Confirmation of the resistance gene

Confirmation of the resistance genes by DNA markers: Whole genome
DNA from each line was extracted according to the method described
by Murray and Thompson (1980). PCR was performed in a 10-ll PCR
mixture containing 1.4 ll sterile H2O, 1.0 ll dye (xylene cyanol
+ glycerol), 1.0 ll of 10 mM Tris–HCl (10 · PCR buffer), 1.0 ll
dNTP (1 mM), 0.5 ll primer of forward (5 lM) and reverse (5 lM),
0.1 ll Taq polymerase (3–4 U/ ll) and 5 ll DNA with concentration
of 5 ng/ll. PCR amplification was carried out in a PTC Dyad Engine
(for 384-well plates) with the following profile: 94C for 5 min, 35
cycles of 30 s at 94C, 30 s at 55C, and 30 s at 72C, and an extension
of 5 min at 72C. For Pibdom marker, the annealing temperature used
was 65C (Fjellstrom et al. 2004). For polymorphism detection, the
amplified products were electrophoretically resolved on 4–6% agarose
gel in 0.5 · TBE buffer at 250 V and 400 mA for 90–120 min and
DNA fragments were detected by staining with ethidium bromide.
To confirm the existence of the resistance genes in the selected lines,
DNA markers were used. Two markers, Pibdom and RM208, were
used to detect the gene, Pib. The primers for the Pibdom marker were
constructed to specifically amplify a DNA fragment from the
3¢ terminus of the Pib gene (Fjellstrom et al. 2004). RM208 was
reported to be co-segregated with Pib (Fjellstrom et al. 2004). To
obtain the DNA markers for Pish, linkage analysis using 376 F3 lines
derived from the cross between IRBLsh-S[CO] and CO 39 was carried
out. A blast isolate, 77-07A, which was collected in Japan, was used to
examine the presence of the gene, Pish, as the mapping study was
carried out in Japan International Research Center for Agricultural
Sciences (JIRCAS). Co-segregation between the four DNA markers,
RM7419, RM1268, RM6648 and RM5811, on chromosome 1 and Pish
was confirmed by chi-square analysis. A linkage map was constructed
using a computer software program, MAPMAKER version 3.0 (http://
linkage.rockefeller.edu/soft/mapmaker/) (Lander et al. 1987). All SSR
markers were selected from the public database (http://gramene.org).
All primer sequences of the markers used in this study were shown in
Table 1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ยืนยันของยีนต้านทานโดยเครื่องหมายดีเอ็นเอ: ทั้งจีโนมมีสกัดดีเอ็นเอจากแต่ละบรรทัดตามวิธีการอธิบายไว้โดยเมอร์เรย์และทอมป์สัน (1980) ทำ PCR ใน PCR จะ 10ส่วนผสมประกอบด้วย 1.4 จะใส่ H2O, 1.0 จะย้อม (ไซ cyanol+ กลีเซอร), 1.0 จะตรี – HCl 10 มม. (10 · PCR บัฟเฟอร์), 1.0 จะdNTP (1 mM), สีรองพื้นจะ 0.5 ของไปข้างหน้า (5 lM) และย้อน (5 lM),Taq 0.1 จะพอลิเมอเรส (U 3 – 4 / จะ) และ 5 ดีเอ็นเอจะ มีความเข้มข้น5 ng / PCR ขยายจะทำออกมาในเครื่องยนต์ Dyad PTC(สำหรับแผ่น 384-ดี) กับโพรไฟล์ต่อไปนี้: 94 C สำหรับ 5 นาที 35รอบ 30 s ที่ 94 C, 30 s ที่ 55 C และ 30 s ที่ 72 C และส่วนขยาย5 นาทีที่ 72 C. เครื่องหมาย Pibdom อุณหภูมิหลอมใช้มี C 65 (Fjellstrom et al. 2004) สำหรับการตรวจหาโพลิมอร์ฟิซึม การผลิตภัณฑ์เอาต์ได้แก้ไขใน 4 – 6% agarose electrophoreticallyเจใน 0.5 · TBE บัฟเฟอร์ที่ 250 V และ 400 mA สำหรับ 90-120 นาที และตรวจพบชิ้นส่วนดีเอ็นเอ โดยการย้อมสีด้วยโบรไมด์ ethidiumเพื่อยืนยันการมีอยู่ของยีนต้านทานในบรรทัดที่เลือกใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอ มีสองเครื่องหมาย Pibdom และ RM208ใช้เพื่อตรวจหายีน Pib ไพรเมอร์สำหรับเครื่อง Pibdom ได้สร้างขยายเฉพาะส่วนดีเอ็นเอจากการหมายเลข 3 ที่เทอมินัสยีน Pib (Fjellstrom et al. 2004) RM208 ถูกรายงานสามารถแยกร่วมกับ Pib (Fjellstrom et al. 2004) ถึงได้รับเครื่องหมายดีเอ็นเอสำหรับ Pish วิเคราะห์ความเชื่อมโยงโดยใช้บรรทัด F3 376มาข้ามระหว่าง IRBLsh-S [CO] และทำ 39 บริษัทออก การระเบิดแยก 77-07A ซึ่งถูกรวบรวมในญี่ปุ่น ใช้ในการตรวจสอบสถานะของยีน Pish เป็นการศึกษาการแม็ปดำเนินการในศูนย์วิจัยนานาชาติญี่ปุ่นสำหรับเกษตรวิทยาศาสตร์ (JIRCAS) ร่วมการแบ่งแยกระหว่างเครื่องหมายดีเอ็นเอ 4RM7419, RM1268, RM6648 และ RM5811 โครโมโซม 1 และ Pishได้รับการยืนยัน โดย chi-square วิเคราะห์ แผนที่เชื่อมโยงถูกสร้างขึ้นใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์ซอฟต์แวร์ MAPMAKER เวอร์ชัน 3.0 (ของ http://linkage.rockefeller.edu/soft/mapmaker/) (Lander et al. 1987). SSR ทั้งหมดเครื่องหมายถูกเลือกจากฐานข้อมูลสาธารณะ (ส่วน http://gramene.org)ลำดับรองพื้นทั้งหมดของเครื่องหมายที่ใช้ในการศึกษานี้ได้แสดงในตารางที่ 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การยืนยันของยีนต้านทานด้วยเครื่องหมายดีเอ็นเอจีโนมทั้งดีเอ็นเอจากแต่ละบรรทัดถูกสกัดตามวิธีการที่อธิบายไว้โดยเมอร์เรและธ อมป์สัน (1980) PCR ได้ดำเนินการใน 10 LL PCR ส่วนผสมที่มี 1.4 LL หมัน H2O 1.0 ย้อม LL (ไซลีน cyanol + กลีเซอรอล) 1.0 LL 10 มิลลิ Tris-HCl (10 ·บัฟเฟอร์ PCR) 1.0 LL dNTP (1 มิลลิเมตร) 0.5 ไพรเมอร์ LL ไปข้างหน้า (5 LM) และย้อนกลับ (5 LM) 0.1 LL โพลิเมอร์ Taq (3-4 U / LL) และ DNA LL 5 ที่มีความเข้มข้น5 ng / LL ขยาย PCR ได้ดำเนินการใน PTC dyad เครื่องยนต์(สำหรับแผ่น 384 ด้วย) มีรายละเอียดดังต่อไปนี้: 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที, 35 รอบของ 30 วินาทีที่ 94 C, 30 วินาทีที่ 55 องศาเซลเซียสและ 30 วินาทีที่? 72 องศาเซลเซียสและส่วนขยายของ 5 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส สำหรับเครื่องหมาย Pibdom อุณหภูมิที่ใช้ในการอบ65 องศาเซลเซียส (Fjellstrom et al. 2004) สำหรับการตรวจสอบความแตกต่างของผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการแก้ไขขยาย electrophoretically วันที่ 4-6% agarose เจล 0.5 ·บัฟเฟอร์ TBE ที่ 250 V และ 400 มิลลิแอมป์สำหรับ 90-120 นาทีและชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ถูกตรวจพบโดยการย้อมสีด้วยethidium bromide. เพื่อยืนยันการมีอยู่ของ ยีนต้านทานในสายที่เลือกเครื่องหมายดีเอ็นเอถูกนำมาใช้ สองเครื่องหมาย Pibdom RM208 และถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบยีนPIB ไพรเมอร์สำหรับเครื่องหมาย Pibdom ถูกสร้างขึ้นมาเพื่อขยายเฉพาะส่วนดีเอ็นเอจากสถานี¢ 3 ของยีน PIB (Fjellstrom et al. 2004) RM208 ได้รับรายงานว่าจะร่วมกับแยกPIB (Fjellstrom et al. 2004) ที่จะได้รับเครื่องหมายดีเอ็นเอสำหรับ Pish การวิเคราะห์การเชื่อมโยงโดยใช้สาย 376 F3 ที่ได้มาจากการผสมผสานกันระหว่าง IRBLsh-S [CO] และ CO 39 ได้ดำเนินการออก ระเบิดแยก A, 77-07A ซึ่งถูกเก็บรวบรวมในประเทศญี่ปุ่นถูกใช้ในการตรวจสอบการปรากฏตัวของยีนที่Pish เช่นการศึกษาการทำแผนที่ได้รับการดำเนินการในประเทศญี่ปุ่นศูนย์วิจัยการเกษตรระหว่างประเทศเพื่อการSciences (JIRCAS) ร่วมแยกระหว่างสี่เครื่องหมายดีเอ็นเอRM7419, RM1268, RM6648 และ RM5811, บนโครโมโซมที่ 1 และ Pish ได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ไคสแควร์ แผนที่เชื่อมโยงที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้โปรแกรมซอฟต์แวร์คอมพิวเตอร์รุ่น MapMaker 3.0 (http // (. Lander et al, 1987) linkage.rockefeller.edu/soft/mapmaker/) ทั้งหมด SSR เครื่องหมายได้รับการคัดเลือกจากฐานข้อมูลสาธารณะ (http://gramene.org). ลำดับไพรเมอร์ทั้งหมดของเครื่องหมายที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นในตารางที่ 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การยืนยันของยีนต้านทานโดยเครื่องหมายดีเอ็นเอดีเอ็นเอจีโนม
ทั้งหมดจากแต่ละบรรทัดมีแยกตามวิธีการอธิบาย
โดย เมอร์เรย์ และ ทอมป์สัน ( 1980 ) ร่วมแสดงใน 10 จะเพิ่มส่วนผสมที่มี 1.4 จะเป็นหมัน
H2O , 1.0 จะย้อม ( ไซลีน cyanol
กลีเซอรอล ) , 1.0 จะ 10 มม. นอกจากนี้ – HCl ( 10 ด้วย PCR buffer ) , 1.0 จะ
dntp ( 1 มิลลิเมตร ) , 0.5 จะรองพื้นของไปข้างหน้า ( 5 กล. ) และกลับ ( 5 โดย )
01 จะใช้แท็ก ( 3 – 4 U / ll ) และ 5 จะตรวจดีเอ็นเอกับสมาธิ
5 ng / ll โดยได้ทำการศึกษาใน PTC ( คู่เครื่องยนต์
( 384 ดีแผ่น ) มีรายละเอียดดังต่อไปนี้  94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที 35
รอบ 30 s ที่ 94  C 30 S 55  C และ 30 s 72  C , และส่วนขยาย
5 นาทีที่ 72  ซี. pibdom เครื่องหมาย , อุณหภูมิการอบอ่อนที่ใช้
คือ 65  C ( fjellstrom et al . 2004 )การตรวจหา polymorphism ,
ขยายผลิตภัณฑ์ electrophoretically แก้ไขในเจล (
6 % 4 – 0.5 ทีบีด้วยบัฟเฟอร์ ที่ 250 และ 400 มา 90 – 120 นาทีและชิ้นส่วนดีเอ็นเอ
ถูกตรวจพบโดยการศึกษาทิเดียมโบรไมด์ .
เพื่อยืนยันการมีอยู่ของยีนต้านทานในที่เลือกเส้น
เครื่องหมายดีเอ็นเอสถิติที่ใช้ 2 เครื่องหมาย และ pibdom rm208 ,
ใช้ตรวจหายีนรอง .ไพรเมอร์สำหรับ pibdom เครื่องหมายถูก
สร้างโดยเฉพาะขยายดีเอ็นเอจาก
3 ¢ปลายทางของยีนเทระไบต์ ( fjellstrom et al . 2004 ) rm208 คือ
รายงานเป็น Co แยกกับเทระไบต์ ( fjellstrom et al . 2004 )

ขอรับเครื่องหมายดีเอ็นเอสำหรับ พิช การวิเคราะห์ linkage โดยใช้เจ้า F3
เส้นที่มาจากข้ามระหว่าง irblsh-s [ CO ] และ Co 39 า
. ระเบิดแยก 77-07a , ,ซึ่งเก็บข้อมูลในญี่ปุ่น ถูกใช้เพื่อตรวจสอบสถานะของ
ยีน พิช เป็นแผนที่ศึกษา
ดำเนินการในประเทศญี่ปุ่นและ ศูนย์วิจัยวิทยาศาสตร์การเกษตร
( jircas ) ร่วมแยกระหว่างสี่ดีเอ็นเอเครื่องหมาย
rm7419 rm1268 rm6648 , และ , rm5811 บนโครโมโซม 1 และ พิช
ได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ตาราง ) การเชื่อมโยงแผนที่ก่อสร้าง
การใช้โปรแกรมซอฟต์แวร์คอมพิวเตอร์ คนสร้างแผนที่มารุ่น 3.0 ( http : / /
เชื่อมโยง . ร็อกกี้เฟลเลอร์ . edu / นุ่ม / คนสร้างแผนที่มา / ) ( Lander et al . 1987 ) เครื่องหมาย SSR
ทั้งหมดถูกเลือกจากฐานข้อมูลสาธารณะ ( http : / / gramene . org )
5 ไพรเมอร์ทั้งหมดของเครื่องหมายที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ ได้ถูกแสดงใน
โต๊ะ 1