2.9. Gel image analysisThe gel imag

2.9. Gel image analysis
The gel imageswere obtained using VersaDoc imager (Bio-Rad) and
were analyzed using PDQUEST software (Bio-Rad). The spots were
detected, and matched spots were normalized (Joseph et al., 2012). A
spot was considered to be differentially abundant when it demonstrated
1.5–fold intensity difference between ISM and OSM and was associated
with P b 0.01 in a pairwise Student's t-test.
2.10. Protein identification by tandem mass spectrometry
Protein spots differentially abundant between ISM and OSM were
excised fromthe gel using pipet tips. To confirmthe identity of the proteins,
respective spotswere also excised fromthe other group. The spots
were destained by two 30-min washes with 50 mM NH4HCO3/50%
CH3CN followed by vortexing for 10 min, and drying using a vacuum
centrifuge. Proteins in the gel were reduced by the addition of 50 mM
NH4HCO3 containing 10 mM DTT and incubation at 57 °C for 30 min.
Further, the proteins were alkylated by the addition of 50 mM
NH4HCO3 containing 50 mM iodoacetamide and incubation for 30 min
in the dark at room temperature. The gel pieces were washed twice
with 50 mM NH4HCO3 and once with CH3CN, and partially dried in a
vacuum centrifuge. Dried gel pieces were rehydrated for 1 h (on ice)
with a solution of 40 mM NH4HCO3/9% CH3CN, containing proteomic
grade trypsin (Sigma, St. Louis, MO, USA) at a concentration of 20 ng/μL.
Additional volume of 40 mM NH4HCO3/9% CH3CN was added to cover
the sample, and the gel was incubated for 18 h at 37 °C. Peptide extraction
from the gel was done by sonication in 0.1% trifluoroacetic acid for
10 min followed by vortexing for 10min. Extraction was repeated with
50% CH3CN/0.1% trifluoroacetic acid. The extracts were combined, and
the volume was decreased to eliminate most of the acetonitrile. The
peptide extracts were desalted and concentrated by solid phase extraction
using a 0.1–10 μL pipet tip (Sarstedt, Newton, NC, USA) packed
with 1 mm of Empore C-18 (3M, St. Paul, MN, USA), and peptides
were eluted in 5 μL of 50% CH3CN/0.1% trifluoroacetic acid.
Desalted peptide extracts (0.3 μL) were spotted onto an Opti-TOF
384 well insert (ABSciex, Foster City, CA, USA) with 0.3 μL of 5 mg/mL
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (Aldrich, St. Louis, MO, USA) in 50%
CH3CN/50% 0.1% trifluoroacetic acid. Crystallized samples were washed
with cold 0.1% trifluoroacetic acid and were analyzed using a 4800
MALDI TOF-TOF Proteomics Analyzer (ABSciex). Initial MALDI MS
spectrumwas acquired for each spotwith 400 laser shots per spectrum.
From that a maximum of 15 peaks with a signal-to-noise ratio of N20
were automatically selected for MS–MS analysis (1000 shots per
spectrum) by post-source decay. Peak lists from the MS–MS spectra
were submitted for database similarity search using Protein Pilot version
4.0 (ABSciex) using search parameters (Search type: identification;
Enzyme: trypsin; Database: bovine NCBI non-redundant; Search effort:
thorough; Unused cutoff N1.30, 95% confidence) in the National Center
for Biotechnology Information (NCBI) database to identify the proteins.
A protein was assigned as identified if it had an unused cutoff value of
at least 2.00 and at least two peptides were identified with 99%
confidence.
2.11. Statistical analysis
ISM and OSM fabricated from the semimembranosus muscles of
eight (n=8) beef carcasseswere utilized in the experiment. The design
was a split-plot with randomized block design in the whole plot with
eight replicates, wherein semimembranosus muscles fromeach carcass
served as blocks. The effects of muscle location (ISMand OSM), storage
(0, 2, and 4 days), and their interactions were analyzed using the PROC
MIXED option (SAS, 2013) and the differences among means were
detected using the least significant difference (LSD) at a 5% level. In
addition, the PROC CORR option was used to determine the Pearson's
correlation coefficient between the differentially abundant proteins
and color attributes (

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.9 การวิเคราะห์ภาพที่เจImageswere เจรับใช้ถ่ายภาพ VersaDoc (ไบโอ-Rad) และมีวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ PDQUEST (ไบโอ-Rad) จุดมีจุดตรวจ และการจับคู่ได้มาตรฐาน (โจเซฟ et al., 2012) Aจุดที่ถือเป็น differentially มากเมื่อมันแสดงเข้มข้น 1.5 – พับความแตกต่างระหว่าง ISM และ OSM และเชื่อมโยงกับ b P 0.01 ใน t-ทดสอบของนักเรียนแพร์ไวส์2.10. โปรตีนรหัสตามตัวตามกันไปรเมทมีโปรตีนจุด differentially อุดมสมบูรณ์ระหว่าง ISM และ OSMexcised จากเจลใช้ pipet เคล็ดลับ การ confirmthe ข้อมูลประจำตัวของโปรตีนspotswere เกี่ยวข้องยัง excised จากกลุ่มอื่น ๆ จุดถูก destained โดย washes 30 นาทีสองกับ 50 mM NH4HCO3/50%CH3CN ตาม ด้วย vortexing สำหรับ 10 นาที และอบแห้งสุญญากาศโดยใช้เครื่องหมุนเหวี่ยง โปรตีนในเจถูกลดลง โดยการเพิ่ม 50 มม.NH4HCO3 10 มม. DTT และบ่มเพาะวิสาหกิจที่ 57 ° C สำหรับ 30 นาทีเพิ่มเติม โปรตีนถูก alkylated ด้านนอก 50 มม.Iodoacetamide 50 มม.มี NH4HCO3 และบ่มใน 30 นาทีในมืดที่อุณหภูมิห้อง ชิ้นเจถูกล้างสองครั้ง50 มม. NH4HCO3 และครั้งเดียวกับ CH3CN และบางส่วนแห้งในตัวเครื่องหมุนเหวี่ยงสูญญากาศ เจลแห้งชิ้นถูก rehydrated สำหรับ h 1 (ในน้ำแข็ง)ด้วยโซลูชั่น 40 มม. NH4HCO3/9% CH3CN ประกอบด้วย proteomicเกรดทริปซิน (ซิก St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) ที่ความเข้มข้นของ μL ละ 20 ngปริมาตร 40 มม. NH4HCO3/9% CH3CN ถูกเพิ่มเพื่อให้ครอบคลุมเพิ่มเติมตัวอย่าง และเจมี incubated สำหรับ h 18 ที่ 37 องศาเซลเซียส แยกเพปไทด์จากเจเสร็จ โดย sonication ในกรด trifluoroacetic 0.1% สำหรับ10 นาทีตาม ด้วย vortexing สำหรับ 10 นาทีแยกถูกทำซ้ำด้วย50% CH3CN/0.1% trifluoroacetic กรด สารสกัดได้รวมเข้าด้วยกัน และไดรฟ์ข้อมูลถูกลดลงเพื่อกำจัดส่วนใหญ่ของ acetonitrile ที่สารสกัดจากเปป desalted และเข้มข้น โดยการแยกเฟสของแข็งโดยใช้ 0.1-10 μL pipet เคล็ด (Sarstedt นิวตัน NC, USA) บรรจุกับ 1 มม. Empore C-18 (3 M, St. Paul, MN สหรัฐอเมริกา), และเปปไทด์มี eluted ใน μL 5 ของ 50% CH3CN/0.1% trifluoroacetic กรดสารสกัดจากเปป desalted (0.3 μL) ถูกด่างลงเป็น TOF Opti384 ดีแทรก (ABSciex ฟอสเตอร์ซิตี้ CA, USA) ด้วย μL 0.3 ของ 5 mg/mLกรดด้วยกองทัพ-cyano-4-hydroxycinnamic (Aldrich, St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) 50%CH3CN/50% 0.1% กรด trifluoroacetic ตัวอย่างการตกผลึกถูกล้างมีกรด trifluoroacetic 0.1% เย็น และถูกวิเคราะห์โดยใช้การ 4800MALDI TOF TOF โปรตีโอมิกส์วิเคราะห์ (ABSciex) เริ่มต้น MALDI MSspectrumwas ได้รับการ spotwith แต่ละภาพเลเซอร์ 400 ต่อสเปกตรัมจากที่สูงสุดยอด 15 ด้วยอัตราสัญญาณต่อเสียงของ N20ถูกเลือกโดยอัตโนมัติสำหรับ MS – MS วิเคราะห์ (1000 ภาพต่อคลื่น) โดยแหล่งหลังผุ รายการสูงสุดจากแรมสเป็คตรา MS – MSส่งมาหาฐานคล้ายใช้รุ่น Pilot โปรตีน4.0 (ABSciex) ใช้ค้นหาพารามิเตอร์ (ชนิดการค้นหา: รหัสเอนไซม์: ทริปซิน ฐานข้อมูล: ไม่ซ้ำซ้อน NCBI วัว ความพยายามที่ค้นหา:อย่างละเอียด ไม่ตัดยอด N1.30 ความเชื่อมั่น 95%) ในศูนย์แห่งชาติสำหรับฐานข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ (NCBI) ระบุโปรตีนโปรตีนถูกกำหนดให้ระบุว่าถ้ามันยังไม่ตัดยอดค่าระบุเปปไทด์ 2.00 น้อย และน้อยสอง 99%ความเชื่อมั่น2.11. สถิติวิเคราะห์ISM และหลังสร้างจากกล้ามเนื้อ semimembranosus ของ OSM8 (n = 8) เนื้อ carcasseswere ที่ใช้ในการทดลอง การออกแบบมีการแบ่งแผนออกแบบบล็อก randomized ในพล็อตทั้งหมดด้วย8 สามารถจำลอง semimembranosus กล้ามเนื้อ fromeach ซากนั้นทำหน้าที่เป็นบล็อก ผลกระทบของตำแหน่งกล้ามเนื้อ (ISMand OSM), เก็บ(0, 2 และ 4 วัน), และการโต้ตอบถูกวิเคราะห์โดยใช้กระบวนการตัวเลือกผสม (SAS, 2013) และความแตกต่างระหว่างวิธีตรวจพบโดยใช้ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญน้อยที่สุด (LSD) ในระดับ 5% ในนอกจากนี้ ตัวกระบวนการคอรร์ถูกใช้เพื่อกำหนดของเพียร์สันสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนมากมาย differentiallyและสี(แอตทริบิวต์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.9 การวิเคราะห์ภาพเจลเจล imageswere ได้ใช้อิมเมจ VersaDoc (Bio-Rad) และได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟแวร์PDQUEST (Bio-Rad) จุดที่ถูกตรวจพบและจุดจับคู่ถูกปกติ (โจเซฟ et al., 2012) จุดที่ได้รับการพิจารณาให้เป็นแตกต่างกันมากมายเมื่อมันแสดงให้เห็นถึง1.5 เท่าความแตกต่างระหว่างความเข้ม ISM และ OSM และเกี่ยวข้องกับP ข 0.01 ในนักศึกษาจากจำนวนของ t-test. 2.10 การระบุโปรตีนโดยตีคู่มวลสารจุดโปรตีนที่อุดมสมบูรณ์แตกต่างกันระหว่าง ISM และ OSM ถูกตัดfromthe เจลใช้เคล็ดลับปิเปต เพื่อ confirmthe ตัวตนของโปรตีนspotswere นั้นยังพอ fromthe ในกลุ่มอื่น ๆ จุดที่ถูก destained สองล้าง 30 นาที 50 มิลลิ NH4HCO3 / 50% CH3CN ตามด้วย vortexing เป็นเวลา 10 นาทีและใช้การอบแห้งสูญญากาศเครื่องหมุนเหวี่ยง โปรตีนในเจลลดลงโดยนอกเหนือจาก 50 มิลลิNH4HCO3 มี 10 มิลลิ DTT และบ่มที่ 57 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที. นอกจากนี้โปรตีนเป็น alkylated โดยนอกเหนือจาก 50 มิลลิNH4HCO3 มี 50 มิลลิ iodoacetamide และบ่มเป็นเวลา 30 นาทีในความมืดที่อุณหภูมิห้อง ชิ้นเจลล้างครั้งที่สอง50 มิลลิ NH4HCO3 และครั้งเดียวกับ CH3CN และแห้งบางส่วนในcentrifuge สูญญากาศ แห้งชิ้นเจลได้รับการคืนรูปเป็นเวลา 1 ชั่วโมง (บนน้ำแข็ง) กับการแก้ปัญหา 40 มิลลิ NH4HCO3 / 9% CH3CN ที่มีโปรตีนtrypsin เกรด (Sigma, St. Louis, MO, USA) ที่ความเข้มข้น 20 ng / ไมโครลิตรก. ปริมาณเพิ่มเติม 40 มิลลิ NH4HCO3 / 9% CH3CN ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อให้ครอบคลุมตัวอย่างและเจลที่ถูกบ่มเป็นเวลา18 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส สกัดเปปไทด์จากเจลทำโดย sonication ใน 0.1% กรด TRIFLUOROACETIC สำหรับ 10 นาทีตามด้วย vortexing สำหรับ 10 นาที สกัดซ้ำกับ50% CH3CN / 0.1% กรด TRIFLUOROACETIC สารสกัดมารวมกันและมีปริมาณลดลงมากที่สุดในการกำจัดของ acetonitrile สารสกัดจากเปปไทด์ที่ถูก desalted และความเข้มข้นโดยการสกัดของแข็งโดยใช้เคล็ดลับที่0.1-10 ไมโครลิตรปิเปต (ซาร์สเต็ดท์, นิวตัน, NC, USA) บรรจุ1 มิลลิเมตร Empore C-18 (3M, เซนต์ปอล, MN, USA) และ เปปไทด์ที่ถูกชะ5 ไมโครลิตร 50% CH3CN / 0.1% กรด TRIFLUOROACETIC. สารสกัดจากเปปไทด์ desalted (0.3 ไมโครลิตร) เป็นด่างลง Opti-TOF 384 ใส่กัน (ABSciex, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) 0.3 ไมโครลิตร 5 mg / มิลลิลิตรα-สีน้ำเงิน-4-hydroxycinnamic กรด (ดิช, เซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา) ใน 50% CH3CN / 50% 0.1% กรด TRIFLUOROACETIC ตัวอย่าง Crystallized ถูกล้างด้วยกรดTRIFLUOROACETIC เย็น 0.1% และได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ 4800 MALDI-TOF TOF เซ็กเมนต์วิเคราะห์ (ABSciex) เริ่มต้น MALDI MS spectrumwas ที่ได้มาสำหรับแต่ละ spotwith 400 ภาพเลเซอร์ต่อสเปกตรัม. จากที่สูงสุด 15 ยอดเขามีสัญญาณต่อเสียงรบกวนอัตราส่วนของ N20 ได้รับการคัดเลือกโดยอัตโนมัติสำหรับการวิเคราะห์ MS-MS (1000 ภาพต่อคลื่นความถี่) จากการสลายตัวหลังแหล่งที่มา . รายการยอดจาก MS-MS เปคตรัมที่ถูกส่งมาสำหรับการค้นหาความคล้ายคลึงกันฐานข้อมูลโดยใช้รุ่นนำร่องโปรตีน4.0 (ABSciex) โดยใช้พารามิเตอร์การค้นหา (ชนิดค้นหา: บัตรประจำตัว; เอนไซม์: trypsin; ฐานข้อมูลวัว NCBI ที่ไม่ซ้ำซ้อน; พยายามค้นหาอย่างละเอียด; ตัดที่ไม่ได้ใช้ N1.30 ความเชื่อมั่น 95%) ในศูนย์แห่งชาติสำหรับข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ(NCBI) ฐานข้อมูลเพื่อระบุโปรตีน. โปรตีนที่ได้รับมอบหมายตามที่ระบุไว้ถ้ามันมีค่าตัดที่ไม่ได้ใช้อย่างน้อย 2.00 และอย่างน้อยสองเปปไทด์ที่ถูกระบุว่ามี 99 % ความเชื่อมั่น. 2.11 การวิเคราะห์ทางสถิติISM และ OSM ประดิษฐ์จากกล้ามเนื้อ semimembranosus ของแปด(n = 8) carcasseswere เนื้อวัวที่ใช้ในการทดลอง การออกแบบที่เป็นแยกพล็อตที่มีการออกแบบบล็อกสุ่มในพล็อตที่มีทั้งแปดซ้ำประเด็นกล้ามเนื้อsemimembranosus fromeach ซากทำหน้าที่เป็นบล็อก ผลกระทบของสถานที่ตั้งของกล้ามเนื้อ (ISMand OSM) การจัดเก็บ(0, 2 และ 4 วัน) และการมีปฏิสัมพันธ์ของพวกเขาได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ PROC ตัวเลือกผสม (SAS 2013) และความแตกต่างระหว่างวิธีการที่ถูกตรวจพบโดยใช้น้อยแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ(LSD ) ในระดับ 5% ในนอกจากนี้ตัวเลือก PROC CORR ถูกใช้ในการตรวจสอบเพียร์สันสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนที่อุดมสมบูรณ์แตกต่างกันและคุณลักษณะสี(สี