 37 ° C ( HS Sub - ยิงประตู) 18 °จุดเวลาที่เหลืออยู่ในระหว่างขั้นตอน depuration ได้ ที่จุดในแต่ละครั้งทั้งสี่ V parahaemolyticus การปนเปื้อนและหอยนางรมสอง uncontaminated การควบคุมได้สุ่มตัวอย่างจากกลุ่มการรักษาแต่ละตัวได้ มีสัตว์ถูกพ่นด้วยเอทานอล 70% aseptically หอยนางรมแกะเปลือกตัวอย่างสำหรับ hemolymph แล้วสดพร่องมันเนยเป็น สำหรับคอลเลคชั่น hemolymphกระบอกฉีดน้ำ 20 กรัมเข็มและ 1 มล.ที่ได้ถูกนำมาใช้และ hemolymph ถูกเก็บรวบรวมจากรู pericardial ที่ผ่านการยืดกล้ามเนื้อต้นขาและกล้ามเนื้อ dilutions Serial 10 เท่านั้นดำเนินการสำหรับระบุเกิดจากเชื้อแบคทีเรีย สำหรับ homogenate หอยนางรมทั้งหมดหลังจาก hemolymph ถูกเก็บรวบรวมเนื้อหอยนางรมรวมถึงสุราได้ชั่งน้ำหนักและคำนวณ 1 : 3 มี ASW ฆ่าเชื้อขวดนมปั่นส่วนผสมที่สดพร่องมันเนยเป็นคนในห้องปฏิบัติการเครื่องปั่น( waring ห้องปฏิบัติการ torrington CT )สำหรับ 1 นาทีและ dilutions Serial 10 - พับทำให้แบคทีเรียระบุใน homogenate ได้ homogenates hemolymph หอยนางรมและทั้งหมดจากสัตว์ microbiota ธรรมชาติที่เป็นตัวเสียบเคลือบทองบน TSA 2% และ tcbs (มีเดียสรรหา vibrio )แผ่นทำความร้อนในขณะที่ Vสัตว์ parahaemolyticus เผยเป็นตัวเสียบเคลือบทองในยาซทเรพโทะไม - ซิน 2% TSA และ incubated ใน C 37 °สำหรับ 18 ชั่วโมง TSA 2% ที่แยกจะระบุในปัจจุบันจำนวนประชากรเกิดจากเชื้อแบคทีเรียแอโรบิกรวมในขณะที่ tcbs จะเลือกสำหรับสายพันธุ์ vibrio จำนวนเงินของแบคทีเรียในเนื้อเยื่อหอยนางรมที่ได้รับการเสนอเป็น G CFU ,/ล็อกของเนื้อเยื่อ hemolymph หอยนางรมในขณะที่อยู่ในที่ได้รับการนำเสนอเป็นมล. CFU ,/ล็อกของ hemolymph .

วิธีการสอบ hemocyte ที่ใช้เป็นการปรับเปลี่ยนอะไรบ้างที่ได้รับมาก่อนอธิบายไว้( duperthuy et al . 2011 harris-young et al . 1993 และ zampini et al . 2003 ) เป็นเวลาสั้นๆ hemolymph ถูกเก็บรวบรวมจาก 24 กลุ่มและสัตว์บนน้ำแข็งเพื่อป้องกันไม่ให้การผนวกรวม ในการระบุ hemocytes hemolymph เป็นแบบผสม 1 : 1 พร้อมด้วย 0trypan สีฟ้า 4% และความเข้มข้นของ hemocytes ต่อมิลลิลิตร hemolymph ตั้งใจไว้แล้วว่าการใช้ hemocytometer neubauer ได้ ประมาณ 106 เซลล์ hemocyte ได้เพิ่มเข้ามาเพื่อเป็นอย่างดีแต่ละห้องของแผ่นวัฒนธรรม 48 รวมถึงเนื้อเยื่อ( Black Falcon )และตั้งค่าสำหรับ 30 นาทีที่ 18 ° C เพื่อให้เป็นรูปแบบกลุ่ม ผลิตภัณฑ์ กลุ่ม ภาคี hemocytes ไปตั้งรกรากอยู่ที่มีบ่อหินสามครั้งฆ่าเชื้อขวดนมด้วยน้ำทะเลเทียม( ASW )อย่างนุ่มนวลhemolymph พิเศษถูกเก็บรวบรวมและปั่นสำหรับ 300 × g สำหรับ 15 นาทีที่ C 4 ° C เพื่อให้เป็น hemocytes เม็ด แผ่นกรองเซลล์ - แบบไม่เสียค่าบริการ hemolymph เป็นที่ฆ่าเชื้อได้พร้อมด้วย 2 .แผ่นกรอง( millipore ) การผสมผสานกันระหว่างความเมื่อยล้า parahaemolyticus V ที่อยู่ในขวดนมปราศจากเชื้อ resuspendedhemolymph แบบไม่เสียค่าบริการบริการข้อมูลของสถานีฐานก่อนที่จะสัมผัสกับกลุ่ม ผลิตภัณฑ์ กลุ่ม hemocyte และ dilutions Serial 10 - พับได้ทำการระบุจำนวนเงินเริ่มต้นที่ได้ของแบคทีเรีย(มล. CFU ,/) monolayers hemocyte ได้รับประมาณ 106 CFU ,ของเซลล์ parahaemolyticus V monolayers uninfected ได้รับการควบคุมระดับเสียงเทียบเท่ากับที่ฆ่าเชื้อขวดนมของ hemolymph แบบไม่เสียค่าบริการบริการข้อมูลของสถานีฐาน นอกจากนี้ระดับเสียงหรือเทียบเท่าของ Vresuspended parahaemolyticus ใน hemolymph ฆ่าเชื้อขวดนมได้ถูกเพิ่มลงในบ่อว่างในการวัดความเปลี่ยนแปลงในมล. CFU ,/เป็นผลมาจากการรับแสง hemolymph ตามลำพัง แผ่นความร้อนมีปั่นที่ 850 รอบต่อนาทีสำหรับ 5 นาทีและ incubated ที่ 18 ° C (ควบคุม)หรือ 37 ° C ( HS )สำหรับ 2 ชั่วโมงตามด้วย 2 ชั่วโมงที่ 18 ° C อย่างนุ่มนวล monolayers hemocyte เป็นตัวอย่างที่จุด 2 H และ 4 H เวลาที่จะระบุจำนวนเงินของ parahaemolyticus V ปัจจุบันที่จุดในแต่ละครั้ง supernatants กลุ่ม ผลิตภัณฑ์ กลุ่มที่ได้จากการเก็บข้อมูลและน้ำเย็นดีได้ถูกเพิ่มลงในการเป็นอย่างดีพร้อมด้วยความรู้สึกที่เพียงเล็กน้อยสำหรับ 10 นาทีเพื่อไปถึงกลุ่ม ผลิตภัณฑ์ กลุ่มที่ก่อกวน หลังจากการหยุดชะงักการผสมผสานกันระหว่างน้ำดีที่ถูกเก็บรวบรวมมาผสมผสานกับ supernatants สำหรับ dilutions Serial 10 เท่า บ่อที่มี Vparahaemolyticus เป็นตัวเสียบเคลือบทองในยาซทเรพโทะไม - ซิน 2% TSA ในขณะที่ monolayers uninfected การควบคุมที่มีแผ่นความร้อนบน TSA 2% ความเข้มข้นของ parahaemolyticus V เริ่มฟื้นตัวใน assays hemocyte มาจัดแสดงที่ล็อกออนเข้าระบบ CFU ,/ ml .