NA inhibitors. RWJ-270201 {[1S,2S,3

NA inhibitors. RWJ-270201 {[1S,2S,3R,4R,1S]-3-[1-acetylamino-2-ethyl-
]butyl-4-[(aminoimino)-methyl]amino-2-hydroxycyclopentane-1-carboxylic acid;
BCX-1812}, zanamivir (4-guanidino-2,4-dideoxy-2,3-dehydro-N-acetylneuraminic
acid; GG167), GS4104 (oseltamivir phosphate, or oseltamivir), and
GS4071 (oseltamivir carboxylate, the active metabolite of oseltamivir:
[3R,4R,5S]-4-acetamido-5-amino-3-[1-ethylpropoxy]-1-cyclohexane-1-carboxylic
acid) were synthesized by BioCryst Pharmaceuticals (Birmingham, Ala.) by procedures
reported previously (23, 26, 44) and were provided by R.W. Johnson
Pharmaceutical Research Institute (Raritan, N.J.). The compounds were provided
as lyophilized powder and were maintained at 4°C. They were mixed with
tissue culture medium for in vitro studies and with sterile phosphate-buffered
saline (PBS), pH 7.4, for in vivo experiments.
Cells. Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells obtained from the American
Type Culture Collection (Manassas, Va.) were grown in minimal essential medium
supplemented with 5% fetal calf serum, 5 mM L-glutamine, sodium bicarbonate,
100 U of penicillin per ml, 100 g of streptomycin sulfate per ml, and 100
g of kanamycin sulfate per ml in a humidified atmosphere of 5% CO2.
Viruses. Avian influenza A viruses were obtained from the repository at St.
Jude Children’s Research Hospital and were propagated in the allantoic cavities
of 10-day-old embryonated chicken eggs. The histories of isolation and passage
of the influenza A/Hong Kong/156/97 (A/HK/156/97) (H5N1) and A/quail/Hong
Kong/G1/97 (A/quail/HK/G1/97) (H9N2) viruses used in this study were described
previously (10, 12, 25). All experiments with highly pathogenic avian
H5N1 and H9N2 viruses were conducted in a biosafety level 3 facility approved
for studies of these viruses.
NA activity assay. NA activity was determined by using 2-(4-methylumbelliferyl)--D-N-acetylneuraminic
acid (MUN; Sigma Chemical Co., St. Louis,
Mo.) as a substrate, as described previously (2). Viruses used in the NA assay
were grown in embryonated chicken eggs and were obtained from the allantoic
fluid after centrifugation at 2,000  g for 10 min. The NA activity of each virus
was determined before it was used in NA inhibition tests. Briefly, 10 l of each
of a series of twofold virus dilutions was mixed with 10 l of enzyme buffer [33
mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES), pH 6.5, and 4 mM CaCl2] and
30 l of substrate in enzyme buffer to give a final MUN concentration of 100 M.
The reaction mixtures were incubated on a shaker at 37°C for 30 min. The
reactions were then stopped by addition of 150 l of 0.014 N NaOH in 83%
ethanol to each well. The fluorescence of the released 4-methylumbelliferone
was quantified in a Fluoroskan II (Labsystems, Helsinki, Finland) spectrophotometer
(excitation wavelength, 355 nm; emission wavelength, 460 nm).
NA inhibition was assayed by determining the drug concentration required to
reduce NA activity to 50% of control NA activity (IC50). Fourfold dilutions
ranging from 8 M to 0.125 nM were made of the appropriate compound, and
10 l of each dilution was incubated with 10 l of virus-containing allantoic fluid
at a standard amount of NA activity (100 to 150 relative fluorescence units). The
mixture was shaken at 37°C for 30 min to allow interaction of drug and virus. The
enzymatic reaction was initiated by adding 30 l of substrate in enzyme buffer at
a final concentration of 100 M. The reaction was stopped after 1 h of incubation
at 37°C. Standard curves were constructed by plotting the percentage of fluorescence
inhibition relative to the activity of controls against the logs of inhibitor
concentrations. The IC50s were obtained from the graphs by extrapolation, and
the means were calculated on the basis of three independent experiments.
Virus neutralization assay in tissue culture. The antiviral activities of the
compounds were assessed by a modified microneutralization assay followed by
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (3) to measure expression of viral
nucleoprotein (NP) in infected cells, as described elsewhere (25). Briefly, a
confluent monolayer of MDCK cells was overlaid with 100 l of minimal essential
medium containing 2.5 g of N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketonetreated
trypsin (Sigma Chemical Co.)/ml and 100 l of RWJ-270201, zanamivir,
or oseltamivir carboxylate at concentrations of 1 M to 150 M. After incubation
for 30 min at 37°C, the cells were infected with influenza virus at a multiplicity of
infection of 0.01 to 0.1 PFU/cell. The infected cells were cultured in the presence
of the drug for 18 h at 37°C. The 50% effective concentration (EC50) of the drug
was determined by plotting the percent inhibition of virus replication after
correction for background values (obtained from uninfected cultures) as a function
of compound concentration calculated from the dose-response curve. Data
were expressed as the means of the EC50s.
Drug efficacy in vivo. Female BALB/c mice (weight,

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สารยับยั้ง NA RWJ-270201 {[1S,2S,3R,4R,1S]-3-[1-acetylamino-2-ethyl-] บิวทิล - 4- [(aminoimino) -เมทิล] กรดอะมิโน-2-hydroxycyclopentane-1-carboxylicBCX-1812 }, ซานามิเวียร์ (4-guanidino-2,4-dideoxy-2,3-dehydro-N-acetylneuraminicกรด GG167), GS4104 (oseltamivir ฟอสเฟต หรือ oseltamivir), และGS4071 (oseltamivir carboxylate, active metabolite ของ oseltamivir:[3R,4R,5S]-4-acetamido-5-amino-3-[1-ethylpropoxy]-1-cyclohexane-1-carboxylicกรดถูกสังเคราะห์ โดยยา BioCryst (เบอร์มิงแฮม Ala.) โดยขั้นตอนรายงานก่อนหน้านี้ (23, 26, 44) และได้จาก Johnson R.W.สถาบันวิจัยยา (Raritan เอ็นเจ) สารประกอบไว้เรียบร้อยแล้วเป็น lyophilized ผง และยังคงไว้ที่ 4 องศาเซลเซียส พวกเขารวมกับเนื้อเยื่อกลาง สำหรับการศึกษาในหลอดทดลอง และผ่านการฆ่าเชื้อฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (PBS), ค่า pH 7.4 สำหรับการทดลองในสัตว์ทดลองมีเซลล์ เซลล์ไตสุนัข (MDCK) ดาร์ Madin จากอเมริกันที่ชนิดของคอลเลกวัฒนธรรม (มานาสซาส va.) ที่ปลูกในสำคัญน้อยที่สุดเสริม ด้วยเซรั่มลูกทารก 5%, 5 มม. L-กลูตา โซเดียมไบคาร์บอเนต100 U ยาเพนนิซิลลินต่อมิลลิลิตร streptomycin ซัลเฟตต่อมิลลิลิตร 100 กรัมและ 100กรัมของกานามัยซินซัลเฟตต่อมิลลิลิตรในบรรยากาศ humidified 5% CO2ไวรัส ไข้หวัดนกที่ไวรัสได้รับมาจากเก็บข้อมูลที่เซนต์จูดเด็กของโรงพยาบาล วิจัย และถูกแพร่กระจายในผุ allantoicของไข่ไก่ 10 วันเก่า embryonated ประวัติของการแยกและทางเดินของไข้หวัดใหญ่ A/นก กระทา/Hong และ A/Hong Kong/156/97 (A/HK/156/97) (นักวิชาการ)ฮ่องกง/G1/97 (A/นก กระทา/HK/G1/97) (H9N2) ไวรัสที่ใช้ในการศึกษานี้ได้อธิบายก่อนหน้านี้ (10, 12, 25) การทดลองทั้งหมดกับเกิดนกไวรัสนักวิชาการและ H9N2 ได้ดำเนินการในสถานที่ชั้น 3 ความอนุมัติสำหรับการศึกษาของไวรัสเหล่านี้นากิจกรรมทดสอบ นากิจกรรมกำหนดโดย 2-(4-methylumbelliferyl)--D-N-acetylneuraminicกรด (มูล บริษัทซิกม่าเคมี St. LouisMo.) เป็นแบบพื้นผิว ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (2) ไวรัสที่ใช้ในการทดสอบนาที่ปลูกในไข่ไก่ embryonated และได้รับมาจากใน allantoicของเหลวหลังจากการหมุนเหวี่ยงที่ g 2000 สำหรับ 10 นาที กิจกรรมนาของไวรัสแต่ละพิจารณาก่อนที่จะถูกใช้ในการทดสอบการยับยั้ง NA สั้น ๆ 10 l ของแต่ละชุดสองเท่าไวรัส dilutions ถูกผสมกับเอนไซม์บัฟเฟอร์ [33 l 10มม. 2 - กรด ethanesulfonic (MES) (N-morpholino) ค่า pH 6.5 และ 4 มม. CaCl2] และ30 ลิตรของพื้นผิวในบัฟเฟอร์เอนไซม์เข้มข้น 100 เมตรสุดท้ายมันให้ได้รับการกกผสมปฏิกิริยาบนปั่นที่ 37° C 30 นาทีแล้วได้ถูกหยุดปฏิกิริยา โดยเพิ่ม 150 ลิตร 0.014 N NaOH 83%เอทานอลให้ด้วยละ เรืองแสงของ 4-methylumbelliferone ออกมาถูกวัดใน spectrophotometer II Fluoroskan (Labsystems เฮลซิงกิ ฟินแลนด์)(ความยาวคลื่นกระตุ้น 355 nm ปล่อยความยาวคลื่น 460 nm)ยับยั้ง NA ถูก assayed โดยกำหนดความเข้มข้นของยาที่ต้องลดการนากิจกรรมที่ควบคุมกิจกรรมนา (IC50) 50% Fourfold dilutionsตั้งแต่ 8 เมตรถึง 0.125 นาโนเมตรที่ทำจากสารประกอบที่เหมาะสม และ10 ลิตรเจือจางแต่ละได้รับการกกกับ l 10 ของไวรัสที่ประกอบด้วย allantoic fluidเป็นจำนวนมาตรฐานของกิจกรรมนา (100-150 หน่วยสัมพัทธ์เรืองแสง) การส่วนผสมถูกเขย่าที่ 37° C เป็นเวลา 30 นาทีเพื่อให้ปฏิสัมพันธ์ของยาเสพติดและไวรัส การจุดเริ่มต้นของปฏิกิริยาเอนไซม์ โดยการเพิ่มพื้นผิว 30 ลิตรในบัฟเฟอร์เอนไซม์ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 100 เมตร หยุดปฏิกิริยาหลังจาก 1 ชั่วโมงของการกกไข่ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส กราฟมาตรฐานถูกสร้างขึ้น โดยพล็อตเปอร์เซ็นต์ของสารเรืองแสงยับยั้งการสัมพันธ์กับกิจกรรมการควบคุมกับบันทึกของสารยับยั้งความเข้มข้น IC50s ได้รับมาจากกราฟ โดยการประมาณค่านอกช่วง และหมายถึงได้คำนวณการทดลองอิสระที่สามทดสอบปฏิกิริยาสะเทินไวรัสในเนื้อเยื่อ กิจกรรมของไวรัสสารที่ถูกประเมิน โดยการทดสอบ microneutralization แก้ไขตามด้วยวิเคราะห์เชื่อมโยงเอนไซม์ immunosorbent (ELISA) (3) การวัดของไวรัสnucleoprotein (NP) ติดเชื้อเซลล์ ตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น (25) สั้น ๆ การmonolayer confluent เซลล์ MDCK ถูกวางทับกับ 100 ลิตรที่สำคัญน้อยที่สุดขนาดกลางที่ประกอบด้วย N tosyl L phenylalanine chloromethyl ketonetreated 2.5 กรัมทริปซิน (Sigma บริษัทเคมี) /ml และ l 100 ของ RWJ-270201 ซานามิเวียร์หรือ carboxylate oseltamivir ที่ความเข้มข้นของ 1 M 150 เมตร หลังจากบ่มสำหรับ 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37° C เซลล์มีการติดเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ที่หลายหลากของการติดเชื้อของ 0.01 ถึง 0.1 PFU/เซลล์ เซลล์ติดเชื้อเพาะเลี้ยงในที่ที่มียาเสพติดสำหรับ 18 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส สมาธิมีประสิทธิภาพ 50% (EC50) ยาเสพติดถูกกำหนด โดยเปอร์เซ็นต์การยับยั้งการจำลองแบบของไวรัสหลังจากการวางแผนการแก้ไขพื้นหลังค่า (ได้จากวัฒนธรรมการติดเชื้อ) เป็นฟังก์ชันสารความเข้มข้นของคำนวณโค้งตอบสนองยา ข้อมูลถูกแสดงเป็นหมายของ EC50sการศึกษาประสิทธิภาพการยาในสัตว์ทดลอง หญิง BALB/c หนู (น้ำหนัก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ยับยั้ง NA RWJ-270201
กรด;
BCX-1812} zanamivir (4 guanidino-2,4-dideoxy-2,3-dehydro-N-อะเซทิล
กรด; GG167) GS4104 (oseltamivir ฟอสเฟตหรือ oseltamivir) และ
GS4071 (oseltamivir carboxylate การใช้งาน metabolite ของ oseltamivir:
[3R, 4R, 5S] -4-Acetamido-5-Amino-3- [1 ethylpropoxy] -1-cyclohexane-1-คาร์บอกซิ
Acid) ถูกสังเคราะห์โดย Biocryst Pharmaceuticals (เบอร์มิงแฮม, Ala) โดยขั้นตอน.
รายงานก่อนหน้านี้ (23, 26, 44) และมีให้โดย RW จอห์นสัน
ยาสถาบันวิจัย (ริตัน, นิวเจอร์ซีย์) สารประกอบที่มีให้
เป็นผงแห้งและได้รับการเก็บรักษาไว้ที่ 4 องศาเซลเซียส พวกเขาได้รับการผสมกับ
อาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อเพื่อการศึกษาในหลอดทดลองและผ่านการฆ่าเชื้อด้วยฟอสเฟตบัฟเฟอร์
น้ำเกลือ (PBS) ค่า pH 7.4 สำหรับการทดลองในร่างกาย.
เซลล์ Madin-ดาร์บี้สุนัขไต (MDCK) เซลล์ที่ได้รับจากชาวอเมริกัน
ประเภทวัฒนธรรมสะสม (ซาส, เวอร์จิเนีย.) ได้รับการเติบโตในระดับปานกลางที่จำเป็นน้อยที่สุด
เสริมด้วย 5% ในซีรั่มของทารกในครรภ์ลูกวัว 5 mm L-glutamine โซเดียมไบคาร์บอเนต
100 U ของยาปฏิชีวนะต่อ มล., 100 กรัมของซัลเฟต streptomycin ต่อมล. และ 100
กรัมของซัลเฟตต่อกานามัยซิมล. ในบรรยากาศความชื้น 5% CO2.
ไวรัส ไวรัสไข้หวัดนกที่ได้รับจากพื้นที่เก็บข้อมูลที่เซนต์
วิจัยของโรงพยาบาลจูดของเด็กและได้รับการแพร่กระจายในโพรง allantoic
10 วันเก่าไข่ไก่ embryonated ประวัติศาสตร์ของการแยกและทางเดิน
ของไข้หวัดใหญ่ A / ฮ่องกง / 156/97 (A / HK / 156/97) (H5N1) และ A / นกกระทา / ฮ่องกง
ฮ่องกง / G1 / 97 (A / นกกระทา / HK / G1 / 97 ) (H9N2) ไวรัสที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ได้อธิบายไว้
ก่อนหน้านี้ (10, 12, 25) การทดลองทั้งหมดที่มีเชื้อโรคไข้หวัดนก
สายพันธุ์ H5N1 และ H9N2 ไวรัสได้ดำเนินการในสถานที่ปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 3 ได้รับการอนุมัติ
สำหรับการศึกษาของไวรัสเหล่านี้.
NA ทดสอบกิจกรรม กิจกรรม NA ถูกกำหนดโดยใช้ 2- (4 Methylumbelliferyl) - - DN-อะเซทิล?
Acid (MUN; ซิก Chemical Co. , เซนต์หลุยส์
โม) เป็นสารตั้งต้นในขณะที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (2) ไวรัสที่ใช้ในการทดสอบ NA
ถูกปลูกในไข่ไก่ embryonated และได้รับจาก allantoic
ของเหลวหลังจากหมุนเหวี่ยงที่ 2,000? กรัมเป็นเวลา 10 นาที กิจกรรม NA ของแต่ละไวรัส
ถูกกำหนดก่อนที่จะถูกใช้ในการทดสอบการยับยั้ง NA สั้น ๆ , 10 ลิตรของแต่ละ
ชุดของเจือจางไวรัสสองเท่าได้รับการผสมกับ 10 ลิตรของบัฟเฟอร์เอนไซม์ [33
มิลลิ 2- (N-morpholino) กรด ethanesulfonic (MES) ค่า pH 6.5 และ 4 มิลลิ CaCl2] และ
30 ลิตรของพื้นผิว ในบัฟเฟอร์เอนไซม์ที่จะให้มีความเข้มข้น MUN สุดท้ายของ 100 เมตร
ผสมปฏิกิริยาถูกบ่มในเครื่องปั่นที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที
ปฏิกิริยาถูกหยุดการทำงานแล้วโดยนอกเหนือจาก 150 ลิตร 0.014 N NaOH ใน 83%
เอทานอลให้กับแต่ละดี เรืองแสงของที่ปล่อยออกมา 4 methylumbelliferone
ถูกวัดใน Fluoroskan ii (Labsystems เฮลซิงกิฟินแลนด์) spectrophotometer
(กระตุ้นความยาวคลื่น 355 นาโนเมตร; ความยาวคลื่นปล่อยก๊าซเรือนกระจก 460 นาโนเมตร).
การยับยั้ง NA ได้รับการวิเคราะห์โดยการกำหนดความเข้มข้นของยาที่จำเป็นในการ
ลดกิจกรรม NA ถึง 50% ของการควบคุมกิจกรรม NA (IC50) เจือจางจาตุรงค์
ตั้งแต่ 8 M เพื่อ 0.125 นาโนเมตรที่ทำจากสารประกอบที่เหมาะสมและ
10 ลิตรของแต่ละเจือจางถูกบ่มกับ 10 ลิตรของไวรัสที่มีของเหลว allantoic
ในปริมาณมาตรฐานของกิจกรรม NA (100-150 หน่วยเรืองแสงญาติ)
ส่วนผสมที่ถูกเขย่าที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีเพื่อช่วยให้การทำงานร่วมกันของยาเสพติดและไวรัส
ปฏิกิริยาของเอนไซม์ได้ริเริ่มขึ้นโดยการเพิ่ม 30 ลิตรสารตั้งต้นในบัฟเฟอร์เอนไซม์ที่
มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 100 เมตรปฏิกิริยาก็หยุดหลังจาก 1 ชั่วโมงของการบ่ม
ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เส้นโค้งมาตรฐานที่ถูกสร้างขึ้นโดยพล็อตร้อยละของการเรืองแสง
ยับยั้งเทียบกับกิจกรรมของการควบคุมกับบันทึกของตัวยับยั้งที่
มีความเข้มข้น IC50s ที่ได้รับจากกราฟโดยการคาดการณ์และ
วิธีการที่จะถูกคำนวณบนพื้นฐานของการทดลองสามอิสระ.
ทดสอบ Virus วางตัวเป็นกลางในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ กิจกรรมต้านไวรัสของ
สารประกอบที่ได้รับการประเมินโดยการทดสอบ microneutralization ปรับเปลี่ยนตามด้วย
เอนไซม์ที่เชื่อมโยงอิมมูโนทดสอบ (ELISA) (3) การวัดการแสดงออกของไวรัส
นิวคลีโอ (NP) ในเซลล์ที่ติดเชื้อตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น ๆ (25) ในเวลาสั้น ๆ เป็น
monolayer ไหลมารวมกันของเซลล์ MDCK ถูกบุด้วย 100 ลิตรที่สำคัญน้อยที่สุด
ขนาดกลางที่มี 2.5 กรัม N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketonetreated
trypsin (Sigma เคมี co.) / มล. และ 100 ลิตร RWJ-270201, zanamivir,
หรือ carboxylate oseltamivir ที่ความเข้มข้น 1 เมตรถึง 150 เมตรหลังจากการบ่ม
เป็นเวลา 30 นาทีที่ 37 ° C, เซลล์มีการติดเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ที่หลายหลากของ
การติดเชื้อของ 0.01-0.1 PFU / มือถือ เซลล์ที่ติดเชื้อมาเพาะเลี้ยงในการปรากฏตัว
ของยาเสพติดเป็นเวลา 18 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส มีประสิทธิภาพความเข้มข้น 50% (EC50) ของยาเสพติด
ถูกกำหนดโดยการวางแผนการยับยั้งการร้อยละของการจำลองแบบไวรัสหลังจาก
การแก้ไขค่าพื้นหลัง (ที่ได้รับจากวัฒนธรรมที่ไม่ติดเชื้อ) เป็นฟังก์ชั่น
ของความเข้มข้นของสารประกอบที่คำนวณได้จากเส้นโค้งปริมาณการตอบสนอง ข้อมูลที่
ถูกแสดงเป็นวิธีการของ EC50s ได้.
รับรู้ความสามารถของยาเสพติดในร่างกาย หนูหญิง Balb / C (น้ำหนัก

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

และตัวยับยั้ง rwj-270201 { [ 1s 2s , 3R , อาร์ , 1s , ] - 3 - [ 1-acetylamino-2-ethyl -- [ ] butyl-4 ( aminoimino ) เมทิล ] amino-2-hydroxycyclopentane-1-carboxylic กรด ;bcx-1812 } , ซาราคิ เคนปาจิ ( 4-guanidino-2,4-dideoxy-2,3-dehydro-n-acetylneuraminicกรด ; gg167 ) gs4104 ( โอเซลทามิเวียร์ฟอสเฟต หรือทามิฟลู ) และgs4071 ( ทามิฟลูคาร์บอกซิเลต ใช้ต้นตอของโอเซลทามีเวียร์ :[ 3R , 4 , 5 ส. 4-acetamido-5-amino-3 ] - - [ ] - 1-cyclohexane-1-carboxylic 1-ethylpropoxyกรด ) ถูกสังเคราะห์โดย BIOCRYST Pharmaceuticals ( เบอร์มิงแฮม เอ๋ ) โดยวิธีการรายงานก่อนหน้านี้ ( 23 , 26 , 44 ) และได้ให้ไว้ โดย r.w. จอห์นสันสถาบันการวิจัยทางเภสัชศาสตร์ ( อาหารและยา , นิวเจอร์ซีย์ ) สารประกอบที่ได้ให้ไว้เป็นโปรตีนผงและถูกเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศา พวกเขาผสมกับการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อในหลอดทดลองขนาดกลางและฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่เป็นหมันน้ำเกลือ ( PBS ) , pH 7.4 สำหรับในสัตว์ทดลองเซลล์ madin ดาร์บี้สุนัขไต ( mdck ) เซลล์ที่ได้จากอเมริกาวัฒนธรรมของสะสมประเภท ( แมนัสซัส เอส ) ปลูกในน้อยที่สุดที่จำเป็นขนาดกลางเซรั่มเติม 5% ของลูกวัว , 5 มม. Glutamine , โซเดียมไบคาร์บอเนต100 u ยาสเตรปโตมัยซินซัลเฟตต่อมิลลิลิตร ต่อมิลลิลิตร ต่อ 100 กรัม และ 100กรัมต่อมิลลิลิตร กาน่ามัยซิน ซัลเฟตในบรรยากาศของ CO2 humidified 5 %ไวรัส เป็นไวรัสไข้หวัดนกได้จากกรุที่เซนต์วิจัยจูดโรงพยาบาลเด็ก และขยายพันธุ์ในโพรง allantoic10 วันแก่วงจรชีวิตไก่ไข่ ประวัติของการแยกและทางเดินของโรคไข้หวัดใหญ่ / ฮ่องกง / 156 / 97 ( / HK / 156 / 97 ) ( ไข้หวัดนก ) และ A / นกกระทา / ฮ่องกงฮ่องกง / G1 / 97 ( / นกกระทา / HK / G1 / 97 ) ( h9n2 ) ไวรัสที่ใช้ในการศึกษา คือ อธิบายก่อนหน้านี้ ( 10 , 12 , 25 ) การทดลองทั้งหมดกับเชื้อโรคไข้หวัดนกสูงและไวรัสไข้หวัดนก H5N1 h9n2 ทดสอบความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 3 ในสถานที่ได้รับการอนุมัติสำหรับการศึกษาของไวรัสเหล่านี้นา ในกิจกรรม นากิจกรรมถูกกำหนดโดยใช้ 2 - ( 4-methylumbelliferyl ) -- d-n-acetylneuraminicกรด ( มุน ; Sigma Chemical Co . , เซนต์ หลุยส์โม ) เป็นสับสเตรทตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( 2 ) ไวรัสที่ใช้ในนา การทดสอบเติบโตในวงจรชีวิตไก่ไข่และได้รับจาก allantoicของเหลวหลังการปั่นเหวี่ยงที่ 2000 G 10 นาทีนากิจกรรมของแต่ละไวรัสพิจารณาก่อนที่จะถูกใช้ในนา การทดสอบการยับยั้ง สั้น ๆ , 10 ลิตร ของแต่ละคนของชุดของสองเท่าไวรัสเจือจางผสมกับ 10 ลิตรของเอนไซม์บัฟเฟอร์ [ 33อืม 2 - ( n-morpholino ) ethanesulfonic acid ( MES ) , pH 6.5 , และ 4 มม. ผลิต ] และ30 ลิตรใช้ในบัฟเฟอร์ความเข้มข้นเอนไซม์ให้มั่นสุดท้ายของ 100 เมตรปฏิกิริยาผสมถูกบ่มในเครื่องปั่นที่ 37 ° C เป็นเวลา 30 นาทีปฏิกิริยาแล้วแวะเติม 150 ลิตร 0.014 N NaOH ใน 83 เปอร์เซ็นต์เอทานอลแต่ละอย่างดี เรืองแสงของออก 4-methylumbelliferoneเป็นวัดใน fluoroskan II ( labsystems , เฮลซิงกิ , ฟินแลนด์ ) วัสดุ( กระตุ้นความยาวคลื่น 355 nm ; ปล่อยความยาวคลื่น 460 nm )นาชนิดซีรั่มโดยกำหนดความเข้มข้นของยาต้องลด 50% นากิจกรรมการควบคุมนากิจกรรม ( ic50 ) จาตุรงค์เจือจางตั้งแต่ 8 เมตร ถึง 800 nm เป็นบริเวณที่เหมาะสม10 ลิตรของแต่ละ dilution คือแยก 10 ลิตรของไวรัสที่มี allantoic ของไหลมาตรฐานที่จํานวนนากิจกรรม ( 100 - 150 เมื่อเทียบจากหน่วย ) ที่ส่วนผสมที่ถูกเขย่าที่อุณหภูมิ 37 องศา C นาน 30 นาที เพื่อให้ปฏิสัมพันธ์ของยาเสพติดและไวรัส ที่ปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่ถูกริเริ่มโดยการเพิ่ม 30 ลิตรใช้ในบัฟเฟอร์ที่เอนไซม์ความเข้มข้น 100 เมตรสุดท้ายของปฏิกิริยาที่ถูกบ่มหยุดหลังจาก 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศา จะถูกสร้างขึ้นโดยเส้นโค้งมาตรฐานร้อยละของเรืองสารสัมพันธ์กับกิจกรรมของการควบคุมกับบันทึกของยับยั้งเข้มข้น การ ic50s ได้จากกราฟโดยการคาดเดาจาก และวิธีการคำนวณบนพื้นฐานของสามการทดลองที่เป็นอิสระไวรัสใช้ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ กิจกรรมต้านไวรัสของสารประกอบที่ถูกประเมิน โดยดัดแปลง microneutralization ) ตามมาด้วยenzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA ) ( 3 ) เพื่อศึกษาการแสดงออกของไวรัสนิ วคลีโอโปรตีน ( NP ) ในเซลล์ที่ติดเชื้อ , ตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น ( 25 ) สั้น ๆ ,ที่ไหลไปด้วยกันอย่างของ mdck เซลล์ถูกหุ้มด้วย 100 ล. ที่น้อยที่สุดที่จำเป็นอาหารที่มี n-tosyl-l-phenylalanine คลอโรเมทธิล ketonetreated 2.5 กรัมเอนไซม์ ( Sigma Chemical Co . ) / ml และ 100 ลิตร rwj-270201 ซานามิเวียร์ , ,หรือโอเซลทามิเวียร์คาร์บอกซิเลตที่ความเข้มข้น 1 M 150 เมตร หลังจากบ่ม30 นาทีที่ 37 ° C , เซลล์ที่ติดเชื้อ ไวรัสไข้หวัดใหญ่ที่หลายหลากของการติดเชื้อของ 0.01 ถึง 0.1 พีเอฟยู / เซลล์ เซลล์ที่เพาะเลี้ยงในตนของยา 18 H ที่ 37 ° C ที่มีความเข้มข้น 50% ( ec50 ) ของยาถูกกำหนดโดยการพล็อตเปอร์เซนต์ของไวรัสหลังจากแก้ไขค่าพื้นหลัง ( ที่ได้รับจากวัฒนธรรมมาก่อน ) เป็นฟังก์ชันความเข้มข้นของสารประกอบที่ได้จากความคิดเห็นโค้ง ข้อมูลกำลังแสดงเป็นค่าเฉลี่ยของ ec50s .ประสิทธิภาพของยาในร่างกาย หนู balb / C หญิง น้ำหนัก