DNA manipulations. A nonpathogenic

DNA manipulations. A nonpathogenic A. citrulli T3SS mutant
(AAC00-1ΔhrcC) was generated by deletion of the hrcC gene that
encodes the T3SS outer membrane pore (22). Briefly, a 3.6-kb
fragment containing the hrcC gene was identified in the genome
library of AAC00-1. The 3.6-kb fragment was digested from a
cosmid clone using BamHI (Promega Corp., Madison, WI), cloned
into pBluescript, and transformed into E. coli strain DH5α. In all,
673 bp were deleted from the cloned fragment by restriction digestion
with StuI and BstEII (Promega Corp.) and the fragment was
religated, resulting in deletion of the hrcC gene. The flanking open
reading frames, SAM methyl transferase and hrpD5, remained
unaffected. The deleted hrcC gene construct was cloned into the
suicide vector pOK1, which carries the levansucrase SacB gene, to
generate pOK-HRCC. pOK-HRCC was transformed into E. coli
strain S17-1 (λpir), which was mated with AAC00-1, and singlecrossover
transconjugants were selected based on resistance to
spectinomycin. A second homologous recombination was promoted
by growth on M9 agar plates containing sucrose, which
retards the growth of bacteria expressing SacB. Generation of the
deletion mutation was confirmed by polymerase chain reaction
(PCR) amplification using primers HrcC.for (5′-TGTATTTCT
ACCCGGGCAAGTCC-3′) and HrcC.rev (5′-TCCTCGATGTAG
AGACTCAGCTTG-3′). One hrcC deletion mutant, designated
AAC00-1ΔhrcC, was suitable for our studies. The hrcC deletion
mutant was complemented by subcloning the 3.6-kb BamHI fragment
containing the hrcC gene into the cosmid pUFR043 to produce
pUFR034-hrcC. pUFR043-hrcC was subsequently transformed
into E. coli S17-1 (λpir) for use in triparental mating.
pUFR043-hrcC was then transformed into AAC00-1ΔhrcC to create
AAC00-1ΔhrcCcomp (hrcC mutation complement).
Pathogenicity and HR assays. The effect of hrcC deletion on
the ability of A. citrulli to induce an HR was evaluated using 6-
week-old tobacco plants (Nicotiana tabacum). Using a hypodermic
syringe without a needle, AAC00-1, AAC00-1ΔhrcC, AAC00-
1ΔhrcCcomp at approximately 1 × 108 CFU/ml, or PBS was infiltrated
into the intercellular spaces between the major veins of a
fully expanded tobacco leaf. Plants were incubated under conditions
of approximately 75% relative humidity (RH), 28°C, and 12
h of fluorescent light daily in a growth chamber (Percival, Perry,
IA) for 2 days. Plants were subsequently observed for cell death
associated with a typical HR. To determine the effect of the T3SS
mutation on A. citrulli pathogenicity, 2-week-old watermelon seedlings
(‘Sugar Baby’) were infiltrated as described above with
AAC00-1ΔhrcC, AAC00-1ΔhrcCcomp AAC00-1 (wild-type) at
approximately 1 × 106 CFU/ml, or PBS as a negative control. The
cotyledons of three seedlings were inoculated (28) and plants were
incubated for 2 days at 28°C with approximately 75% RH and 12 h
of fluorescent light daily in a growth chamber. Plants were then
visually observed for BFB symptoms (necrosis and water soaking).
This experiment was conducted three times.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Manipulations ภาพดีเอ็นเอ Mutant nonpathogenic A. citrulli T3SS(AAC00 1ΔhrcC) ถูกสร้างขึ้น โดยการลบของยีน hrcC ที่จแมปรูเยื่อนอกของ T3SS (22) สั้น ๆ 3.6 kbส่วนที่ประกอบด้วยยีน hrcC ในกลุ่มที่ระบุไลบรารีของ AAC00-1 ส่วน 3.6 kb ถูกต้องจากการใช้ BamHI (Promega Corp. เมดิสัน WI), โคลน cosmid โคลนใน pBluescript และเปลี่ยนเป็น E. coli ต้องใช้ DH5α ทั้งหมด673 bp ได้ถูกลบออกจากส่วนโคลน โดยย่อยอาหารจำกัดStuI BstEII (Promega Corp.) และส่วนถูกreligated ในการลบของยีน hrcC เปิด flankingอ่านเฟรม SAM methyl transferase และ hrpD5 ยังคงผลกระทบ สร้างยีน hrcC ถูกลบถูกโคลนเป็นการฆ่าตัวตายแบบเวกเตอร์ pOK1 ซึ่งดำเนินการ levansucrase SacB ยีน การสร้างปก HRCC ปก HRCC ถูกเปลี่ยนเป็น E. coliสายพันธุ์ S17-1 (λpir), ซึ่งมี mated กับ AAC00-1, singlecrossovertransconjugants ได้เลือกตามความต้านทานต่อspectinomycin Recombination homologous ที่สองมีการเลื่อนขั้นโดยเติบโตบนแผ่น agar M9 ประกอบด้วยซูโครส ซึ่งretards เจริญเติบโตของแบคทีเรียที่กำลัง SacB รุ่นการลบการกลายพันธุ์ได้รับการยืนยัน โดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสขยาย (PCR) โดยใช้ไพรเมอร์ HrcC.for (5′-TGTATTTCTACCCGGGCAAGTCC-3′) และ HrcC.rev (5′-TCCTCGATGTAGAGACTCAGCTTG-3′) หนึ่ง hrcC ลบ mutant กำหนดAAC00-1ΔhrcC เหมาะสำหรับการศึกษาของเราได้ การลบ hrcCmutant ถูกตู้ subcloning ส่วน BamHI 3.6 kbประกอบด้วยยีน hrcC เป็น pUFR043 cosmid ผลิตpUFR034-hrcC pUFR043-hrcC ในเวลาต่อมาได้ถูกเปลี่ยนไปเข้าไปใน E. coli S17-1 (λpir) สำหรับใช้ในการผสมพันธุ์ triparentalpUFR043-hrcC มีแล้วเปลี่ยนเป็น AAC00-1ΔhrcC สร้างAAC00-1ΔhrcCcomp (hrcC การกลายพันธุ์ส่วนเติมเต็ม)Assays pathogenicity และ HR ผลของการลบ hrcC บนความสามารถของอ. citrulli ชวนชมได้ถูกประเมินโดยใช้ 6-พืชอายุสัปดาห์ยาสูบ (Nicotiana tabacum) โดยใช้การฉีดยาเข็ม โดยเข็ม AAC00-1, AAC00-1ΔhrcC, AAC00-1ΔhrcCcomp ที่ประมาณ 1 × 108 CFU/ml หรือ PBS ได้ถูกแทรกซึมลงในช่องว่าง intercellular ระหว่างเส้นเลือดสำคัญของการขยายทั้งหมดใบยา พืชมี incubated ภายใต้เงื่อนไขประมาณ 75% ความชื้นสัมพัทธ์ (RH), 28° C และ 12h ของแสงที่เรืองแสงทุกวันในการเจริญเติบโตของหอการค้า (Percival เพอร์รีIA) 2 วัน พืชได้มาสังเกตการตายของเซลล์เกี่ยวข้องกับทรัพยากรบุคคลทั่วไป การกำหนดผลของการ T3SSการกลายพันธุ์บน pathogenicity A. citrulli กล้าไม้แตงโมอายุ 2 สัปดาห์('ชูการ์เด็ก') ได้ถูกแทรกซึมตามที่อธิบายไว้ข้างต้นด้วยAAC00-1ΔhrcC, AAC00-1ΔhrcCcomp AAC00-1 (ป่าชนิด)ตาราง 1 ประมาณ 106 CFU/ml หรือ PBS เป็นตัวควบคุมค่าลบ ที่cotyledons ของกล้าไม้ที่สามถูก inoculated (28) และพืชได้incubated 2 วันที่ 28° C โดยประมาณ 75% RH และ 12 hเรืองแสงไฟทุกวันในหอเจริญเติบโต พืชได้แล้วสังเกตเห็นอาการอย่าง BFB (การตายเฉพาะส่วนและแช่น้ำ)การทดลองนี้ได้ดำเนินการครั้งที่ 3

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

กิจวัตรดีเอ็นเอ nonpathogenic เอ citrulli กลายพันธุ์ T3SS
(AAC00-1ΔhrcC) ถูกสร้างขึ้นโดยการลบของยีน hrcC
ที่เข้ารหัสเยื่อหุ้มด้านนอกT3SS รูขุมขน (22) สั้น ๆ เป็น 3.6
กิโลส่วนที่มียีนhrcC
ถูกระบุในจีโนมห้องสมุดAAC00-1 ส่วน 3.6
กิโลถูกย่อยจากโคลนcosmid ใช้ BamHI (Promega คอร์ป, Madison, WI)
โคลนเข้าไปในpBluescript และกลายเป็นอีโคไลสายพันธุ์DH5α ในทุก
673 bp ถูกลบออกจากส่วนโคลนโดยการย่อยอาหารข้อ จำกัด
ที่มี StuI และ BstEII (Promega คอร์ป) และส่วนที่ถูก
religated ผลในการลบของยีน hrcC ขนาบเปิดเฟรมอ่าน methyl transferase SAM และ hrpD5 ยังคงได้รับผลกระทบ ลบสร้างยีน hrcC เป็นโคลนเข้าไปในเวกเตอร์ฆ่าตัวตายpOK1 ซึ่งดำเนินการ levansucrase ยีน SacB เพื่อสร้างป๊อก-HRCC ป๊อก-HRCC ก็กลายเป็นเชื้อ E. coli สายพันธุ์ S17-1 (λpir) ซึ่งแต่งงานกับ AAC00-1 และ singlecrossover transconjugants ถูกเลือกขึ้นอยู่กับความต้านทานต่อการspectinomycin คล้ายคลึงกันรวมตัวกันอีกครั้งที่สองได้รับการเลื่อนจากการเติบโตในแปลง M9 แผ่นวุ้นที่มีน้ำตาลซูโครสซึ่ง retards เจริญเติบโตของแบคทีเรียแสดง SacB รุ่นของการกลายพันธุ์ได้รับการยืนยันการลบโดยวิธี Polymerase chain reaction (PCR) การขยายการใช้ไพรเมอร์ HrcC.for (5'-TGTATTTCT ACCCGGGCAAGTCC-3) และ HrcC.rev (5'-TCCTCGATGTAG AGACTCAGCTTG-3) หนึ่ง hrcC กลายพันธุ์ลบกำหนดAAC00-1ΔhrcCเป็นที่เหมาะสมสำหรับการศึกษาของเรา การลบ hrcC กลายพันธุ์ได้รับการเติมเต็มด้วย subcloning ส่วน BamHI 3.6 กิโลไบต์ที่มียีนhrcC เข้า pUFR043 cosmid ในการผลิตpUFR034-hrcC pUFR043-hrcC ถูกเปลี่ยนต่อมาเข้าสู่เชื้อE. coli S17-1 (λpir) เพื่อใช้ในการผสมพันธุ์ triparental. pUFR043-hrcC ถูกเปลี่ยนแล้วเป็นAAC00-1ΔhrcCเพื่อสร้างAAC00-1ΔhrcCcomp (hrcC การกลายพันธุ์ที่สมบูรณ์). การเกิดโรคและการตรวจการบริหารทรัพยากรบุคคล ผลของการลบ hrcC ในความสามารถของเอcitrulli เพื่อก่อให้เกิดทรัพยากรบุคคลได้รับการประเมินโดยใช้ 6 พืชยาสูบสัปดาห์อายุ (Nicotiana tabacum) ใช้ฉีดยาเข็มฉีดยาโดยไม่ต้องเข็ม, AAC00-1, AAC00-1ΔhrcC, AAC00- 1ΔhrcCcompที่ประมาณ 1 × 108 CFU / ml หรือพีบีเอสได้รับการแทรกซึมเข้าไปในช่องว่างระหว่างเซลล์ระหว่างเส้นเลือดใหญ่ของใบยาสูบขยายตัวได้เต็มที่ พืชถูกบ่มภายใต้เงื่อนไขที่ประมาณ 75% ความชื้นสัมพัทธ์ (RH) 28 องศาเซลเซียสและ 12 ชั่วโมงไฟเรืองแสงในชีวิตประจำวันในห้องการเจริญเติบโต (Percival เพอร์รี, IA) เป็นเวลา 2 วัน พืชที่พบภายหลังการตายของเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับการบริหารทรัพยากรบุคคลทั่วไป การตรวจสอบผลของ T3SS การกลายพันธุ์ในเอ citrulli เกิดโรคต้นกล้าแตงโม 2 สัปดาห์อายุ('น้ำตาลเด็ก) ถูกแทรกซึมเข้าไปตามที่อธิบายไว้ข้างต้นด้วยAAC00-1ΔhrcC, AAC00-1ΔhrcCcomp AAC00-1 (ป่าชนิด) ที่ประมาณ1 × 106 CFU / ml หรือพีบีเอสเป็นตัวควบคุมเชิงลบ ใบเลี้ยงสามต้นกล้าถูกเชื้อ (28) และพืชที่ถูกบ่มเป็นเวลา2 วันวันที่ 28 ° C ประมาณ 75% RH และ 12 ชั่วโมงของทุกวันไฟเรืองแสงในห้องการเจริญเติบโต พืชจากนั้นก็สังเกตเห็นสายตาอาการ BFB (เนื้อร้ายและน้ำแช่). การทดลองนี้ได้ดำเนินการสามครั้ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดีเอ็นเอ manipulations . เป็น nonpathogenic . citrulli t3ss กลายพันธุ์
( aac00-1 Δ hrcc ) ที่ถูกสร้างขึ้นโดยการลบของ hrcc ยีน encodes รูขุมขน
t3ss เนื้อเยื่อชั้นนอก ( 22 ) สั้น ๆ , 3.6-kb
ส่วนที่มี hrcc ยีนถูกระบุในจีโนม
ห้องสมุดของ aac00-1 . การ 3.6-kb fragment คือย่อยจาก
cosmid BamHI โคลนโดยใช้ ( promega คอร์ป , Madison , WI )
) ในโคลน ,และแปลงเป็น E . coli DH5 αสายพันธุ์ ทั้งหมด
673 BP ลบจากโคลนชิ้นส่วนย่อยโดยข้อ จำกัด และ stui
กับ bsteii ( promega Corp . ) และชิ้นส่วนที่ถูก
religated ผลในการลบของ hrcc ยีน ส่วน flanking เฟรมเปิดอ่าน
, แซม และ hrpd5 เมทิลทรานสเฟอเรสยังคง
เลย ลบ hrcc ยีนสร้างถูกโคลนเข้าไปในเวกเตอร์ pok1
ฆ่าตัวตาย ,ซึ่งเป็น levansucrase sacb ยีน

สร้างปก hrcc . ป๊อก hrcc ถูกแปลงเป็น E . coli
s17-1 สายพันธุ์ ( λ PIR ) ซึ่งเป็นคู่กันกับ aac00-1 และ singlecrossover
transconjugants ถูกเลือกขึ้นอยู่กับความต้านทาน
สเปกติโนมัยซิน . สองฟังก์ชันการส่งเสริมการเจริญเติบโตในแปลง M9
โดยวุ้นจานที่มีซูโครสซึ่ง
retards การเจริญเติบโตของแบคทีเรียการแสดง sacb .รุ่นของ
ลบการกลายพันธุ์ที่ได้รับการยืนยันโดยการใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ( พีซีอาร์ )
( ใช้ไพรเมอร์ hrcc.for ( 5 ’ - tgtatttct
acccgggcaagtcc-3 School ) และ hrcc.rev ( 5 ’ - tcctcgatgtag
agactcagcttg-3 School ) หนึ่ง hrcc การลบกลายพันธุ์ , เขต
aac00-1 Δ hrcc , เหมาะกับการเรียนของเรา การ hrcc การลบ
กลายพันธุ์เป็น complemented โดยยีนที่จำเพาะ BamHI 3.6-kb
ที่มี hrcc ยีนเข้าไปใน pufr043 cosmid ผลิต
pufr034 hrcc . pufr043 hrcc ต่อมาได้เปลี่ยน
ใน E . coli s17-1 ( λ PIR ) เพื่อใช้ใน triparental ผสมพันธุ์ .
pufr043 hrcc ก็กลายเป็น aac00-1 Δ hrcc สร้าง
aac00-1 Δ hrcccomp ( hrcc การกลายพันธุ์กว่า )
ก้ำฝ่าย ) . ผลของ hrcc การลบบน
ความสามารถของ .citrulli เพื่อก่อให้เกิดการ HR ทดลองใช้ 6 -
สัปดาห์เก่า ยาสูบ พืช ( การคูณ ) การใช้เข็มฉีดยา
ไม่มีเข็ม aac00-1 aac00-1 hrcc aac00 , Δ , -
1 Δ hrcccomp ประมาณ 1 × 108 CFU / ml หรือ PBS ถูกแทรกซึม
เป็น intercellular ระหว่างเส้นเลือดสำคัญของ
เต็มที่ระยะใบยาสูบ . พืชที่ถูกบ่มภายใต้เงื่อนไข
ประมาณ 75 % ความชื้นสัมพัทธ์ , 28 ° C และ 12
H ของแสงเรืองแสงทุกวันในการเจริญเติบโต ( ห้องเพอร์ซิวาล เพอร์รี่
IA ) 2 วัน พืชสามารถสังเกตสำหรับการตายของเซลล์
ที่เกี่ยวข้องกับบุคคลทั่วไป เพื่อศึกษาผลของการกลายพันธุ์ t3ss
. citrulli การ 2-week-old ต้นกล้าแตงโม
( 'sugar เด็ก ' ) แทรกซึมอยู่ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นด้วย
aac00-1 hrcc Δ ,aac00-1 Δ hrcccomp aac00-1 ( ของ )
ประมาณ 1 × CFU / 106 มิลลิลิตร หรือ PBS เป็นชุดควบคุมลบ
การแสดงออก 3 ต้นกล้าที่ปลูกเชื้อ ( 28 ) และพืช
บ่มเป็นเวลา 2 วัน ที่ 28 องศา C ประมาณ 75 เปอร์เซ็นต์ และ 12 H
ของแสงฟลูออเรสเซนต์ ทุกวัน ในการเจริญเติบโตของห้อง ปลูกแล้ว
สายตาสังเกตอาการ bfb ( โรคใบไหม้และน้ำ
แช่ )การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์สามครั้ง