were punched and placed in culture

were punched and placed in culture medium where the crosslinking reaction was
expected to proceed to completion.
2.8. 3D in vitro cell assays
Cells were retrieved from alginate hydrogels by digestion in a 5 U/mL alginate
lyase (Sigma-Aldrich) solution in HBSS for 20 min. For viability testing, cells were
stained with a Muse Count and Viability Kit and tested on a Muse Cell Analyzer
(EMD Millipore). To assess total cell metabolic activity, gels were transferred to wells
containing 10% AlamarBlue (AbD Serotec) in cell culture medium and incubated for
4 h. The reduction of AlamarBlue was assessed according to the manufacturer's
instructions.
2.9. Mice
All work was done with BALB/cJ mice (female, aged 6e8 weeks; Jackson Laboratories)
and was performed in compliance with National Institutes of Health and
institutional guidelines.
2.10. In vivo hydrogel inflammatory response
Ultrapure alginate with low endotoxin levels (MVG alginate, ProNova Biomedical
AS) was modified as described above with norbornene and tetrazine and subsequently
prepared at 2% w/v in DMEM after purification. Click alginate hydrogels
were prepared by mixing ultrapure Alg-N and Alg-T polymers with N:T ¼ 1 by
connecting two syringes with a luer lock. 15 min after mixing, 50 uL of click alginate
hydrogel was injected subcutaneously through an 18G needle. For ionic hydrogel
samples, a 2% w/v ultrapure alginate solution was prepared in DMEM and similarly
mixed in a syringe with a CaSO4 slurry at a final concentration of 2%. 50 uL of the
ionically crosslinked gelwas also injected subcutaneously in the same mice. Both gel
samples were retrieved along with the surrounding skin after 1 week, 1 month, and
2 months of injection and fixed overnight in 10% neutral buffered formalin solution
(Sigma-Aldrich). Samples were embedded in paraffin, sectioned, and stained with
hematoxylin and eosin (H&E) by the Harvard Rodent Histopathology Core.
3. Results
3.1. Synthesis, characterization, and crosslinking of click alginate
polymers
To prepare click alginate polymers, norbornene or tetrazine
groups were introduced to high molecular weight alginate biopolymers
using conventional carbodiimide chemistry (Fig. 1-A).
The degree of substitution of norbornene or tetrazine groups onto
purified click alginate polymers was determined from 1H NMR
spectra (Fig. S-1). A 5% degree of substitution of norbornene (Alg-N)
or tetrazine (Alg-T) on alginate carboxyl groups was obtained using
this method, and these batches of click alginate polymers were
used for all subsequent experiments.
To form click alginate hydrogels, Alg-N and Alg-T polymer solutions
were prepared separately and mixed together to gel. Upon
mixing of the two click alginate polymers, a stable gel was formed
via an inverse electron demand DielseAlder reaction between the
two polymers, which releases nitrogen gas (Fig. 1-B). The nitrogen
gas evolved from the crosslinking reaction does lead to the formation
of a few small bubbles within the hydrogel. A stable gel was
formed within 1 h at 25 C (Fig. 2-A), though the gelation kinetics
could be tuned by varying the temperature or initial degree of
substitution of the click alginate polymers (data not shown). The
gelation kinetics at 25 C are favorable because it allows the user to
easily achieve a well-mixed polymer formulation before gelation, a
common challenge with other alginate hydrogel crosslinking
methods.
3.2. Compressive Young's modulus and swelling behavior
The mechanical properties of the extracellular matrix have been
shown to affect cell fate and function in 2D and 3D environments
[34e37]. In order to tune mechanical properties over a wide range,
click alginate polymers were mixed at different ratios of Alg-N and
Alg-T (N:T ratio) for a given polymer concentration between 2 and
4% w/v. These click alginate hydrogel samples were subjected to

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ถูกเจาะและวางไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เกิดปฏิกิริยาเชื่อมขวางที่ถูก
คาดว่าจะดำเนินการเสร็จสิ้น.
2.8 3D ในหลอดทดลองการตรวจเซลล์
เซลล์ที่ถูกดึงออกมาจากไฮโดรเจลอัลจิเนตโดยการย่อยอาหารใน 5 อัลจิเนต U / มิลลิลิตร
ไอเลส (Sigma-Aldrich) วิธีการแก้ปัญหาใน HBSS สำหรับ 20 นาที สำหรับการทดสอบความมีชีวิตเซลล์ถูก
ย้อมด้วยสี Muse นับและความมีชีวิตและชุดทดสอบในเซลล์ Muse วิเคราะห์
(เมอร์ค) เพื่อประเมินเซลล์รวมกิจกรรมการเผาผลาญเจลถูกโอนไปยังหลุม
ที่มี 10% AlamarBlue (ABD Serotec) ในอาหารเลี้ยงเซลล์และการบ่มเป็นเวลา
4 ชั่วโมง การลดลงของ AlamarBlue ได้รับการประเมินตามของผู้ผลิต
คำแนะนำ.
2.9 หนู
ทำงานทั้งหมดทำด้วย Balb / CJ หนู (หญิงสัปดาห์ 6e8 อายุ; ห้องปฏิบัติการแจ็คสัน)
และได้รับการดำเนินการในการปฏิบัติตามสถาบันสุขภาพแห่งชาติและ
แนวทางการสถาบัน.
2.10 ไฮโดรเจลในร่างกายตอบสนองการอักเสบ
อัลจิเนตบริสุทธิ์ที่มีระดับสารพิษต่ำ (อัลจิเนต MVG, Pronova ชีวการแพทย์
AS) มีการปรับเปลี่ยนตามที่อธิบายไว้ข้างต้นด้วย norbornene และ tetrazine และต่อมา
เตรียมไว้ที่ 2% w / v ใน DMEM หลังจากที่บริสุทธิ์ คลิกไฮโดรเจลอัลจิเนต
ที่เตรียมโดยการผสมบริสุทธิ์ Alg-N และโพลิเมอร์ Alg-T กับไม่มี: T ¼ 1 โดย
การเชื่อมต่อสองเข็มฉีดยาที่มีการล็อค luer 15 นาทีหลังจากผสม 50 uL คลิกอัลจิเนต
ไฮโดรเจลถูกฉีดเข้าใต้ผิวหนังผ่านเข็ม 18G สำหรับไฮโดรเจลอิออน
ตัวอย่าง 2% w / v แก้ปัญหาอัลจิเนตบริสุทธิ์ถูกจัดทำขึ้นใน DMEM และในทำนองเดียวกัน
ผสมในเข็มฉีดยาที่มีสารละลาย CaSO4 ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 2% 50 uL ของ
gelwas เชื่อมขวาง ionically ยังฉีดเข้าใต้ผิวหนังในหนูเดียวกัน เจลทั้งสอง
ตัวอย่างที่ถูกดึงมาพร้อมกับผิวรอบหลังวันที่ 1 สัปดาห์ 1 เดือนและ
2 เดือนของการฉีดและคงค้างคืนใน 10% วิธีการแก้ปัญหาฟอร์มาลินบัฟเฟอร์ที่เป็นกลาง
(Sigma-Aldrich) ตัวอย่างที่ถูกฝังอยู่ในพาราฟินตัดและย้อมด้วยสี
hematoxylin และ Eosin (H & E) โดยฮาร์วาร์หนูพยาธิสภาพคอ.
3 ผล
3.1 การสังเคราะห์ลักษณะและการเชื่อมขวางของอัลจิเนตคลิก
โพลิเมอร์
เพื่อเตรียมความพร้อมการคลิกโพลีเมออัลจิเนต, norbornene หรือ tetrazine
กลุ่มได้รับการแนะนำให้รู้จักกับอัลจิเนตที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงพลาสติกชีวภาพ
โดยใช้เคมี carbodiimide ธรรมดา (รูปที่. 1).
ระดับการแทนที่ของกลุ่ม norbornene หรือ tetrazine บน
คลิกบริสุทธิ์โพลีเมออัลจิเนตถูกกำหนดจาก 1H NMR
สเปกตรัม (รูป. S-1) ระดับ 5% ของการทดแทนของ norbornene (Alg-N)
​​หรือ tetrazine (Alg-T) กลุ่ม carboxyl อัลจิเนตที่ได้รับโดยใช้
วิธีการนี้และสำหรับกระบวนการเหล่านี้ของการคลิกโพลีเมออัลจิเนตที่ถูก
นำมาใช้สำหรับการทดลองที่ตามมาทั้งหมด.
ในรูปแบบไฮโดรเจลอัลจิเนตคลิก, Alg-N และ Alg-T โซลูชั่นลิเมอร์
ที่เตรียมแยกจากกันและผสมเข้าด้วยกันเพื่อให้เจล เมื่อ
ผสมของทั้งสองคลิกโพลีเมออัลจิเนต, เจลที่มีเสถียรภาพที่ถูกสร้างขึ้น
ผ่านอิเล็กตรอนผกผันความต้องการ DielseAlder ปฏิกิริยาระหว่าง
สองโพลิเมอร์ซึ่งปล่อยก๊าซไนโตรเจน (รูป. 1-B) ไนโตรเจน
ก๊าซวิวัฒนาการมาจากปฏิกิริยาเชื่อมขวางไม่นำไปสู่การก่อตัว
ของฟองอากาศเล็ก ๆ น้อย ๆ ภายในไฮโดรเจล เจลที่มีเสถียรภาพก็
เกิดขึ้นภายใน 1 ชั่วโมงที่ 25 องศาเซลเซียส (รูปที่. 2) แม้ว่าจลนศาสตร์เจ
อาจจะมีการปรับโดยการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิหรือปริญญาเริ่มต้นของการ
แทนที่ของพอลิเมออัลจิเนตคลิก (ไม่ได้แสดงข้อมูล)
จลนศาสตร์เจอยู่ที่ 25 องศาเซลเซียสเป็นอย่างดีเพราะจะช่วยให้ผู้ใช้สามารถ
บรรลุได้อย่างง่ายดายสูตรลิเมอร์ผสมที่ดีก่อนที่จะเจล,
ความท้าทายร่วมกันกับการเชื่อมขวางไฮโดรเจลอัลจิเนตอื่น ๆ
วิธี.
3.2 อัดโมดูลัสของเด็กหนุ่มและบวมพฤติกรรม
สมบัติเชิงกลของ extracellular เมทริกซ์ได้รับการ
แสดงที่จะส่งผลกระทบต่อชะตากรรมของเซลล์และฟังก์ชั่นในแบบ 2D และ 3D สภาพแวดล้อม
[34e37] เพื่อที่จะปรับแต่งคุณสมบัติทางกลในช่วงที่กว้าง,
อัลจิเนตคลิกโพลิเมอร์ผสมที่อัตราส่วนที่แตกต่างกันของ Alg-N และ
Alg-T (ยังไม่มีอัตราส่วน T) สำหรับความเข้มข้นลิเมอร์ที่ได้รับระหว่าง 2 และ
4% w / v อัลจิเนตคลิกตัวอย่างเหล่านี้ไฮโดรเจลถูกยัดเยียดให้