PBS and OCP Reconstitution and Prot

PBS and OCP Reconstitution and Protein Cross-
Linking Experiment. The PBS−OCP complexes were
prepared in 0.8 M phosphate buffer (pH 7.0) by illumination
of isolated PBS with 2000 μmol of photons of white light m−2
s−1 for 10 min at 23 °C in the presence of the OCP (OCP:PBS
ratio of 40:1).15 To separate the resulting PBS−OCP
complexes from the unbound OCP after illumination, the
sample was loaded onto a 100 kDa filter (Millipore Amicon
Centrifugal Filters, Billerica, MA) and centrifuged at 4000g and
23 °C for 20 min. Fresh 0.8 M phosphate buffer was applied
three times to dilute the retentate. The composition of the blue
retentate was checked by absorption and fluorescence emission
spectroscopies (Figure S4 of the Supporting Information). The
concentration of PBS was calculated on the basis of the molar
absorptivity formula.15 The cross-linking experiment and LC−
MS/MS were used as previously described with minor
changes.33 The PBS−OCP sample was resuspended at 0.1
μM based on the PB concentration calculation. BS3 and DSS
cross-linking was performed according to the manufacturer’s
protocol followed by desalting using Zeba columns (Thermo
Scientific, Waltham, MA) with minor modifications. Modified
samples were precipitated using acetone, and the resuspended
samples were directly subjected to trypsin digestion.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

pbs และละลาย OCP และโปรตีนข้าม
ทดลองการเชื่อมโยง คอมเพล็กซ์ pbs-OCP
ได้เตรียมในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 0.8 เมตร (ph 7.0) โดยการส่องสว่าง
แยก pbs 2000 ไมโครโมลของโฟตอนของแสงสีขาว ม. 2
-s-1 เป็นเวลา 10 นาทีที่ 23 องศาเซลเซียสในการปรากฏตัวของ OCP (OCP: pbs
อัตราส่วนของ 40:1) .15 ที่จะแยกผลคอมเพล็กซ์ pbs-OCP
จาก OCP หลุดหลังจากแสงสว่าง
ตัวอย่างถูกโหลดลงบนตัวกรอง kda 100 (ค amicon
กรองแรงเหวี่ยง, บริดจ์) และหมุนเหวี่ยงที่ 4000G และ
23 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาที ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 0.8 เมตรสดถูกนำมาใช้
สามครั้งเพื่อเจือจางกัก องค์ประกอบของสีฟ้า
กักถูกตรวจสอบโดยการดูดซึมและการเรืองแสงการปล่อย
สเปกโตรสโค (s4 รูปของข้อมูลที่สนับสนุน)
ความเข้มข้นของพีบีเอสได้รับการคำนวณบนพื้นฐานของฟันกราม
ซึม formula.15 การทดลองข้ามการเชื่อมโยงและ LC-
ms / มิลลิวินาทีถูกนำมาใช้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้กับผู้เยาว์
changes.33 ตัวอย่าง pbs-OCP ถูก resuspended 0.1
ไมโครเมตร ขึ้นอยู่กับการคำนวณความเข้มข้น PB BS3 และ DSS
ข้ามเชื่อมโยงได้ดำเนินการตามที่ผู้ผลิต
โปรโตคอลตาม desalting ใช้คอลัมน์ Zeba (เทอร์โม
วิทยาศาสตร์เคมบริดจ์) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย แก้ไข
ตัวอย่างถูกตกตะกอนโดยใช้อะซิโตนและตัวอย่าง resuspended
ถูกยัดเยียดโดยตรงกับการย่อยอาหาร trypsin

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

PBS และ OCP Reconstitution และโปรตีนขน-
เชื่อมโยงการทดลอง คอมเพล็กซ์ PBS−OCP ถูก
เตรียมใน 0.8 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.0) โดยรัศมี
ของ PBS แยกกับ μmol 2000 ของ photons m−2 แสงสีขาว
s−1 ใน 10 นาทีที่ 23 ° C ในต่อหน้าของ OCP (OCP:PBS
อัตราส่วนของ 40:1) .15 แยก PBS−OCP ผล
คอมเพล็กซ์จาก OCP ผูกหลังไฟส่องสว่าง การ
ตัวอย่างถูกโหลดลงในตัวกรอง 100 kDa (Amicon มาก
กรองแรงเหวี่ยง Billerica, MA) และ centrifuged ที่ 4000g และ
23 ° C สำหรับบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.8 M สดประมาณ 20 นาทีใช้
สามครั้งการ dilute retentate องค์ประกอบของสีน้ำเงิน
retentate ถูกตรวจสอบ โดยการดูดซึมและ fluorescence มลพิษ
spectroscopies (รูป S4 ข้อมูลสนับสนุน) ใน
ความเข้มข้นของ PBS ถูกคำนวณกราม
absorptivity formula.15 ทดลอง cross-linking และ LC−
ใช้ MS/MS เป็นก่อนหน้านี้ อธิบาย ด้วยตัวอย่าง PBS−OCP ที่ resuspended ที่ 0.1 minor
changes.33
μM ตามการคำนวณความเข้มข้นของ PB BS3 และ DSS
เชื่อมโยงข้ามทำตามของผู้ผลิต
โพรโทคอลตาม ด้วย desalting โดยใช้คอลัมน์ Zeba (เทอร์โม
วิทยาศาสตร์ Waltham, MA) มีปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ปรับเปลี่ยน
ตัวอย่างได้ตกตะกอนโดยใช้อะซิโตน และที่ resuspended
ตัวอย่างถูกต้องตรงกับทริปซินย่อยอาหาร

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

PBS และ ocp reconstitution โปรตีนและการทดลองแบบ
การเชื่อมโยง ที่ PBS - ocp คอมเพล็กซ์
ซึ่งจะช่วยได้เตรียมความพร้อมใน 0.8 ม.ฟอสเฟต Buffer ( PH 7.0 )โดยไฟส่อง
ของแยก PBS 2000 μmol ประกอบแสงสีขาวของม. - 2
S - 1 สำหรับ 10 นาทีที่ 23 ° C ในที่ของ ocp ( ocp : PBS
อัตราส่วน 40 : 1 ) 15 .ข้อมูลจำเพาะในการแยกต่างหากที่เป็นผล PBS - ocp
คอมเพล็กซ์จากแก้ ocp หลังจากไฟส่อง,ที่
ตัวอย่างจะถูกโหลดไปยัง 100 kda แผ่นกรอง( millipore amicon
เหวี่ยงตัวกรอง, billerica , MA )และ centrifuged ที่ 4000 G และ
23 ° C สำหรับ 20 นาทีสด 0.8 ม.ฟอสเฟต buffer ถูกนำไปใช้
สามครั้งเพื่อเจือจางที่ retentate . การเขียนสีฟ้า
retentate ที่มีการตรวจสอบคุณสมบัติฟลูเรซ - เซ็นซโดยช่วยดูดซับแรงกระแทกและลดการปล่อย
spectroscopies (รูปที่ S 4 ของข้อมูลที่สนับสนุน) ที่
ตามมาตรฐานความเข้มข้นของ PBS จะคำนวณบนพื้นฐานของที่กรามที่ใช้เคี้ยว
absorptivity formula. 15 ข้ามการเชื่อมโยงการทดลองและ LC -
MS /มิลลิวินาทีจะถูกใช้เป็นที่อธิบายไว้ด้วยรอง
changes. 33 ที่ PBS - ocp resuspended เป็นตัวอย่างที่ 0.1
μ m ที่ใช้ PB สมาธิการคำนวณ BS 3 และ DSS
ข้ามการเชื่อมโยงได้ดำเนินการตาม' smanufacturer
โปรโตคอลตามด้วย desalting โดยใช้เสา zeba (แบบร้อน
ทางวิทยาศาสตร์ Waltham mA )พร้อมด้วยการเปลี่ยนแปลงแก้ไขเล็กน้อย
ซึ่งจะช่วยแก้ไขตัวอย่างเกิดขึ้นโดยใช้อะซีโตนและตัวอย่าง resuspended
ซึ่งจะช่วยให้มีการเปลี่ยนแปลงระบบย่อยอาหาร trypsin โดยตรง