- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
General ELISPOT procedurePrepare PV
General ELISPOT procedure
Prepare PVDF membranes in the 96-well plates by incubating in 35% ethanol for 30 s.
Ensure the ethanol is completely removed by washing thoroughly with PBS. Any remaining ethanol can affect cell viability, as well as antibody binding.
Coat 96-well plate with capture antibody diluted in phosphate buffered saline (PBS). Incubate overnight at 4°C.
Approximately 0.5–1 µg per well of antibody should be used for well-defined spots. Kits are optimized with capture concentrations for best performance (100 µl per well).
Empty the wells, tapping them dry, and wash with PBS.
ELISPOT plates are more delicate than ELISA plates and should be handled with care. When tapping dry, do so gently. Do NOT use a plate washer at this stage.
Add 100 µl per well 2% dry skim milk to block non-specific binding to the membrane. Incubate the plate for 2 h at room temperature.
Wash the plate 3 times in PBS and leave to dry. If necessary, the plates can be stored at this stage. Store at 4°C for not more than 2 weeks, in a sealed plastic pouch with desiccant.
Prepare peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from fresh blood using a Ficoll™ gradient. Count the cells using a viability dye like trypan blue. They should be over 95% viable. Dilute cells to the required concentration and add the cell suspension to wells. If optimizing the assay for cell number, use a 1:2 dilution series. Do not shake plates.
The number of cells per well should be optimized. For example, use more cells if a low percentage of cells are expected to secrete the target cytokine. Refer to the specific target kit protocols for recommendation on assay controls and cell number per well. Typically cell numbers should usually range from between 2x105 to 4x105 PBMC cells per well.
If possible, use serum-free media as serum contains many proteins which could affect the results. Alternatively, several batches of serum can be tested to find one with optimal response to noise ratio. This batch can then be stored and used in subsequent experiments.
Culture overnight at 37°C in CO2 incubator. Do not shake the plates.
Do not move the plates while the cells are culturing. This will lead to 'snail trail' spots that will not be well defined. Don't stack the plates if you have more than one to prevent edge effects
During the overnight incubation the cells will secrete cytokine, which will bind to the primary antibody.
If cells take time to respond to stimulation, please see indirect method below.
Wash away the cells and the unbound cytokine by incubating with PBS 0.1% Tween 20 for 10 min.
Ensure you include Tween 20 in the wash buffer. Some cells will have started attaching after culture overnight (e.g. some stem cells are known to do this). Tween 20 will help wash these off the membrane. Do not use a plate washer at this stage.
Dilute the conjugated detection antibody in PBS 1% BSA. Add to wells and incubate for 1–2 h at room temperature (the incubation time may require optimization). Wash plate 3 times with PBS 0.1% Tween 20 to remove non-specific detection antibody binding.
For our ELISPOT kits, detection antibody concentrations have been optimized for best results.
Add the conjugated detection antibody. Dilute the antibody in PBS 1% BSA. Incubate for 1–2 h at room temperature (the incubation time may require optimization). Wash plate 3 times with PBS 0.1% Tween 20 to remove non-specific detection antibody binding.
Add the enzyme substrate solution to each well.
For enzymatic detection protocols, the base should be taken off the bottom of the plate to enable thorough washing of the membrane before adding substrate/chromogen. For example, after incubation with the streptavidin alkaline phosphatase conjugate, remove the base and wash both sides of the membrane under running distilled water. This helps to prevent high background as some reagents can leak through the membrane into the bottom tray of the plate.
After replacing the base and adding the substrate, carefully monitor spot formation. Stop the reaction by gently washing the plate with PBS 0.1% Tween 20 once development appears to slow. Take the base off the plates and wash both sides of the membrane with distilled water to stop the spot formation.
Dry the plates and allow the membranes to dry at room temperature.
Spots may become sharper if membranes are stored overnight at 4°C, and may continue to improve for up to 2 weeks. If storing, wrap membranes can be wrapped in foil, keep at 4°C.
Punch the membranes out of the wells onto a sticky plastic sheet. This step will depend on your reader's requirements. Consult the reader manual.
Measure the sheet and analyze the membrane circles.
In the analysis software, set the following parameters for measurement:
Size/spot diameter
Intensity/saturation
Circularity/shape
Spot development/slope
These parameters can be saved and used for subsequent experiments for standardized results.
We recommend reading each plate 3 times
Prepare PVDF membranes in the 96-well plates by incubating in 35% ethanol for 30 s.
Ensure the ethanol is completely removed by washing thoroughly with PBS. Any remaining ethanol can affect cell viability, as well as antibody binding.
Coat 96-well plate with capture antibody diluted in phosphate buffered saline (PBS). Incubate overnight at 4°C.
Approximately 0.5–1 µg per well of antibody should be used for well-defined spots. Kits are optimized with capture concentrations for best performance (100 µl per well).
Empty the wells, tapping them dry, and wash with PBS.
ELISPOT plates are more delicate than ELISA plates and should be handled with care. When tapping dry, do so gently. Do NOT use a plate washer at this stage.
Add 100 µl per well 2% dry skim milk to block non-specific binding to the membrane. Incubate the plate for 2 h at room temperature.
Wash the plate 3 times in PBS and leave to dry. If necessary, the plates can be stored at this stage. Store at 4°C for not more than 2 weeks, in a sealed plastic pouch with desiccant.
Prepare peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from fresh blood using a Ficoll™ gradient. Count the cells using a viability dye like trypan blue. They should be over 95% viable. Dilute cells to the required concentration and add the cell suspension to wells. If optimizing the assay for cell number, use a 1:2 dilution series. Do not shake plates.
The number of cells per well should be optimized. For example, use more cells if a low percentage of cells are expected to secrete the target cytokine. Refer to the specific target kit protocols for recommendation on assay controls and cell number per well. Typically cell numbers should usually range from between 2x105 to 4x105 PBMC cells per well.
If possible, use serum-free media as serum contains many proteins which could affect the results. Alternatively, several batches of serum can be tested to find one with optimal response to noise ratio. This batch can then be stored and used in subsequent experiments.
Culture overnight at 37°C in CO2 incubator. Do not shake the plates.
Do not move the plates while the cells are culturing. This will lead to 'snail trail' spots that will not be well defined. Don't stack the plates if you have more than one to prevent edge effects
During the overnight incubation the cells will secrete cytokine, which will bind to the primary antibody.
If cells take time to respond to stimulation, please see indirect method below.
Wash away the cells and the unbound cytokine by incubating with PBS 0.1% Tween 20 for 10 min.
Ensure you include Tween 20 in the wash buffer. Some cells will have started attaching after culture overnight (e.g. some stem cells are known to do this). Tween 20 will help wash these off the membrane. Do not use a plate washer at this stage.
Dilute the conjugated detection antibody in PBS 1% BSA. Add to wells and incubate for 1–2 h at room temperature (the incubation time may require optimization). Wash plate 3 times with PBS 0.1% Tween 20 to remove non-specific detection antibody binding.
For our ELISPOT kits, detection antibody concentrations have been optimized for best results.
Add the conjugated detection antibody. Dilute the antibody in PBS 1% BSA. Incubate for 1–2 h at room temperature (the incubation time may require optimization). Wash plate 3 times with PBS 0.1% Tween 20 to remove non-specific detection antibody binding.
Add the enzyme substrate solution to each well.
For enzymatic detection protocols, the base should be taken off the bottom of the plate to enable thorough washing of the membrane before adding substrate/chromogen. For example, after incubation with the streptavidin alkaline phosphatase conjugate, remove the base and wash both sides of the membrane under running distilled water. This helps to prevent high background as some reagents can leak through the membrane into the bottom tray of the plate.
After replacing the base and adding the substrate, carefully monitor spot formation. Stop the reaction by gently washing the plate with PBS 0.1% Tween 20 once development appears to slow. Take the base off the plates and wash both sides of the membrane with distilled water to stop the spot formation.
Dry the plates and allow the membranes to dry at room temperature.
Spots may become sharper if membranes are stored overnight at 4°C, and may continue to improve for up to 2 weeks. If storing, wrap membranes can be wrapped in foil, keep at 4°C.
Punch the membranes out of the wells onto a sticky plastic sheet. This step will depend on your reader's requirements. Consult the reader manual.
Measure the sheet and analyze the membrane circles.
In the analysis software, set the following parameters for measurement:
Size/spot diameter
Intensity/saturation
Circularity/shape
Spot development/slope
These parameters can be saved and used for subsequent experiments for standardized results.
We recommend reading each plate 3 times
0/5000
ขั้นตอนทั่วไป ELISPOTเตรียม PVDF เยื่อในแผ่น 96 หลุม โดย incubating ใน 35% เอทานอล 30 sทำให้เอทานอลจะถูกเอาออก โดยให้สะอาดล้างด้วย PBS เอทานอลที่เหลือใด ๆ อาจส่งผลต่อชีวิตของเซลล์ เป็นแอนติบอดีรวม แผ่นตรา 96 หลุมกับแอนติบอดีจับเจือจางในฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (PBS) ฟักข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสประมาณ 0.5 – 1 µg ของแอนติบอดีต่อควรจะใช้จุดที่ดีที่กำหนด ชุดเหมาะกับความเข้มข้นในการจับภาพเพื่อประสิทธิภาพสูงสุด (100 µl ต่อ)ล้างบ่อ เคาะพวกเขาแห้ง และล้าง ด้วย PBS แผ่น ELISPOT มีความละเอียดอ่อนมากขึ้นกว่าแผ่น ELISA และควรจัดการ ด้วยความระมัดระวัง เมื่อแตะแห้ง ทำอย่างนุ่มนวล ใช้เครื่องซักผ้าแผ่นในขั้นตอนนี้เพิ่ม 100 µl ต่อดี 2% แห้งนมพร่องมันเนยเพื่อบล็อกไม่ใช่เฉพาะผูกกับเมมเบรน ฟักแผ่นสำหรับ 2 ชม.ที่อุณหภูมิห้องล้างจาน 3 ครั้งใน PBS และทิ้งไว้ให้แห้ง ถ้าจำเป็น แผ่นสามารถเก็บไว้ในขั้นตอนนี้ เก็บที่ 4° C ไม่เกิน 2 สัปดาห์ ในถุงพลาสติกปิดผนึกกับชื้นเตรียมเลือดเซลล์โลหิตโมโนนิวเคลียร์ (PBMCs) จากเลือดสดโดยใช้การไล่ระดับสี Ficoll™ นับจำนวนเซลล์ที่ใช้ย้อมมีศักยภาพเช่น trypan blue พวกเขาควรจะมากกว่า 95% ได้ เซลล์ความเข้มข้นที่ต้องเจือจาง และระงับเซลล์ลงในหลุม ถ้าเพิ่มประสิทธิภาพวิเคราะห์เลขเซลล์ ใช้ชุดเจือจาง 1:2 อย่าเขย่าแผ่นจำนวนเซลล์ต่อควรปรับให้เหมาะสม ตัวอย่าง ใช้เซลล์เพิ่มเติมหากเปอร์เซ็นต์ต่ำสุดของเซลล์จะต้องหลั่ง cytokine เป้าหมาย หมายถึงโพรโทคอชุดเป้าหมายที่เฉพาะเจาะจงสำหรับคำแนะนำการควบคุมทดสอบและจำนวนเซลล์ต่อ โดยปกติตัวเลขเซลล์ควรมักจะมีระหว่าง 2 x 10 5 4 x 105 เซลล์ PBMC ต่อ ถ้าเป็นไปได้ ใช้สื่อฟรีเซรั่มเป็นเซรั่มที่ประกอบด้วยโปรตีนจำนวนมากซึ่งอาจส่งผลต่อผลลัพธ์ อีกวิธีหนึ่งคือ สามารถทดสอบหลายชุดงานของเซรั่มเพื่อค้นหาคำตอบที่ดีที่สุดอัตราส่วนสัญญาณรบกวน ชุดนี้แล้วสามารถเก็บ และใช้ในการทดลองในเวลาต่อมาวัฒนธรรมที่ค้างคืนที่ 37° C ในตู้อบ CO2 ไม่สามารถจับจานย้ายแผ่นในขณะที่เซลล์จะนำไปเลี้ยง นี้จะนำไปสู่จุด 'เส้นทางของหอยทาก' ที่จะกำหนดไว้อย่างดี ไม่ซ้อนแผ่นถ้าคุณมีมากกว่าหนึ่งในการป้องกันผลกระทบขอบในระหว่างการบ่มข้ามคืน เซลล์จะหลั่ง cytokine ซึ่งจะผูกกับแอนติบอดีหลักถ้าเซลล์ที่ใช้เวลาในการตอบสนองต่อการกระตุ้น โปรดดูที่วิธีการทางอ้อมด้านล่างล้างเซลล์และ cytokine ผูก โดย incubating ด้วย PBS 0.1% แต่ 20 10 นาทีให้แน่ใจว่า คุณรวม 20 แต่ในล้างบัฟเฟอร์ เซลล์บางเซลล์จะมีการเริ่มต้นแนบหลังวัฒนธรรมข้ามคืน (เช่นสเต็มเซลล์บางอย่างทราบว่าการทำเช่นนี้) 20 แต่จะช่วยล้างเหล่านี้ปิดเมมเบรน ใช้เครื่องซักผ้าแผ่นในขั้นตอนนี้Dilute the conjugated detection antibody in PBS 1% BSA. Add to wells and incubate for 1–2 h at room temperature (the incubation time may require optimization). Wash plate 3 times with PBS 0.1% Tween 20 to remove non-specific detection antibody binding.For our ELISPOT kits, detection antibody concentrations have been optimized for best results.Add the conjugated detection antibody. Dilute the antibody in PBS 1% BSA. Incubate for 1–2 h at room temperature (the incubation time may require optimization). Wash plate 3 times with PBS 0.1% Tween 20 to remove non-specific detection antibody binding.Add the enzyme substrate solution to each well.For enzymatic detection protocols, the base should be taken off the bottom of the plate to enable thorough washing of the membrane before adding substrate/chromogen. For example, after incubation with the streptavidin alkaline phosphatase conjugate, remove the base and wash both sides of the membrane under running distilled water. This helps to prevent high background as some reagents can leak through the membrane into the bottom tray of the plate. After replacing the base and adding the substrate, carefully monitor spot formation. Stop the reaction by gently washing the plate with PBS 0.1% Tween 20 once development appears to slow. Take the base off the plates and wash both sides of the membrane with distilled water to stop the spot formation.Dry the plates and allow the membranes to dry at room temperature.
Spots may become sharper if membranes are stored overnight at 4°C, and may continue to improve for up to 2 weeks. If storing, wrap membranes can be wrapped in foil, keep at 4°C.
Punch the membranes out of the wells onto a sticky plastic sheet. This step will depend on your reader's requirements. Consult the reader manual.
Measure the sheet and analyze the membrane circles.
In the analysis software, set the following parameters for measurement:
Size/spot diameter
Intensity/saturation
Circularity/shape
Spot development/slope
These parameters can be saved and used for subsequent experiments for standardized results.
We recommend reading each plate 3 times
Spots may become sharper if membranes are stored overnight at 4°C, and may continue to improve for up to 2 weeks. If storing, wrap membranes can be wrapped in foil, keep at 4°C.
Punch the membranes out of the wells onto a sticky plastic sheet. This step will depend on your reader's requirements. Consult the reader manual.
Measure the sheet and analyze the membrane circles.
In the analysis software, set the following parameters for measurement:
Size/spot diameter
Intensity/saturation
Circularity/shape
Spot development/slope
These parameters can be saved and used for subsequent experiments for standardized results.
We recommend reading each plate 3 times
การแปล กรุณารอสักครู่..
ขั้นตอนทั่วไป ELISPOT
เตรียมเยื่อ PVDF ในแผ่น 96 หลุมโดยการบ่มในเอทานอล 35% เป็นเวลา 30 วินาที. ให้แน่ใจว่าเอทานอลจะถูกลบออกอย่างสมบูรณ์โดยการล้างให้สะอาดด้วยพีบีเอส เอทานอลที่เหลือใด ๆ จะมีผลต่อชีวิตของเซลล์เช่นเดียวกับแอนติบอดี้ที่มีผลผูกพัน. เสื้อจาน 96 หลุมที่มีแอนติบอดีจับเจือจางในฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (พีบีเอส) ฟักค้างคืนที่ 4 ° C. ประมาณ 0.5-1 ไมโครกรัมต่อกันดีของแอนติบอดีควรจะใช้สำหรับจุดที่ดีที่กำหนด ชุดจะเหมาะกับความเข้มข้นของการจับภาพสำหรับประสิทธิภาพที่ดีที่สุด (100 ไมโครลิตรต่อกัน). ล้างบ่อแตะให้แห้งและล้างด้วยพีบีเอส. แผ่น ELISPOT มีความละเอียดอ่อนมากขึ้นกว่าแผ่น ELISA และควรจะจัดการกับการดูแล เมื่อแตะแห้งทำเช่นนั้นเบา ๆ อย่าใช้เครื่องซักผ้าจานในขั้นตอนนี้. เพิ่ม 100 ไมโครลิตรต่อดีนมพร่องมันเนยแห้ง 2% เพื่อป้องกันไม่เฉพาะเจาะจงที่จะมีผลผูกพันเมมเบรน กกจานเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง. ล้างจาน 3 ครั้งในพีบีเอสและปล่อยให้แห้ง ถ้าจำเป็นแผ่นสามารถเก็บไว้ในขั้นตอนนี้ เก็บที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลาไม่เกิน 2 สัปดาห์ที่ผ่านมาในถุงพลาสติกปิดผนึกด้วยสารดูดความชื้น. เตรียมอุปกรณ์ต่อพ่วงเซลล์ในเลือดโมโนนิวเคลียร์ (PBMCs) จากเลือดสดโดยใช้การไล่ระดับสี Ficoll ™ นับเซลล์โดยใช้สีย้อมมีชีวิตเช่นสีฟ้า Trypan พวกเขาควรจะมากกว่า 95% ที่ทำงานได้ เจือจางเซลล์กับความเข้มข้นที่จำเป็นและเพิ่มเซลล์แขวนลอยเพื่อหลุม หากการเพิ่มประสิทธิภาพการทดสอบจำนวนเซลล์ใช้ 1: ชุดที่ 2 ลดสัดส่วน อย่าเขย่าแผ่น. จำนวนของเซลล์ต่อกันควรจะเพิ่มประสิทธิภาพ ตัวอย่างเช่นใช้เซลล์มากขึ้นถ้าต่ำร้อยละของเซลล์ที่คาดว่าจะหลั่งไซโตไคน์เป้าหมาย อ้างถึงโปรโตคอลชุดเป้าหมายที่เฉพาะเจาะจงสำหรับข้อเสนอแนะเกี่ยวกับการควบคุมการทดสอบและจำนวนเซลล์ต่อกัน โดยปกติจำนวนเซลล์มักจะควรมีตั้งแต่ระหว่าง 5 ถึง 2x10 4x105 เซลล์ PBMC ต่อกัน. ถ้าเป็นไปได้ใช้สื่อซีรั่มซีรั่มฟรีเป็นจำนวนมากมีโปรตีนซึ่งอาจส่งผลกระทบต่อผลการค้นหา อีกวิธีหนึ่งคือกระบวนการหลายของซีรั่มสามารถทดสอบได้ที่จะหาคนที่เหมาะสมกับการตอบสนองเสียงอัตราส่วน ชุดนี้จากนั้นจะสามารถจัดเก็บและใช้ในการทดลองที่ตามมา. วัฒนธรรมค้างคืนที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในศูนย์บ่มเพาะ CO2 อย่าเขย่าจาน. ห้ามเคลื่อนย้ายแผ่นในขณะที่เซลล์จะเลี้ยง นี้จะนำไปสู่จุด 'หอยทากทาง' ที่จะไม่ถูกกำหนดไว้อย่างดี อย่าสแต็คของแผ่นเปลือกโลกถ้าคุณมีมากกว่าหนึ่งเพื่อป้องกันผลกระทบที่ขอบในช่วงข้ามคืนบ่มเซลล์จะหลั่งไซโตไคน์ซึ่งจะเชื่อมโยงกับแอนติบอดีหลัก. ถ้าเซลล์ใช้เวลาในการตอบสนองต่อการกระตุ้นโปรดดูที่วิธีการทางอ้อมด้านล่างล้างออกเซลล์และไซโตไคน์ไม่ได้ผูกไว้โดยฟักกับพีบีเอส 0.1% Tween 20 เวลา 10 นาที. ให้แน่ใจว่าคุณรวมถึง Tween 20 ในบัฟเฟอร์ล้าง เซลล์บางส่วนจะได้เริ่มต้นหลังจากติดวัฒนธรรมในชั่วข้ามคืน (เช่นบางเซลล์ต้นกำเนิดเป็นที่รู้จักกันทำเช่นนี้) Tween 20 จะช่วยล้างเหล่านี้ออกจากเมมเบรน อย่าใช้เครื่องซักผ้าจานในขั้นตอนนี้. เจือจางแอนติบอดีการตรวจสอบผันในพีบีเอสบีเอสเอ 1% เพิ่มลงในหลุมและฟักไข่ประมาณ 1-2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง (เวลาบ่มอาจจำเป็นต้องมีการเพิ่มประสิทธิภาพ) ล้างจาน 3 ครั้งด้วยพีบีเอส 0.1% Tween 20 เพื่อเอาแอนติบอดีการตรวจสอบที่ไม่เฉพาะเจาะจงผูกพัน. สำหรับชุด ELISPOT ของเรามีความเข้มข้นของการตรวจหาแอนติบอดีได้รับการปรับปรุงเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด. เพิ่มการตรวจสอบแอนติบอดีผัน เจือจางแอนติบอดีในพีบีเอสบีเอสเอ 1% ฟักไข่ประมาณ 1-2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง (เวลาบ่มอาจจำเป็นต้องมีการเพิ่มประสิทธิภาพ) ล้างจาน 3 ครั้งด้วยพีบีเอส 0.1% Tween 20 เพื่อเอาแอนติบอดีการตรวจสอบที่ไม่เฉพาะเจาะจงผูกพัน. เพิ่มวิธีการแก้ปัญหาของเอนไซม์สารตั้งต้นแต่ละกัน. สำหรับโปรโตคอลการตรวจสอบเอนไซม์ฐานควรจะนำออกจากด้านล่างของแผ่นเพื่อให้การซักผ้าอย่างละเอียดของ เมมเบรนก่อนที่จะเพิ่มพื้นผิว / chromogen ตัวอย่างเช่นหลังจากการบ่มด้วย streptavidin ผันด่าง phosphatase เอาฐานและล้างทั้งสองด้านของเมมเบรนภายใต้การใช้น้ำกลั่น นี้จะช่วยป้องกันพื้นหลังสูงเป็นน้ำยาบางสามารถรั่วไหลผ่านเยื่อหุ้มเซลล์เข้าไปในถาดด้านล่างของแผ่น. หลังจากเปลี่ยนฐานและการเติมสารอาหารอย่างระมัดระวังตรวจสอบการก่อตัวจุด หยุดปฏิกิริยาโดยละม่อมล้างจานกับพีบีเอส 0.1% Tween 20 ครั้งเดียวการพัฒนาดูเหมือนจะชะลอตัว ใช้ฐานปิดแผ่นและล้างทั้งสองด้านของเมมเบรนที่มีน้ำกลั่นที่จะหยุดการก่อตัวจุด. แห้งแผ่นและช่วยให้เยื่อให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง. สปอตอาจจะกลายเป็นภาพที่คมชัดถ้าเยื่อจะถูกเก็บไว้ค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียสและ อาจจะยังคงปรับปรุงนานถึง 2 สัปดาห์ หากจัดเก็บห่อเยื่อสามารถห่อในกระดาษฟอยล์เก็บที่อุณหภูมิ 4 ° C. Punch เยื่อออกจากหลุมลงบนแผ่นพลาสติกเหนียว ขั้นตอนนี้จะขึ้นอยู่กับความต้องการของผู้อ่าน ที่ปรึกษาคู่มือผู้อ่าน. วัดแผ่นและวิเคราะห์วงการเมมเบรน. ในซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ที่ตั้งค่าพารามิเตอร์ต่อไปนี้สำหรับการวัด: ขนาด / จุดเส้นผ่าศูนย์กลางความเข้ม / ความอิ่มตัวCircularity / รูปร่างSpot พัฒนา / ลาดพารามิเตอร์เหล่านี้จะถูกบันทึกไว้และใช้สำหรับการทดลองในภายหลัง เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ได้มาตรฐาน. เราขอแนะนำให้อ่านแต่ละแผ่น 3 ครั้ง
เตรียมเยื่อ PVDF ในแผ่น 96 หลุมโดยการบ่มในเอทานอล 35% เป็นเวลา 30 วินาที. ให้แน่ใจว่าเอทานอลจะถูกลบออกอย่างสมบูรณ์โดยการล้างให้สะอาดด้วยพีบีเอส เอทานอลที่เหลือใด ๆ จะมีผลต่อชีวิตของเซลล์เช่นเดียวกับแอนติบอดี้ที่มีผลผูกพัน. เสื้อจาน 96 หลุมที่มีแอนติบอดีจับเจือจางในฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (พีบีเอส) ฟักค้างคืนที่ 4 ° C. ประมาณ 0.5-1 ไมโครกรัมต่อกันดีของแอนติบอดีควรจะใช้สำหรับจุดที่ดีที่กำหนด ชุดจะเหมาะกับความเข้มข้นของการจับภาพสำหรับประสิทธิภาพที่ดีที่สุด (100 ไมโครลิตรต่อกัน). ล้างบ่อแตะให้แห้งและล้างด้วยพีบีเอส. แผ่น ELISPOT มีความละเอียดอ่อนมากขึ้นกว่าแผ่น ELISA และควรจะจัดการกับการดูแล เมื่อแตะแห้งทำเช่นนั้นเบา ๆ อย่าใช้เครื่องซักผ้าจานในขั้นตอนนี้. เพิ่ม 100 ไมโครลิตรต่อดีนมพร่องมันเนยแห้ง 2% เพื่อป้องกันไม่เฉพาะเจาะจงที่จะมีผลผูกพันเมมเบรน กกจานเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง. ล้างจาน 3 ครั้งในพีบีเอสและปล่อยให้แห้ง ถ้าจำเป็นแผ่นสามารถเก็บไว้ในขั้นตอนนี้ เก็บที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลาไม่เกิน 2 สัปดาห์ที่ผ่านมาในถุงพลาสติกปิดผนึกด้วยสารดูดความชื้น. เตรียมอุปกรณ์ต่อพ่วงเซลล์ในเลือดโมโนนิวเคลียร์ (PBMCs) จากเลือดสดโดยใช้การไล่ระดับสี Ficoll ™ นับเซลล์โดยใช้สีย้อมมีชีวิตเช่นสีฟ้า Trypan พวกเขาควรจะมากกว่า 95% ที่ทำงานได้ เจือจางเซลล์กับความเข้มข้นที่จำเป็นและเพิ่มเซลล์แขวนลอยเพื่อหลุม หากการเพิ่มประสิทธิภาพการทดสอบจำนวนเซลล์ใช้ 1: ชุดที่ 2 ลดสัดส่วน อย่าเขย่าแผ่น. จำนวนของเซลล์ต่อกันควรจะเพิ่มประสิทธิภาพ ตัวอย่างเช่นใช้เซลล์มากขึ้นถ้าต่ำร้อยละของเซลล์ที่คาดว่าจะหลั่งไซโตไคน์เป้าหมาย อ้างถึงโปรโตคอลชุดเป้าหมายที่เฉพาะเจาะจงสำหรับข้อเสนอแนะเกี่ยวกับการควบคุมการทดสอบและจำนวนเซลล์ต่อกัน โดยปกติจำนวนเซลล์มักจะควรมีตั้งแต่ระหว่าง 5 ถึง 2x10 4x105 เซลล์ PBMC ต่อกัน. ถ้าเป็นไปได้ใช้สื่อซีรั่มซีรั่มฟรีเป็นจำนวนมากมีโปรตีนซึ่งอาจส่งผลกระทบต่อผลการค้นหา อีกวิธีหนึ่งคือกระบวนการหลายของซีรั่มสามารถทดสอบได้ที่จะหาคนที่เหมาะสมกับการตอบสนองเสียงอัตราส่วน ชุดนี้จากนั้นจะสามารถจัดเก็บและใช้ในการทดลองที่ตามมา. วัฒนธรรมค้างคืนที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในศูนย์บ่มเพาะ CO2 อย่าเขย่าจาน. ห้ามเคลื่อนย้ายแผ่นในขณะที่เซลล์จะเลี้ยง นี้จะนำไปสู่จุด 'หอยทากทาง' ที่จะไม่ถูกกำหนดไว้อย่างดี อย่าสแต็คของแผ่นเปลือกโลกถ้าคุณมีมากกว่าหนึ่งเพื่อป้องกันผลกระทบที่ขอบในช่วงข้ามคืนบ่มเซลล์จะหลั่งไซโตไคน์ซึ่งจะเชื่อมโยงกับแอนติบอดีหลัก. ถ้าเซลล์ใช้เวลาในการตอบสนองต่อการกระตุ้นโปรดดูที่วิธีการทางอ้อมด้านล่างล้างออกเซลล์และไซโตไคน์ไม่ได้ผูกไว้โดยฟักกับพีบีเอส 0.1% Tween 20 เวลา 10 นาที. ให้แน่ใจว่าคุณรวมถึง Tween 20 ในบัฟเฟอร์ล้าง เซลล์บางส่วนจะได้เริ่มต้นหลังจากติดวัฒนธรรมในชั่วข้ามคืน (เช่นบางเซลล์ต้นกำเนิดเป็นที่รู้จักกันทำเช่นนี้) Tween 20 จะช่วยล้างเหล่านี้ออกจากเมมเบรน อย่าใช้เครื่องซักผ้าจานในขั้นตอนนี้. เจือจางแอนติบอดีการตรวจสอบผันในพีบีเอสบีเอสเอ 1% เพิ่มลงในหลุมและฟักไข่ประมาณ 1-2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง (เวลาบ่มอาจจำเป็นต้องมีการเพิ่มประสิทธิภาพ) ล้างจาน 3 ครั้งด้วยพีบีเอส 0.1% Tween 20 เพื่อเอาแอนติบอดีการตรวจสอบที่ไม่เฉพาะเจาะจงผูกพัน. สำหรับชุด ELISPOT ของเรามีความเข้มข้นของการตรวจหาแอนติบอดีได้รับการปรับปรุงเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด. เพิ่มการตรวจสอบแอนติบอดีผัน เจือจางแอนติบอดีในพีบีเอสบีเอสเอ 1% ฟักไข่ประมาณ 1-2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง (เวลาบ่มอาจจำเป็นต้องมีการเพิ่มประสิทธิภาพ) ล้างจาน 3 ครั้งด้วยพีบีเอส 0.1% Tween 20 เพื่อเอาแอนติบอดีการตรวจสอบที่ไม่เฉพาะเจาะจงผูกพัน. เพิ่มวิธีการแก้ปัญหาของเอนไซม์สารตั้งต้นแต่ละกัน. สำหรับโปรโตคอลการตรวจสอบเอนไซม์ฐานควรจะนำออกจากด้านล่างของแผ่นเพื่อให้การซักผ้าอย่างละเอียดของ เมมเบรนก่อนที่จะเพิ่มพื้นผิว / chromogen ตัวอย่างเช่นหลังจากการบ่มด้วย streptavidin ผันด่าง phosphatase เอาฐานและล้างทั้งสองด้านของเมมเบรนภายใต้การใช้น้ำกลั่น นี้จะช่วยป้องกันพื้นหลังสูงเป็นน้ำยาบางสามารถรั่วไหลผ่านเยื่อหุ้มเซลล์เข้าไปในถาดด้านล่างของแผ่น. หลังจากเปลี่ยนฐานและการเติมสารอาหารอย่างระมัดระวังตรวจสอบการก่อตัวจุด หยุดปฏิกิริยาโดยละม่อมล้างจานกับพีบีเอส 0.1% Tween 20 ครั้งเดียวการพัฒนาดูเหมือนจะชะลอตัว ใช้ฐานปิดแผ่นและล้างทั้งสองด้านของเมมเบรนที่มีน้ำกลั่นที่จะหยุดการก่อตัวจุด. แห้งแผ่นและช่วยให้เยื่อให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง. สปอตอาจจะกลายเป็นภาพที่คมชัดถ้าเยื่อจะถูกเก็บไว้ค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียสและ อาจจะยังคงปรับปรุงนานถึง 2 สัปดาห์ หากจัดเก็บห่อเยื่อสามารถห่อในกระดาษฟอยล์เก็บที่อุณหภูมิ 4 ° C. Punch เยื่อออกจากหลุมลงบนแผ่นพลาสติกเหนียว ขั้นตอนนี้จะขึ้นอยู่กับความต้องการของผู้อ่าน ที่ปรึกษาคู่มือผู้อ่าน. วัดแผ่นและวิเคราะห์วงการเมมเบรน. ในซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ที่ตั้งค่าพารามิเตอร์ต่อไปนี้สำหรับการวัด: ขนาด / จุดเส้นผ่าศูนย์กลางความเข้ม / ความอิ่มตัวCircularity / รูปร่างSpot พัฒนา / ลาดพารามิเตอร์เหล่านี้จะถูกบันทึกไว้และใช้สำหรับการทดลองในภายหลัง เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ได้มาตรฐาน. เราขอแนะนำให้อ่านแต่ละแผ่น 3 ครั้ง
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- คุณมีเหตุผลเสมอ
- what would you do when you graduation?
- ที่รักถ่ายรูปไม่ยิ้มเลย
- เพื่อนฉันชอบชวนกินเหล้า ฉันไม่อยากออกไป
- เกิดขึ้นเองโดยไม่ต้องเติมแต่ง
- ทิศใต้
- He's really stupid.
- the fullest
- Evening
- วันอนุมัติการจบหลักสูตร
- poor
- การบันทึกบัญชี
- วิ่งออกกำลังกาย
- Contextual performance
- And l am glad to have spent a lot to ben
- ฟุตบอล
- Cheap
- โรงอาหาร
- กลิ่นไปไกล
- Analogy
- to become enclosed in or as if in a caps
- ผลลัพธ์ (ภาษาอังกฤษ) 1:If I like what fo
- เดินทาง
- Lipids were determined gravimetrically a
