C472-80-12AG). For GCaMP3.0, Arclig

C472-80-12AG). For GCaMP3.0, Arclight, and SpH imaging, we used the following filter set (Chroma
Technology, Bellows Falls, VT): excitation, HQ470/x40; dichroic, Q495LP; emission, HQ525/50m. For
EPAC and SuperClomeleon, a 86002v1 JP4 (436; Chroma Technology) excitation filter was used,
and emitted light from the CFP and YFP flurophores was separated using a splitter (Photometrics
DV2
column) with the emissions filters D480/30m and D535/40m (Photometrics, Tucson, AZ), which
allowed for simultaneous collection from both fluorescence channels. Frames were captured at 2 Hz
with 4× binning for either 2 min or 4 min using µManager acquisition software (Edelstein et al., 2010).
Neutral density filters (Chroma Technology) were used for all experiments to reduce light intensity to
limit photobleaching.
Although there are tools for temporally controlled activation such as dTrpA1 or Channelrhodopsin
(ChR2) that are well-characterized, we utilized P2X2 receptors for the majority of our experiments.
Activation wavelengths for ChR2 overlap with those of many fluorescent sensors such as GCaMP and
EPAC, so ChR2 could not be used in this circuit due to the close proximity of the cells and processes.
Applying heat to activate dTrpA1 causes changes in refractive index, which disrupt focus, necessitating
manual focus correction in the cases where we used this technique.
Regions of interest (ROIs) were selected within the horizontal or vertical lobes of the MBs or, in the
case of DPM neurons, over the horizontal projections to the MBs. Figures depict responses in horizontal
lobes or projections; however, similar results were observed in the vertical lobes when noted in
the figure captions. For recordings using GCaMP3.0, Arclight, and SpH, ROIs were analyzed using
custom software developed in ImageJ (Schindelin et al., 2012 and National Institute of Health,
Bethesda, MD). Briefly, the percent change in fluorescence over time was calculated using the following
formula: ΔF/F = (Fn – F0)/F0 × 100%, where Fn is the fluorescence at time point n, and F0 is the fluorescence
at time 0. For GCaMP3.0 and SpH, maximum fluorescence change values were determined as
the maximum percentage change observed for each trace over the entire duration of each imaging
experiment. For Arclight, because increases in voltage are represented as decreases in fluorescence,
maximum fluorescence change values were determined as the minimum percentage change. Maximum
values for each group were then averaged to calculate the mean maximum change from baseline.
For recordings using EPAC or SuperClomeleon, ROIs were analyzed using custom software developed
in MATLAB (The MathWorks, Natick, MA). This analysis package is provided in Source Code 1.
Briefly, identical ROIs were selected from both the CFP and YFP emissions channels, and the fluorescence
resonance energy transfer (FRET) signal (YFP/CFP ratio) was calculated for each time point and
normalized to the ratio of the first time point. The relative cAMP changes were determined by plotting
the normalized CFP/YFP ratio (percentage) over time. As with GCaMP3.0 and SpH, the average maximum
percent change values were determined as the mean maximum values for each group.
Statistical analyses were performed using MATLAB (The MathWorks). A Kruskal–Wallis one-way
ANOVA was used to determine statistical significance between the experimental group and the two
negative controls. In cases in which there was significance in the ANOVA, a Mann–Whitney U test (also
known as Wilcoxon rank-sum test) was used to determine the significance between the experimental
group and each negative control. In all figures only the most conservative/numerically greatest p value
is reported. Results are expressed as means + standard error of the mean (SEM).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

C472-80-12AG) GCaMP3.0, Arclight และ SpH ภาพ เราใช้ชุดตัวกรองต่อไปนี้ (ความเทคโนโลยี เครื่องเป่าลมน้ำตก VT): ในการกระตุ้น HQ470/x 40 dichroic, Q495LP มลพิษ HQ525 / 50m สำหรับEPAC และ SuperClomeleon, 86002v1 JP4 (436 ใช้ตัวกรองในการกระตุ้นความเทคโนโลยี)และแสงที่เปล่งออกมาจาก flurophores CFP และ YFP ถูกแยกโดยใช้ตัวแยก (PhotometricsDV2 คอลัมน์ตัวกรองไอเสีย D480 30 m และ D535/40 m (Photometrics ทูซอน AZ), ซึ่งอนุญาตสำหรับคอลเลกชันพร้อมกันทั้งสองช่อง fluorescence เฟรมถูกจับที่ 2 Hzกับ 4 × binning นาทีทั้ง 2 หรือ 4 นาทีใช้ µManager ซื้อซอฟต์แวร์ (Edelstein et al., 2010)ตัวกลาง (ความเทคโนโลยี) ใช้สำหรับการทดลองทั้งหมดเพื่อลดความเข้มแสงให้จำกัด photobleachingแม้ว่าจะมีเครื่องมือสำหรับการเรียกใช้ temporally ควบคุมเช่น dTrpA1 หรือ Channelrhodopsin(ChR2) ที่มีห้องพัก characterized เราใช้ P2X2 receptors สำหรับส่วนใหญ่ของการทดลองของเราความยาวคลื่นที่เปิดใช้งานสำหรับ ChR2 เหลื่อมกับเซนเซอร์เรืองแสงมากเช่น GCaMP และEPAC จึงไม่สามารถใช้ ChR2 ในวงจรนี้เนื่องจากใกล้ของเซลล์และกระบวนการความร้อนที่ใช้เพื่อเรียกใช้ dTrpA1 สาเหตุการเปลี่ยนแปลงในดรรชนี ซึ่งรบกวนความ necessitatingการแก้ไขความด้วยตนเองในกรณีที่เราใช้เทคนิคนี้เลือกภูมิภาคของดอกเบี้ย (ROIs) ภายในแบบแนวนอน หรือแนวตั้งกลีบ ของ MBs หรือ ในการกรณีของ neurons DPM ผ่านประมาณแนว MBs. ตัวเลขแสดงถึงการตอบสนองในแนวนอนกลีบหรือประมาณ อย่างไรก็ตาม มีผลคล้ายสุภัคในกลีบแนวตั้งเมื่อในคำอธิบายรูป สำหรับการบันทึกที่ใช้ GCaMP3.0, Arclight และ SpH, ROIs ได้วิเคราะห์โดยใช้พัฒนาซอฟท์แวร์ใน ImageJ (Schindelin et al. สถาบันสุขภาพ 2012 และชาติเบเทสดา MD) สั้น ๆ การเปลี่ยนแปลงเปอร์เซ็นต์ fluorescence เวลาคำนวณใช้ต่อไปนี้สูตร: ΔF/F = (Fn-F0) / F0 × 100% ที่ Fn fluorescence ที่เวลาจุด n และ F0 fluorescence ที่ที่เวลา 0 GCaMP3.0 และ SpH, fluorescence สูงสุดเปลี่ยนแปลงค่าถูกกำหนดเป็นการเปลี่ยนแปลงเปอร์เซ็นต์สูงสุดที่สังเกตสำหรับแต่ละติดตามตลอดช่วงทั้งหมดของแต่ละภาพการทดลอง สำหรับ Arclight เนื่องจากการเพิ่มขึ้นของแรงดันไฟฟ้าจะแสดง เป็นลดใน fluorescenceค่าเปลี่ยน fluorescence สูงสุดถูกกำหนดเป็นการเปลี่ยนแปลงเปอร์เซ็นต์ต่ำสุด มากที่สุดค่าสำหรับแต่ละกลุ่มได้แล้ว averaged เพื่อคำนวณการเปลี่ยนแปลงสูงสุดเฉลี่ยจากพื้นฐานสำหรับการบันทึกใช้ EPAC หรือ SuperClomeleon, ROIs ได้วิเคราะห์โดยใช้ซอฟท์แวร์ที่พัฒนาขึ้นใน MATLAB (MathWorks, Natick, MA) แพคเกจนี้วิเคราะห์ไว้ในรหัสแหล่งที่มาสั้น ๆ เลือกจากช่องปล่อย CFP และ YFP และการ fluorescence ROIs เหมือนกันการสั่นพ้องพลังงานโอนย้าย (ไม่สบายใจ) สัญญาณ (อัตราส่วน YFP/CFP) ถูกคำนวณสำหรับแต่ละจุดเวลา และตามปกติอัตราส่วนของจุดครั้งแรก เปลี่ยนแปลงค่ายสัมพันธ์ถูกกำหนด โดยพล็อตมาตรฐาน CFP/YFP อัตราส่วน (เปอร์เซ็นต์) ช่วงเวลา เช่นเดียวกับ GCaMP3.0 และ SpH สูงสุดเฉลี่ยเปอร์เซ็นต์การเปลี่ยนแปลงถูกกำหนดค่าสูงสุดค่าเฉลี่ยสำหรับแต่ละกลุ่มวิเคราะห์ทางสถิติได้ดำเนินการโดยใช้ MATLAB (เดอะ MathWorks) เป็น Kruskal – วาลลิทางเดียวใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนเพื่อกำหนดนัยสำคัญทางสถิติระหว่างกลุ่มทดลองและสองควบคุมค่าลบ ในกรณีที่มีความสำคัญในการวิเคราะห์ความแปรปรวน U มานน์ – วิทนีย์ (ยังทดสอบหรือที่เรียกว่าทดสอบ Wilcoxon อันดับรวม) ถูกใช้เพื่อกำหนดความสำคัญระหว่างการทดลองกลุ่มและตัวควบคุมแต่ละค่าลบ ในตัวเลขเฉพาะส่วนใหญ่ความคิดอนุรักษ์นิยม/เรียงตามตัวเลขมูลค่าสูงสุด pมีรายงาน ผลลัพธ์จะแสดงเป็นหมายถึง + ข้อผิดพลาดมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (SEM)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

C472-80-12AG) สำหรับ GCaMP3.0, Arclight และการถ่ายภาพ SPH เราใช้ชุดกรองต่อไป (Chroma
เทคโนโลยี Bellows Falls, VT): กระตุ้น HQ470 / x40; dichroic, Q495LP; ปล่อย HQ525 / 50 สำหรับ
EPAC และ SuperClomeleon, 86002v1 JP4 (436; Chroma เทคโนโลยี) ตัวกรองกระตุ้นถูกนำมาใช้
และปล่อยออกมาแสงจาก CFP และ YFP flurophores ถูกแยกออกโดยใช้ตัวแยก (Photometrics
DV2
คอลัมน์) ที่มีการปล่อยก๊าซเรือนกระจกกรอง D480 / D535 และ 30m / 40m ( Photometrics, Tucson, AZ) ซึ่ง
ได้รับอนุญาตให้คอลเลกชันพร้อมกันจากทั้งช่องเรืองแสง เฟรมถูกจับที่ 2 เฮิร์ตซ์
กับ 4 × binning ทั้ง 2 นาทีหรือ 4 นาทีโดยใช้ซอฟแวร์เข้าซื้อกิจการμManager (Edelstein et al., 2010).
กรองความหนาแน่นเป็นกลาง (Chroma เทคโนโลยี) ถูกนำมาใช้สำหรับการทดลองทั้งหมดเพื่อลดความเข้มของแสงที่จะ
จำกัด การ photobleaching
แม้ว่าจะมีเครื่องมือสำหรับการควบคุมการเปิดใช้งานชั่วคราวเช่น dTrpA1 หรือ Channelrhodopsin
(ChR2) ที่มีลักษณะที่ดีที่เรานำมาใช้รับ P2X2 สำหรับส่วนใหญ่ของการทดลองของเรา.
ความยาวคลื่นการเปิดใช้งานสำหรับ ChR2 ทับซ้อนกับผู้ที่เรืองแสงของเซ็นเซอร์หลายอย่างเช่น GCaMP และ
EPAC, ดังนั้น ChR2 ไม่สามารถนำมาใช้ในวงจรนี้เนื่องจากใกล้ชิดของเซลล์และกระบวนการ.
ใช้ความร้อนเพื่อเปิดใช้งาน dTrpA1 ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในดัชนีการหักเหของแสงที่รบกวนการโฟกัสทั้งนี้
การแก้ไขโฟกัสด้วยตนเองในกรณีที่เราใช้เทคนิคนี้.
ภูมิภาคของประเทศ ที่น่าสนใจ (ROIs) ได้รับการคัดเลือกภายในแฉกแนวนอนหรือแนวตั้งของ MBs หรือใน
กรณีของเซลล์ประสาท DPM กว่าประมาณการแนวนอนเพื่อ MBs แสดงให้เห็นถึงการตอบสนองตัวเลขในแนวนอน
หรือก้อนประมาณการ; แต่ผลที่คล้ายกันถูกตั้งข้อสังเกตในแฉกแนวตั้งเมื่อที่ระบุไว้ใน
คำอธิบายภาพ สำหรับการบันทึกการใช้ GCaMP3.0, Arclight และ SPH, ROIs ถูกวิเคราะห์โดยใช้
ซอฟแวร์ที่กำหนดเองการพัฒนาใน ImageJ (Schindelin et al., 2012 และสถาบันสุขภาพแห่งชาติ,
Bethesda, MD) สั้น ๆ , การเปลี่ยนแปลงร้อยละในการเรืองแสงในช่วงเวลาที่คำนวณได้ใช้ต่อไปนี้
สูตร: ΔF / F = (Fn - F0) / F0 × 100% ซึ่งเป็น Fn เรืองแสงในเวลา n จุดและ F0 เป็นเรืองแสง
ในเวลา 0 สำหรับ GCaMP3.0 และ SPH เปลี่ยนแปลงเรืองแสงสูงสุดค่าถูกกำหนดเป็น
อัตราการเปลี่ยนแปลงสูงสุดสังเกตร่องรอยแต่ละช่วงระยะเวลาทั้งหมดของแต่ละภาพ
การทดลอง สำหรับ Arclight เนื่องจากการเพิ่มขึ้นของแรงดันไฟฟ้าที่จะแสดงเป็นลดลงในการเรืองแสง,
เรืองแสงการเปลี่ยนแปลงค่าสูงสุดได้รับการพิจารณาเป็นอัตราการเปลี่ยนแปลงขั้นต่ำ สูงสุด
ค่าสำหรับแต่ละกลุ่มได้รับเฉลี่ยแล้วในการคำนวณค่าเฉลี่ยการเปลี่ยนแปลงสูงสุดจาก baseline.
สำหรับการบันทึกการใช้ EPAC หรือ SuperClomeleon, ROIs ถูกวิเคราะห์โดยใช้ซอฟแวร์ที่กำหนดเองได้รับการพัฒนา
ใน MATLAB (MathWorks, เนติ, MA) แพคเกจการวิเคราะห์นี้จะอยู่ใน Source Code 1.
สั้น ๆ , ROIs เหมือนกันได้รับการคัดเลือกจากทั้ง CFP และ YFP ช่องปล่อยก๊าซเรือนกระจกและการเรืองแสง
การถ่ายโอนพลังงานเสียงสะท้อน (ฉลุ) สัญญาณ (YFP / อัตราส่วน CFP) ที่คำนวณได้สำหรับแต่ละจุดเวลาและ
ปกติ อัตราส่วนของจุดครั้งแรกที่ การเปลี่ยนแปลงที่ค่ายญาติได้รับการพิจารณาโดยวางแผน
อัตราส่วน CFP / YFP ปกติ (ร้อยละ) เมื่อเวลาผ่านไป เช่นเดียวกับ GCaMP3.0 และ SPH สูงสุดเฉลี่ย
ร้อยละค่าการเปลี่ยนแปลงที่ถูกกำหนดเป็นค่าเฉลี่ยสูงสุดสำหรับแต่ละกลุ่ม.
การวิเคราะห์ทางสถิติได้ดำเนินการโดยใช้ MATLAB (MathWorks) Kruskal-Wallis ทางเดียว
ANOVA ถูกใช้ในการตรวจสอบอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติระหว่างกลุ่มทดลองและสอง
การควบคุมเชิงลบ ในกรณีที่มีความสำคัญในการวิเคราะห์การทดสอบ Mann-Whitney U (หรือ
ที่รู้จักกันในการทดสอบ Wilcoxon อันดับผลรวม) ถูกใช้ในการตรวจสอบอย่างมีนัยสำคัญระหว่างการทดลอง
กลุ่มและแต่ละควบคุมเชิงลบ ในตัวเลขทั้งหมดเพียงอนุรักษ์นิยมมากที่สุด / ที่ยิ่งใหญ่ที่สุดตัวเลขค่าพี
รายงาน ผลการค้นหาจะแสดงเป็นวิธี + ข้อผิดพลาดมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (SEM)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

c472-80-12ag ) สำหรับ gcamp3.0 arclight , และเวลาถ่ายภาพ เราใช้ชุดกรองต่อไปนี้ ( Chroma
เทคโนโลยีเครื่องสูบลมตก , VT ) : กระตุ้น hq470 x40 dichroic , / , ; q495lp ; การปล่อย hq525 / 50m .
และ epac superclomeleon , 86002v1 jp4 ( 436 ; Chroma เทคโนโลยีระบบกรองใช้
และ แสงที่ปล่อยออกมาจาก CFP และ yfp flurophores แยกใช้ Splitter ( photometrics

dv2