Diversity and dynamics of antibioti

Diversity and dynamics of antibiotic-resistant bacteria in cheese as
determined by PCR denaturing gradient gel electrophoresis
Ana Belén Flórez ⁎, Baltasar Mayo
Departamento de Microbiología y Bioquímica, Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Paseo Río Linares, s/n, 33300-Villaviciosa, Asturias, Spain
article info abstract
Article history:
Received 6 April 2015
Received in revised form 14 July 2015
Accepted 20 July 2015
Available online 27 July 2015
Keywords:
Antibiotic resistance
Cheese
Denaturing gradient gel electrophoresis
DGGE
Lactic acid bacteria
Non-starter lactic acid bacteria
This work reports the composition and succession of tetracycline- and erythromycin-resistant bacterial communities
in a model cheese, monitored by polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis (PCRDGGE).
Bacterial 16S rRNA genes were examined using this technique to detect structural changes in the cheese
microbiota over manufacturing and ripening. Total bacterial genomic DNA, used as a template, was extracted
from cultivable bacteria grown without and with tetracycline or erythromycin (both at 25 μg ml−1
) on a nonselective
medium used for enumeration of total and viable cells (Plate Count agar with Milk; PCA-M), and
from those grown on selective and/or differential agar media used for counting various bacterial groups;
i.e., lactic acid bacteria (de Man, Rogosa and Sharpe agar; MRSA), micrococci and staphylococci (Baird–Parker
agar; BPA), and enterobacteria (Violet Red Bile Glucose agar; VRBGA). Large numbers of tetracycline- and
erythromycin-resistant bacteria were detected in cheese samples at all stages of ripening. Counts of antibioticresistant
bacteria varied widely depending on the microbial group and the point of sampling. In general, resistant
bacteria were 0.5–1.0 Log10 units fewer in number than the corresponding susceptible bacteria. The PCR-DGGE
profiles obtained with DNA isolated from the plates for total bacteria and the different bacterial groups suggested
Escherichia coli, Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis and Staphylococcus spp. as the microbial types resistant to
both antibiotics tested. This study shows the suitability of the PCR-DGGE technique for rapidly identifying and
tracking antibiotic resistant populations in cheese and, by extension, in other foods.
© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction
Antibiotic resistance increases the cost of treatment of infections and
can be the cause of therapeutic failure (Andersson and Hughes, 2010).
The spread of antibiotic resistance to human and animal pathogens is
therefore of great concern. The food chain is thought to be one of the
main routes via which such resistance spreads (Rossi et al., 2014). The
transfer of genes from resistant to susceptible bacteria may occur during
food manufacture or during transit through the gastrointestinal tract
(Rossi et al., 2014; Gazzola et al., 2012). Fermented foods, such as
cheese, in which several bacterial types grow to high cell densities,
are key players in the transmission of antibiotic resistance between
beneficial/commensal and pathogenic bacteria (Nawaz et al., 2011).
Complex bacterial communities composed of the natural cheese microbiota
plus an array of environmental microorganisms develop and
change in fermented foods over time, particularly in starter-free, rawmilk
cheeses (Flórez and Mayo, 2006).
Cheeses made from raw milk have been reported to sometimes contain
high antibiotic resistance gene loads (Flórez et al., 2014; Manuzon
et al., 2007). The characterisation of the bacterial species involved via
conventional, culture-dependent analysis can, however, be difficult
due to the intrinsic limitations of this approach (it is time consuming,
expensive, and has a high manpower demand, etc.) (Devirgiliis et al.,
2013; Gazzola et al., 2012; Nawaz et al., 2011). To overcome this, a
number of culture-independent molecular methods have been developed
in recent decades, including conventional polymerase chain
reaction (PCR) and quantitative PCR (qPCR) amplification, temporal
temperature gel electrophoresis (TTGE), denaturing gradient gel electrophoresis
(DGGE), and the construction and analysis of metagenomic
libraries (Devirgiliis et al., 2014; Flórez et al., 2014; Manuzon et al.,
2007).
Since its first use in Microbial Ecology research in the early 90s
(Muyzer et al., 1993), DGGE analysis of rRNA-encoding genes amplified
by PCR (PCR-DGGE) has become a widely used tool for investigating the
microbial diversity of food ecosystems, including milk, cheese and other
dairy products [for recent reviews see Cocolin et al. (2013) and Quigley
et al. (2011)]. Given the source of the nucleic acids used in PCR-DGGE,
the technique can be performed in two ways: DNA or RNA can be extracted
directly from the food matrix (direct PCR-DGGE), or be purified
from cultivable bacteria harvested from non-selective and/or selective/
differential media (indirect PCR-DGGE). The technica

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ความหลากหลายและของแบคทีเรียดื้อยาปฏิชีวนะในชีเป็นกำหนด โดย PCR denaturing electrophoresis เจลไล่ระดับอานา Belén Flórez ⁎ ดูแลคริ MayoY Microbiología Departamento เด Bioquímica เด Instituto Productos Lácteos เดแอสทูเรียส (IPLA-CSIC), Linares รีโอเดลาป Paseo, s/n, 33300-Villaviciosa อัสตูเรียส สเปนบทความข้อมูลบทคัดย่อบทความประวัติ:ได้รับ 6 2015 เมษายนรับแบบฟอร์มที่ปรับปรุง 14 2015 กรกฎาคมยอมรับ 20 2015 กรกฎาคมมีออนไลน์ 27 2015 กรกฎาคมคำสำคัญ:ต้านทานยาปฏิชีวนะชีสDenaturing electrophoresis เจลไล่ระดับDGGEแบคทีเรียกรดแลกติกแบคทีเรียกรดแลกติกไม่สตาร์ทงานนี้รายงานองค์ประกอบและสืบทอดของชุมชนเตตราไซคลีน - และ erythromycin-ทนทานต่อแบคทีเรียในแบบจำลองชี ตรวจสอบปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส denaturing electrophoresis เจลไล่ระดับสี (PCRDGGE)ยีนจากแบคทีเรีย 16S rRNA ถูกตรวจสอบโดยใช้เทคนิคนี้ตรวจพบการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างในชีmicrobiota ผลิต และ ripening รวมแบคทีเรีย genomic DNA ใช้เป็นแม่แบบ ถูกสกัดจากเชื้อแบคทีเรีย cultivable โตมี และไม่ มีเตตราไซคลีนหรือ erythromycin (ทั้งที่ 25 μg ml−1) ในเป็น nonselectiveสื่อที่ใช้สำหรับการแจงนับเซลล์ทั้งหมด และทำงานได้ (agar จำนวนแผ่นกับนม PCA-M), และจากโตสื่อ agar เลือก และ/หรือส่วนที่ใช้สำหรับการนับกลุ่มแบคทีเรียต่าง ๆเช่น แบคทีเรียกรดแลกติก (เดอแมน Rogosa และ Sharpe agar MRSA), micrococci และ staphylococci (Baird – ปาร์คเกอร์agar BPA), และ enterobacteria (ม่วงแดงน้ำดีกลูโคส agar VRBGA) จำนวนมากของเตตราไซคลีน - และแบคทีเรียทนต่อ erythromycin พบในตัวอย่างชีที่ทุกขั้นตอนของ ripening นับจำนวนของ antibioticresistantแบคทีเรียแตกต่างกันอย่างกว้างขวางในกลุ่มจุลินทรีย์และจุดของการสุ่มตัวอย่าง ในทั่วไป ทนแบคทีเรียได้ 0.5 – 1.0 หน่วย Log10 น้อยจำนวนกว่าแบคทีเรียที่ไวต่อการสอดคล้องกัน PCR DGGEโพรไฟล์ได้ ด้วยดีเอ็นเอแยกต่างหากจากแผ่นสำหรับแบคทีเรียรวมและกลุ่มแบคทีเรียต่าง ๆ แนะนำEscherichia coli, Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis และ Staphylococcus โอเป็นชนิดจุลินทรีย์ที่ทนต่อยาปฏิชีวนะทั้งทดสอบ การศึกษานี้แสดงความเหมาะสมของเทคนิค PCR-DGGE สำหรับการระบุอย่างรวดเร็ว และติดตามประชากรดื้อยาปฏิชีวนะ ในชีส และ ขยาย อาหารอื่น ๆ© 2015 Elsevier b.v สงวนลิขสิทธิ์ทั้งหมด1. บทนำต้านทานยาปฏิชีวนะเพิ่มต้นทุนของการรักษาของการติดเชื้อ และสามารถเป็นสาเหตุของความล้มเหลวของยา (Andersson และฮิวจ์ส 2010)มีการแพร่กระจายของยาปฏิชีวนะทนต่อโรคของมนุษย์ และสัตว์ดังนั้นความกังวลมากขึ้น ห่วงโซ่อาหารเป็นความคิดที่เป็นหนึ่งในเส้นทางหลักที่ผ่านความต้านทานดังกล่าวแพร่กระจาย (Rossi et al., 2014) ที่โอนย้ายยีนจากทนต่อการไวต่อแบคทีเรียอาจเกิดขึ้นระหว่างผลิตอาหารหรือใน ระหว่างการขนส่งผ่านระบบทางเดิน(Rossi et al., 2014 Gazzola et al., 2012) หมักอาหาร เช่นชีส เชื้อแบคทีเรียหลายชนิดเติบโตให้เซลล์สูงความหนาแน่นมีผู้เล่นหลักในการส่งผ่านความต้านทานยาปฏิชีวนะระหว่างประโยชน์/commensal และ pathogenic แบคทีเรีย (Nawaz et al., 2011)ชุมชนซับซ้อนแบคทีเรียประกอบ microbiota ชีธรรมชาติบวกของจุลินทรีย์สิ่งแวดล้อมพัฒนา และเปลี่ยนแปลงในอาหารหมักเวลา โดยเฉพาะอย่างยิ่งในสตาร์ทฟรี rawmilkเนยแข็ง (Flórez และ Mayo, 2006)รายงานบางครั้งมีเนยแข็งที่ทำจากน้ำนมดิบยีนต้านทานยาปฏิชีวนะสูงโหลด (Flórez et al., 2014 Manuzonร้อยเอ็ด al., 2007) ตรวจลักษณะเฉพาะของชนิดแบคทีเรียที่เกี่ยวข้องผ่านทั่วไป ขึ้นอยู่ กับวัฒนธรรมวิเคราะห์ อย่างไรก็ตาม ได้ยากเนื่องจากข้อจำกัดของวิธีการนี้ (เป็นเวลานาน intrinsicราคาแพง และมีความต้องการกำลังคนสูง ฯลฯ .) (Devirgiliis et al.,2013 Gazzola et al., 2012 Nawaz et al., 2011) จะเอาชนะนี้ การจำนวนวิธีโมเลกุลอิสระวัฒนธรรมได้รับการพัฒนาในทศวรรษล่าสุด รวมทั้งห่วงโซ่พอลิเมอเรสแบบเดิมปฏิกิริยา (PCR) และขยาย PCR (qPCR) เชิงปริมาณ ขมับอุณหภูมิเจ electrophoresis (TTGE), denaturing electrophoresis เจลไล่ระดับ(DGGE), และการก่อสร้างและการวิเคราะห์ metagenomicไลบรารี (Devirgiliis et al., 2014 Flórez et al., 2014 Manuzon et al.,2007)ตั้งแต่การใช้ครั้งแรกงานวิจัยนิเวศวิทยาจุลินทรีย์ใน 90s ต้น(Muyzer et al., 1993), การวิเคราะห์ DGGE ของ rRNA เข้ารหัสขยายโดย PCR (PCR-DGGE) ได้กลายเป็น เครื่องมือที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการตรวจสอบการจุลินทรีย์ความหลากหลายของระบบนิเวศอาหาร นม เนยแข็ง และอื่น ๆนม [สำหรับรีวิวล่าดู Quigley และ Cocolin et al. (2013)et al. (2011)] กำหนดแหล่งที่มาของกรดนิวคลีอิกที่ใช้ PCR-DGGEเทคนิคสามารถทำได้สองวิธี: สามารถสกัดดีเอ็นเอหรืออาร์เอ็นเอโดยตรงจากอาหารเมตริกซ์ (ตรง PCR-DGGE), หรือจะบริสุทธิ์จากเก็บเกี่ยวผลผลิตจากการใช้ หรือไม่ใช้แบคทีเรีย cultivable /ส่วนสื่อ (อ้อม PCR-DGGE) การ technica

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ความหลากหลายและการเปลี่ยนแปลงของเชื้อแบคทีเรียที่ทนต่อยาปฏิชีวนะในชีสเป็นกำหนดโดยวิธี PCR denaturing ลาดเจลอิเลอานาBelén Florez ⁎, Baltasar เมโยแผนกเดจุลขีววิทยาy ที่Bioquímica, Instituto de Productos LACTEOS de Asturias (IPLA-CSIC) Paseo Ríoลีนา s / n , 33300-Villaviciosa, Asturias สเปนข้อมูลบทความนามธรรมประวัติศาสตร์บทความที่ได้รับ6 เมษายน 2015 ที่ได้รับในรูปแบบปรับปรุง 14 กรกฎาคม 2015 ได้รับการยอมรับ 20 กรกฎาคม 2015 มีจำหน่ายออนไลน์ 27 กรกฎาคม 2015 คำสำคัญ: ความต้านทานยาปฏิชีวนะชีสลาดdenaturing เจลอิเล็กDGGE แลคติกแบคทีเรียกรดไม่เริ่มต้นแบคทีเรียกรดแลคติกงานนี้รายงานองค์ประกอบและสืบทอด tetracycline- และ erythromycin ทนชุมชนแบคทีเรียในชีสรูปแบบการตรวจสอบโดยวิธีPolymerase chain reaction denaturing ข่าวคราวการไล่ระดับสี (PCRDGGE). แบคทีเรียยีน 16S rRNA มีการตรวจสอบการใช้เทคนิคนี้ในการตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง ในชีสmicrobiota มากกว่าการผลิตและการสุก รวมดีเอ็นเอของแบคทีเรียที่ใช้เป็นแม่แบบถูกสกัดจากแบคทีเรียที่เพาะปลูกปลูกโดยไม่ต้องและ tetracycline หรือ erythromycin (ทั้งที่ 25 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร-1) ใน nonselective กลางที่ใช้ในการนับของเซลล์รวมและที่ทำงาน (จานอาหารเลี้ยงเชื้อจำนวนด้วยนม; PCA-M) และจากผู้ที่ปลูกในการเลือกและ/ หรือความแตกต่างของสื่อวุ้นที่ใช้สำหรับการนับกลุ่มแบคทีเรียต่างๆเช่นแบคทีเรียกรดแลคติก(เดผู้ชาย, Rogosa และชาร์ปวุ้น; MRSA) micrococci กับเชื้อ (Baird-ปาร์กเกอร์วุ้น; BPA) และ enterobacteria (สีม่วงสีแดงน้ำดีกลูโคสวุ้น; VRBGA) จำนวนมาก tetracycline- และทนerythromycin แบคทีเรียที่ตรวจพบในตัวอย่างชีสทุกขั้นตอนของการทำให้สุก เคานต์แห่ง antibioticresistant แบคทีเรียต่าง ๆ กันขึ้นอยู่กับกลุ่มของจุลินทรีย์และจุดของการสุ่มตัวอย่าง โดยทั่วไปทนต่อเชื้อแบคทีเรียที่เป็น 0.5-1.0 log10 หน่วยจำนวนน้อยกว่าความไวต่อเชื้อแบคทีเรียที่สอดคล้องกัน PCR-DGGE โปรไฟล์ได้รับกับดีเอ็นเอที่แยกได้จากแผ่นสำหรับแบคทีเรียทั้งหมดและกลุ่มแบคทีเรียที่แตกต่างกันที่แนะนำเชื้อ Escherichia coli, Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis และ Staphylococcus spp ประเภทจุลินทรีย์ทนต่อยาปฏิชีวนะทั้งการทดสอบ การศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นถึงความเหมาะสมของเทคนิค PCR-DGGE อย่างรวดเร็วสำหรับการระบุและการติดตามประชากรทนยาปฏิชีวนะในชีสและโดยขยายในอาหารอื่นๆ . © 2015 Elsevier BV สงวนลิขสิทธิ์. 1 บทนำต้านทานยาปฏิชีวนะเพิ่มค่าใช้จ่ายของการรักษาโรคติดเชื้อและสามารถเป็นสาเหตุของความล้มเหลวในการรักษา(แอนเดอฮิวจ์ 2010). การแพร่กระจายของความต้านทานยาปฏิชีวนะในการก่อโรคของมนุษย์และสัตว์เป็นจึงกังวลมาก ห่วงโซ่อาหารที่คิดว่าจะเป็นหนึ่งในเส้นทางหลักผ่านทางซึ่งกระจายต้านทานเช่น (รอสซี et al., 2014) การถ่ายโอนยีนจากเชื้อแบคทีเรียที่ทนต่อความเสี่ยงที่อาจเกิดขึ้นระหว่างการผลิตอาหารหรือในระหว่างการขนส่งผ่านระบบทางเดินอาหาร(รอสซี et al, 2014;.. Gazzola et al, 2012) อาหารหมักดองเช่นชีสซึ่งในชนิดของเชื้อแบคทีเรียหลายเติบโตถึงความหนาแน่นของเซลล์สูงเป็นผู้เล่นที่สำคัญในการส่งผ่านของความต้านทานยาปฏิชีวนะระหว่างประโยชน์/ commensal และแบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรค (นาวาซ et al., 2011). ชุมชนแบคทีเรียคอมเพล็กซ์ประกอบด้วยธรรมชาติ microbiota ชีสบวกอาร์เรย์ของจุลินทรีย์สิ่งแวดล้อมการพัฒนาและการเปลี่ยนแปลงในอาหารหมักดองในช่วงเวลาโดยเฉพาะอย่างยิ่งในการเริ่มต้นฟรีrawmilk ชีส (Florez และมายอ 2006). ชีสที่ทำจากน้ำนมดิบมีรายงานว่าบางครั้งมีการโหลดยีนต้านทานยาปฏิชีวนะสูง ( Florez et al, 2014;. Manuzon et al, 2007). ลักษณะของสายพันธุ์แบคทีเรียที่เกี่ยวข้องผ่านทางธรรมดาวิเคราะห์วัฒนธรรมขึ้นอยู่กับสามารถแต่เป็นเรื่องยากเนื่องจากการข้อจำกัด ที่แท้จริงของวิธีนี้ (มันเป็นเวลานานมีราคาแพงและมีความต้องการกำลังคนสูงฯลฯ ) (Devirgiliis et al, ., 2013; Gazzola et al, 2012;. นาวาซ et al, 2011). ที่จะเอาชนะนี้จำนวนของวัฒนธรรมที่เป็นอิสระวิธีโมเลกุลได้รับการพัฒนาในทศวรรษที่ผ่านมารวมทั้งห่วงโซ่โพลิเมอร์ธรรมดาปฏิกิริยา(PCR) และเชิงปริมาณ PCR (qPCR) ขยายชั่วคราวข่าวคราวอุณหภูมิ(TTGE) denaturing ลาดข่าวคราว(DGGE) และการก่อสร้างและการวิเคราะห์ Metagenomic ห้องสมุด (Devirgiliis et al, 2014;.. Florez et al, 2014;. Manuzon, et al, 2007). ตั้งแต่ครั้งแรกที่ใช้ในการวิจัยจุลินทรีย์นิเวศวิทยาในช่วงต้นยุค 90. (Muyzer, et al, 1993) การวิเคราะห์ DGGE ของยีน rRNA เข้ารหัสขยายโดยวิธีPCR (PCR-DGGE) ได้กลายเป็นเครื่องมือที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการตรวจสอบความหลากหลายของระบบนิเวศของจุลินทรีย์อาหารรวมถึงนมชีสและอื่นๆผลิตภัณฑ์นม [สำหรับความคิดเห็นล่าสุดเห็น Cocolin et al, (2013) และควิกลีย์และอัล (2011)] ได้รับแหล่งที่มาของกรดนิวคลิอิกที่ใช้ในการ PCR-DGGE ที่เทคนิคสามารถดำเนินการในสองวิธีดีเอ็นเอหรืออาร์เอ็นเอสามารถสกัดโดยตรงจากเมทริกซ์อาหาร(ตรง PCR-DGGE) หรือจะบริสุทธิ์จากเชื้อแบคทีเรียที่เพาะปลูกเก็บเกี่ยวจากที่ไม่ใช่เลือกและ / หรือเลือก / สื่อที่แตกต่างกัน (ทางอ้อม PCR-DGGE) ทางด้านเทคนิค