2. Materials and methods2.1. Bacter

2. Materials and methods
2.1. Bacterial strains

Collection of 90 SAG strains was composed of isolates sent to the National Reference Center for Antimicrobial Resistance (KORLD), National Reference Center for CNS Infections (KOROUN), and Center for Quality Control in Microbiology (POLMicro). Routinely, strains were cultured on Columbia agar plates supplemented with 5% sheep blood (Becton Dickinson, NJ, USA) at 37 °C in an atmosphere of 5% CO2 for 24–48 hours. Strains were assigned to SAG species based on VITEK2 and ID Strep tests (bioMerieux, France). In case of problems with identification, MALDI-TOF-MS (bioMerieux, Burker) analysis was performed.

2.2. Chromosomal DNA preparation

SAG strains were cultured on Columbia plates with 5% sheep blood at 37 °C in an atmosphere of 5% CO2 for 48 hours and then harvested with sterile swab, treated by lysozyme, mutanolysin and RNase, and then processed according the manufacturer of commercially available kit for chromosomal DNA isolation (A&A Biotechnology, Poland) as described previously for S. pyogenes ( Borek et al., 2011).

2.3. PCR

Multiplex PCR reactions were carried out in total volume of 5 μL. To achieve equal amplification of products, primers were mixed at different concentration listed in Table 1, and primer mix was used in the PCR reaction. PCR mixture contained 100 μmol/L dNTP (Thermo Scientific), 1× Taq buffer with (NH4)2SO4 (Thermo Scientific, MA, USA), 2.5 mmol/L Mg2+ (Thermo Scientific), 0.5 U Taq polymerase (Thermo Scientific), and 0.25 μL of primer mix and chromosomal DNA template. Annealing and elongation were carried out for 40 cycles of denaturation (15 seconds of denaturation at 95 °C) and annealing simultaneously with elongation (5 minutes at 68 °C). Initial denaturation was carried out for 3 minutes at 95 °C, and final elongation was 7 minutes at 72 °C.

Table 1.
Primers used in the study.
Starter (5′→3′)
Location and putative function of the gene/amplicon Detected amplicon size (bp) Volume of a 10 mmol/L starter used to compose starter mix
R1 Forward GGCTCCTACTTTGTCAGCTGCACATCTAGTC Intergenic region between genes encoding ABC superfamily ATP binding cassette transporter and hypothetical protein 600–955 5 μL
R1 Reverse GCTTACTTTGCAGGTAGTGCTGTCAGCAAGG 5 μL
R2 Forward GATTGCGGCTTTGGAGCAGCGTTTTCCGGTTC Intergenic region between genes encoding dihydroorotate dehydrogenase and alpha-acetolactate decarboxylase 400–950 5 μL
R2 Reverse TGTAACCTACACAGGGCAAAAGACCCTACG 5 μL
R3 Forward TTGCTCACCGCTTATCGACGATTCAAGAGG Intergenic region between genes encoding multidrug ABC transporter ATPase and hypothetical protein 680–824 5 μL
R3 Reverse CGAACAGCACTTTATTTTCTCCCGTCGGCTTG 5 μL
R4 Forward GGTCTAGGCTTGTCGCTTGCAAAGCAAATCAC Intergenic region between genes encoding histidine kinase and alpha-amylase 450–665 5 μL
R4 Reverse TGGGCAGATTTCCCAGTTGCAGAAAAGTCAGTTAG 5 μL
R5 Forward GAGCCAGTTGCTCTGTCTCACCAATTTCG Intergenic region between genes encoding peptidase M16 and DNA binding protein 456–600 5 μL
R5 Reverse GAAAAGAACGAGCATAGAAAGGACTGGGAAGAC 5 μL
R6 Forward CGCATGGCGGAGACTGCTCACCTGAACATTAAC Intergenic region between genes encoding two hypothetical proteins 300–2800 15 μL
R6 Reverse CCAATCTCCGCAAATCTCTTGCTGGGTGATTCC 15 μL
R7 Forward ACCACGCAAGATGATGGGACGTATCAG Intergenic region between genes encoding alpha/beta hydrolase and methionine-tRNA ligase 350–785 2.5 μL
R7 Reverse CCGCTTAACTCGGCTCCTCATTTCAATCC 2.5 μL
R8 Forward CCTGACACAAGAGCTGCAGAGTTGTTCAC Amplicon within a gene encoding putative membrane located protein 235–375 2.5 μL
R8 Reverse GGGTGCTGGTCGATTAGCAAAAGGTGTAAC 2.5 μL
R9 Forward CAAGGGCAAGATTGGAGAAGTGCTGGGTAAGG Intergenic region between genes encoding NAD-dependent deacetylase and DNA-binding protein 230–300 2.5 μL
R9 Reverse CAATTGCTGTTGTGCCTGCGCTCGATCTTG 2.5 μL
Table options
2.4. Electrophoresis

Multiplex PCR products were separated in 1.5% SeaKem (Lonza, Switzerland) agarose gels in Tris-Borate-EDTA buffer with ethidium bromide. Two types of size markers were used: 50-bp and 100-bp ladders (Thermo Scientific) to precisely cover the whole size range of the amplified products. Electrophoresis was carried out at constant current 120 amperes in Sub-Cell Model 192 electrophoresis cell (BioRad, CA, USA) for 3 hours. Gels were visualized under UV light and photographed. Normalization and analysis of MLVF patterns were done using BioNumerics (Applied Maths, Belgium) software.

2.5. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analysis

The analysis, including plugs preparation, digestion, and electrophoresis, was carried out as described previously by Obszanska et al. (2015). The cited protocol describes the use of EagI restriction enzyme (Thermo Scientific) instead of standard SmaI.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

5. วัสดุและวิธีการ5.1. วัสดุกรดอะมิโน l ป้องกันและเรซิน pMBHA ซื้อจาก Novabiochem (Laufelfingen สวิตเซอร์แลนด์) และ Mimotopes (เมลเบิร์น ออสเตรเลีย) เปปไทด์สังเคราะห์เกรด dichloromethane (DCM) เมทานอล N, N-diisopropylethylamine (DIPEA), 1 - hexafluorophosphate 3 oxid H-1-1,2,3-triazolo [4, 5-b] pyridinium [เมทิลี bis (dimethylamino)] (HATU) และกรด trifluoroacetic (TFA) ซื้อจากเมอร์ค (Hohenbrunn เยอรมนี) ตัวทำละลายสำหรับ HPLC (acetonitrile (MeCN)) ได้รับจาก Labscan (กรุงเทพมหานคร ประเทศไทย) เปื้อนอื่น ๆ ซื้อที่มีความบริสุทธิ์จาก Sigma-Aldrich (Castle Hill รัฐนิวเซาท์เวลส์ ออสเตรเลีย) ไมโครเวฟ SPPS Boc ช่วยดำเนินการโดยใช้เครื่อง SPS โหมดค้นพบ CEM ปฏิกรณ์ (CME คอร์ปอเรชั่น แมตทิวส์ NC, USA) HF ความแตกแยกได้ดำเนินการ โดยใช้อุปกรณ์ HF Kel F (สถาบันเปปไทด์ โอซาก้า ญี่ปุ่น) ESI MS ได้ดำเนินการ โดยใช้เครื่องมือ API3000 เพอร์ – เอลเมอ – Sciex ด้วย 1.4 นักวิเคราะห์ (AppliedBiosystems/MDS Sciex โตรอนโต แคนาดา) ทำการวิเคราะห์ RP-HPLC ตาม Agilent เครื่องกับอัตราการไหล min−1 1 มิลลิลิตรด้วยการตรวจหาสารประกอบที่ 214 nm แยกสำเร็จ โดยวิ่งไล่ 0 – 100% ตัวทำละลาย B (90% MeCN/0.1% TFA) กว่า 40 นาที ด้วยตัวทำละลาย A (0.1% TFA/H2O) โดยใช้ Vydac วิเคราะห์ C4 คอลัมน์ (214TP54; 5 μ m, 4.6 × 250 mm) หรือ Vydac วิเคราะห์ C18 คอลัมน์ (218TP54; 5 μ m, 4.6 × 250 mm) เปปไทด์บริสุทธิ์ทำการใช้การเตรียม RP-HPLC โดยใช้ระบบน้ำเดลต้า 600 ด้วยอัตราการไหล min−1 10 มล.ด้วยการตรวจหาสารประกอบที่ 230 nm แยกได้ประสบความสำเร็จกับ A ตัวทำละลายและตัวทำละลาย B Vydac กราคอลัมน์ C4 (214TP1022; 22 × 250 มม. 10 μ m) หรือ Vydac กรา C18 คอลัมน์ (218TP1022; 22 × 250 มม. 10 μ m) มุมซีดีถูกวัด โดยใช้เป็น spectropolarimeter JASCO J 710 ขนาดถูกวิเคราะห์ผ่านเครื่อง ZP นาโน Zetasizer (เครื่องมือมัลเวิร์น UK) ผ่านซอฟต์แวร์ DTS ดำเนินการส่งชาวดัตช์ใช้แบบ JEM-1010 ส่งชาวดัตช์ (JEOL Ltd ญี่ปุ่น) ดำเนิน 100 kV ภาพ TEM ถูกวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ Analysis® (ระบบภาพนุ่ม Megaview III มุนสเตอร์ เยอรมนี)5.2. เปปไทด์สังเคราะห์และทำให้บริสุทธิ์แต่ละวัคซีนโครงสร้าง (1 – 5 รูปที่ 1), J14 และ Q11 ถูกสังเคราะห์ pMBHA เรซิน (0.28 โมลของ NH2g−1, 0.2 โมลสเกล) โดยใช้ไมโครเวฟช่วย (70 ° C, 20 W) การสังเคราะห์เปปไทด์ของเฟสของแข็งกับ HATU N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) ผ่านเคมี Boc ตามรายงาน 2-(tert-butoxycarbonylamino)-d, l hexadecanoic กรด (Boc C16 OH) ถูกสังเคราะห์ตามโพรโทคอล elsewhere.5 อธิบายต่อรอบประกอบด้วย deprotection ของกลุ่ม Boc (2 × 1 นาทีการรักษา ด้วย TFA), DMF ไหลล้าง และข้อต่อด้วย 41 preactivated กรดอะมิโน (สอง 5 และ 10 นาที) กรดอะมิโน (0.64 โมล 4.2 equiv) ละลายใน 0.5 M HATU/DMF โซลูชัน (1 mL, 4.0 equiv) ตามด้านนอกของ DIPEA (110 μL, 0.68 โมล 6.2 equiv) จะเปิดใช้งาน แต่ละโครงสร้างวัคซีน (เปปไทด์) ถูก acetylated ขอที่ N terminus มีส่วนผสมของอะซิติกด (0.5 mL, 5.29 mmol) และ DIPEA (0.5 mL, 2.70 mmol) ในโหมด DMF (9 mL) เปปไทด์ได้ถูกแบ่งออกจากเรซิ โดยรักษาด้วย HF.41 ไดเปปไทด์ได้บริสุทธิ์ โดย RP HPLC กราบนคอลัมน์ C18 หรือ C4 แยกสำเร็จอิงไล่ 0.1% TFA/H2O (ตัวทำละลาย A) และ 90% acetonitrile/0.1% TFA/H2O (ตัวทำละลาย B) มากกว่า 60 นาที ความบริสุทธิ์ (> 95%) และข้อมูลเฉพาะตัวของสารที่ได้รับการยืนยัน โดย RP HPLC และ ESI MS เปปไทด์ lypophilized ถูกเก็บไว้ที่ −20 ° C จนกว่าจะใช้เพิ่มเติม5.2.1. วัคซีนสร้าง 1ผลผลิต: 28% น้ำหนักโมเลกุล: 5832.8 [M + 3H] 3 + m/z 1945.9 (คำนวณ 1945.3), [M + 4H] 4 + m/z 1459.5 (คำนวณ 1459.2) [M + 5H] 5 + m/z 1168.0 (คำนวณ 1167.6) [M + 6H] 6 + m/z 974.0 (คำนวณ 973.1) tR = 29.05 นาที (0 – 100% ตัวทำละลาย B C4)5.2.2. วัคซีนสร้าง 2ผลผลิต: 30% น้ำหนักโมเลกุล: 5405.2 [M + 3H] 3 + m/z 1802.6 (คำนวณ 1802.7), [M + 4H] 4 + m/z 1352.6 (คำนวณ 1352.3) [M + 5H] 5 + m/z 1082.2 (คำนวณ 1082.0) [M + 6H] 6 + m/z 902.2 (คำนวณ 901.9) tR = 22.97 นาที 23.3 นาที (0 – 100% ตัวทำละลาย B C4)5.2.3. วัคซีนสร้าง 3ผลผลิต: 24% น้ำหนักโมเลกุล: 5154.0 [M + 3H] 3 + m/z 1718.2 (คำนวณ 1719.0), [M + 4H] 4 + m/z 1289.5 (คำนวณ 1289.5) [M + 5H] 5 + m/z 1031.8 (คำนวณ 1032.0) [M + 6H] 6 + m/z 859.7 (คำนวณ 860.0) tR = 19.99 นาที (0 – 100% ตัวทำละลาย B C18)5.2.4. วัคซีนสร้าง 4ผลผลิต: 28% น้ำหนักโมเลกุล: 4076.9 [M + 3H] 3 + m/z 1358.8 (คำนวณ 1359.9), [M + 4H] 4 + m/z 1020.6 (คำนวณ 1020.2) [M + 5H] 5 + m/z 816.7 (คำนวณ 816.4) [M + 6H] 6 + m/z 681.1 (คำนวณ 680.5) tR = 29.62 นาที 29.80 นาที (0 – 100% ตัวทำละลาย B C4)5.2.5 การวัคซีนสร้าง 5ผลผลิต: 22% น้ำหนักโมเลกุล: 3649.3 [M + 3H] 3 + m/z 1218.2 (คำนวณ 1217.4), [M + 4H] 4 + m/z 913.6 (คำนวณ 913.3) [M + 5H] 5 + m/z 731.5 (คำนวณ 730.9) [M + 6H] 6 + m/z 609.9 (คำนวณ 609.2) tR = 23.90 นาที 24.19 นาที (0 – 100% ตัวทำละลาย B C4)5.2.6. J14ผลผลิต: 55% น้ำหนักโมเลกุล: 3354.6 [M + 3H] 3 + m/z 1118.9 (คำนวณ 1119.2), [M + 4H] 4 + m/z 839.6 (คำนวณ 839.7) [M + 5H] 5 + m/z 671.4 (คำนวณ 671.9) [M + 6H] 6 + m/z 559.8 (คำนวณ 560.1) tR

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

5. วัสดุและวิธีการ
5.1 วัสดุ

ป้องกันกรดอะมิโน L-และเรซิน pMBHA ที่ซื้อมาจาก Novabiochem (Laufelfingen วิตเซอร์แลนด์) และ Mimotopes (เมลเบิร์นออสเตรเลีย) เปปไทด์สังเคราะห์เกรดไดคลอโรมีเทน (DCM), เมทานอล, N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) 1- [ทวิ (dimethylamino) เมทิลีน] -1H-1,2,3-triazolo [4,5-B] pyridinium 3 OXID hexafluorophosphate (Hatu) และกรด TRIFLUOROACETIC (TFA) ที่ซื้อมาจากเมอร์ค (Hohenbrunn, เยอรมนี) ตัวทำละลายสำหรับ HPLC (acetonitrile (MeCN)) ที่ได้รับจาก Labscan (กรุงเทพฯ, ประเทศไทย) น้ำยาอื่น ๆ ทั้งหมดกำลังซื้อที่มีความบริสุทธิ์พร้อมใช้งานจาก Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, ออสเตรเลีย) ไมโครเวฟช่วย Boc SPPS ถูกดำเนินการโดยใช้โหมด SPS CEM ค้นพบเครื่องปฏิกรณ์ (CME คอร์ปอเรชั่นแมตทิวส์, สหรัฐอเมริกา) ความแตกแยก HF ได้ดำเนินการโดยใช้เครื่องมือ HF Kel-F (เปปไทด์สถาบันโอซาก้าประเทศญี่ปุ่น) ESI-MS ได้ดำเนินการโดยใช้เครื่องมือ API3000 เพอร์กินเอลเมอ-Sciex กับนักวิเคราะห์ 1.4 (AppliedBiosystems / MDS Sciex, โตรอนโต, แคนาดา) วิเคราะห์ RP-HPLC ได้ดำเนินการในตราสาร Agilent กับ 1 มิลลิลิตรอัตรานาที 1 มีการตรวจสอบการไหลของสารที่ 214 นาโนเมตร แยกก็ประสบความสำเร็จโดยการเรียกใช้โหมดการไล่ระดับสีของ 0-100% B ตัวทำละลาย (90% MeCN / 0.1% TFA) กว่า 40 นาทีกับตัวทำละลาย (0.1% TFA / H2O) โดยใช้ทั้ง Vydac คอลัมน์วิเคราะห์ C4 (214TP54 5 ไมครอน 4.6 × 250 มิลลิเมตร) หรือ Vydac คอลัมน์ C18 วิเคราะห์ (218TP54 5 ไมครอน 4.6 × 250 มิลลิเมตร) เปปไทด์บริสุทธิ์ได้รับการดำเนินการโดยใช้เตรียม RP-HPLC ใช้น้ำเดลต้า 600 ระบบที่มีมลนาที 1 อัตรา 10 มีการตรวจสอบการไหลของสารที่ 230 นาโนเมตร แยกก็ประสบความสำเร็จด้วยตัวทำละลาย A และ B เป็นตัวทำละลายในทั้ง Vydac คอลัมน์เตรียม C4 (214TP1022 10 ไมครอน, 22 × 250 มิลลิเมตร) หรือคอลัมน์ Vydac เตรียม C18 (218TP1022 10 ไมครอน, 22 × 250 มิลลิเมตร) ซีดีสเปกตรัมถูกวัดโดยใช้ spectropolarimeter JASCO J-710 ขนาดถูกนำมาวิเคราะห์ผ่านเครื่องมือ Zetasizer Nano ZP (เวิร์นตราสารสหราชอาณาจักร) ผ่านซอฟต์แวร์ DTS กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนถูกดำเนินการโดยใช้ JEM-1010 ส่งกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (JEOL จำกัด ญี่ปุ่น) ดำเนินการใน 100 กิโลโวลต์ ภาพ TEM ถูกนำมาวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์Analysis® (ซอฟท์ Imaging Systems, MegaView III, มอนสเตอร์, เยอรมนี).

5.2 การสังเคราะห์เปปไทด์และการทำให้บริสุทธิ์

แต่ละสร้างวัคซีน (1-5 มะเดื่อ. 1), J14 และ Q11 ถูกสังเคราะห์บน pMBHA เรซิน (0.28 มิลลิโมลของ NH2g-1, 0.2 มิลลิโมลโย) โดยใช้ไมโครเวฟช่วย (70 ° C, 20 วัตต์) ที่เป็นของแข็ง การสังเคราะห์เปปไทด์เฟสกับ Hatu / N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) ผ่าน Boc เคมีตามที่รายงานก่อนหน้านี้ 41 2- (tert-butoxycarbonylamino) -d กรด L-hexadecanoic (Boc-C16-OH) ถูกสังเคราะห์ตามโปรโตคอลที่อธิบายไว้รอบ Coupling elsewhere.5 ประกอบด้วย deprotection ของกลุ่ม Boc (2 × 1 รักษานาที TFA) ล้างไหล DMF แล้วข้อต่อที่มีกรดอะมิโน Preactivated (สองครั้งที่ 5 และ 10 นาที) กรดอะมิโน (0.64 มิลลิโมล, 4.2 equiv) ถูกละลายในการแก้ปัญหา 0.5 M Hatu / กรมเชื้อเพลิงธรรมชาติ (1 มิลลิลิตร 4.0 equiv) ตามด้วยนอกเหนือจาก DIPEA (110 ไมโครลิตร, 0.68 มิลลิโมล, 6.2 equiv) ที่จะเปิดใช้งาน แต่ละคนสร้างวัคซีน (เปปไทด์) คือ acetylated ที่ N-ปลายทางที่มีส่วนผสมของแอนไฮไดอะซิติก (0.5 มิลลิลิตร 5.29 มิลลิโมล) และ DIPEA (0.5 มิลลิลิตร 2.70 มิลลิโมล) ในกรมเชื้อเพลิงธรรมชาติ (9 มิลลิลิตร) เปปไทด์ที่ถูกตัดจากเรซินโดยการรักษาด้วยปราศจาก HF.41 เปปไทด์บริสุทธิ์โดยเตรียม RP-HPLC ได้ทั้ง C18 หรือคอลัมน์ C4 แยกก็ประสบความสำเร็จขึ้นอยู่กับโหมดการไล่ระดับ 0.1% TFA / H2O (ตัวทำละลาย) และ 90% acetonitrile / 0.1% TFA / H2O (ตัวทำละลาย B) กว่า 60 นาที ความบริสุทธิ์ (> 95%) และตัวตนของสารประกอบที่ได้รับการยืนยันโดย RP-HPLC และ ESI-MS เปปไทด์ lypophilized ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสจนใช้งานต่อไป.

5.2.1 วัคซีนสร้าง 1

อัตราผลตอบแทน 28% น้ำหนักโมเลกุล: 5,832.8 [M + 3H] 3 + m / z 1945.9 (calcd 1,945.3) [M + 4H] 4 + m / z 1459.5 (calcd 1,459.2) [M + 5H] 5 + m / z 1168.0 (calcd 1,167.6) [M + 6H] 6 + m / z 974.0 (973.1 calcd) TR = 29.05 นาที (0-100% B ตัวทำละลาย; C4).

5.2.2 วัคซีนสร้าง 2

อัตราผลตอบแทน 30% น้ำหนักโมเลกุล: 5,405.2 [M + 3H] 3 + m / z 1802.6 (calcd 1,802.7) [M + 4H] 4 + m / z 1352.6 (calcd 1,352.3) [M + 5H] 5 + m / z 1082.2 (calcd 1,082.0) [M + 6H] 6 + m / z 902.2 (901.9 calcd) TR = 22.97 นาที, 23.3 นาที (0-100% B ตัวทำละลาย; C4).

5.2.3 วัคซีนสร้าง 3

อัตราผลตอบแทน 24% น้ำหนักโมเลกุล: 5,154.0 [M + 3H] 3 + m / z 1718.2 (calcd 1,719.0) [M + 4H] 4 + m / z 1289.5 (calcd 1,289.5) [M + 5H] 5 + m / z 1031.8 (calcd 1,032.0) [M + 6H] 6 + m / z 859.7 (860.0 calcd) TR = 19.99 นาที (0-100% B ตัวทำละลาย; C18).

5.2.4 วัคซีนสร้าง 4

อัตราผลตอบแทน 28% น้ำหนักโมเลกุล: 4,076.9 [M + 3H] 3 + m / z 1358.8 (calcd 1,359.9) [M + 4H] 4 + m / z 1020.6 (calcd 1,020.2) [M + 5H] 5 + m / z 816.7 (816.4 calcd) [M + 6H] 6 + m / z 681.1 (680.5 calcd) TR = 29.62 นาที 29.80 นาที (0-100% B ตัวทำละลาย; C4).

5.2.5 วัคซีนสร้าง 5

อัตราผลตอบแทน 22% น้ำหนักโมเลกุล: 3,649.3 [M + 3H] 3 + m / z 1218.2 (calcd 1,217.4) [M + 4H] 4 + m / z 913.6 (913.3 calcd) [M + 5H] 5 + m / z 731.5 (730.9 calcd) [M + 6H] 6 + m / z 609.9 (609.2 calcd) TR = 23.90 นาที 24.19 นาที (0-100% B ตัวทำละลาย; C4).

5.2.6 J14

Yield: 55% น้ำหนักโมเลกุล: 3,354.6 [M + 3H] 3 + m / z 1118.9 (calcd 1,119.2) [M + 4H] 4 + m / z 839.6 (839.7 calcd) [M + 5H] 5 + m / z 671.4 (671.9 calcd) [M + 6H] 6 + m / z 559.8 (560.1 calcd) TR