PCR amplification of nifH gene frag

PCR amplification of nifH gene fragments from the rhizosphere
soil and root DNA was performed. To obtain pure
DNA, nucleic acid mixture was incubated at 37 C with RNase
A (Promega Corporation, Madison, WI) at a final concentration
of 100 mgml1 for 10 min. A pair of universal degenerate
primers [29] Zehr-nifHf (50;-TGYGAYCCNAARGCNGA-30;) and
Zehr-nifHr (50;-ADNGCCATCATYTCNCC-30;), were used to
amplify a 360 bp fragment of the nifH gene. These primers
have been widely and successfully used to amplify nifH gene
from distantly related diazotrophs [23]. The samples were
amplified in a PCR mixture containing 4 mM MgCl2, 200 mM
of each deoxynucleoside triphosphate, 100 picomoles of
each primer, 2.5 U of Taq DNA polymerase with 1 buffer
with (NH4)2SO4 (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania) in 50 ml
volumes for 40 cycles at 94 C for 1 min, 57 C for 2 min and
72 C for 2 min on Primus 25 PCR-System Thermal Cycler
(MWG-Biotech AG, Ebersberg, Germany)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขยาย PCR ของบางส่วนของยีน nifH จากในไรโซสเฟียร์ดีเอ็นเอดินและรากที่ดำเนินการ รับเพียวดีเอ็นเอ กรดนิวคลีอิกผสมถูก incubated ที่ 37 C กับ RNaseการ (Promega Corporation เมดิสัน WI) ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ mgml 100 1 ใน 10 นาที คู่ของ degenerate สากลไพรเมอร์ [29] Zehr-nifHf (50; - TGYGAYCCNAARGCNGA - 30;) และZehr-nifHr (50; - ADNGCCATCATYTCNCC - 30;), เคยใช้ขยายส่วน bp 360 ของยีน nifH ไพรเมอร์เหล่านี้กันอย่างแพร่หลาย และประสบความสำเร็จใช้ขยายยีน nifHจาก distantly ที่เกี่ยวข้อง diazotrophs [23] ตัวอย่างดีขยายในส่วนผสม PCR ประกอบด้วย MgCl2, 200 mM 4 mMของแต่ละโนซีนไตรฟอสเฟต deoxynucleoside, 100 picomoles ของแต่ละพื้น 2.5 U ของ Taq DNA พอลิเมอเรสกับบัฟเฟอร์ 1ด้วย (NH4) 2SO4 (MBI Fermentas วิลเนียส ลิทัวเนีย) ใน 50 mlวอลุ่มสำหรับวงจร 40 ที่ 94 C ใน 1 นาที 57 C สำหรับ 2 นาที และซี 72 สำหรับ 2 นาทีโดยคนที่หนึ่ง 25 ระบบ PCR Cycler ร้อน(ไบโอเทค MWG AG, Ebersberg เยอรมนี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ขยาย PCR ของยีน nifH
เศษจากบริเวณรากดินและรากดีเอ็นเอที่ได้ดำเนินการ ที่จะได้รับบริสุทธิ์ดีเอ็นเอผสมกรดนิวคลีถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสมี RNase A (Promega คอร์ปอเรชั่น Madison, WI) ที่ความเข้มข้นสุดท้าย100 mgml 1 เป็นเวลา 10 นาที คู่ของคนเลวสากลไพรเมอร์ [29] Zehr-nifHf (50 -TGYGAYCCNAARGCNGA-30) และ Zehr-nifHr (50 -ADNGCCATCATYTCNCC-30;) ถูกนำมาใช้ในการขยายส่วน360 bp ของยีน nifH ไพรเมอร์เหล่านี้ได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางและใช้ประสบความสำเร็จในการขยายยีน nifH จาก diazotrophs เกี่ยวข้องลิ่ว [23] กลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการขยายในส่วนผสม PCR ที่มี 4 มิลลิ MgCl2 200 มิลลิของแต่ละtriphosphate deoxynucleoside 100 picomoles ของแต่ละไพรเมอร์2.5 U ของ Taq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ 1? บัฟเฟอร์ด้วย (NH4) 2SO4 (MBI Fermentas วิลนีอุลิทัวเนีย) ใน 50 มล. ปริมาณ 40 รอบที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที 57 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีและ72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีใน Primus 25 PCR-ระบบ Thermal Cycler (AG-MWG ชีวภาพ Ebersberg, เยอรมนี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การเพิ่มปริมาณของยีนจากเชื้อ nifh เศษราก
ดินและราก DNA จะถูกดำเนินการ เพื่อขอรับ
ดีเอ็นเอบริสุทธิ์ผสมกรดนิวคลีอิกคือบ่มที่ 37 องศาเซลเซียส  เลส
( promega Corporation , Madison , WI ) ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 100
mgml  1 10 นาทีคู่ไพรเมอร์ [ 29 ] สากลทราม
zehr nifhf ( 50 - tgygayccnaargcnga-30 และ zehr nifhr (
; ) 50 - adngccatcatytcncc-30 ; ใช้

)ขยายส่วนของ nifh 360 คู่เบสของยีน ไพรเมอร์เหล่านี้
ได้รับอย่างกว้างขวางและประสบความสำเร็จในการใช้อำนาจ nifh
ยีนจากห่างเหินเกี่ยวข้องกับ diazotrophs [ 23 ] จำนวน
ขยายใน PCR ผสมที่ประกอบด้วยชุด 4 มม. 200 มม.
ของแต่ละ deoxynucleoside ไตรฟอสเฟต 100 picomoles ของ
แต่ละ primer 2.5 U ของดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค กับ 1  บัฟเฟอร์
( NH4 ) 2so4 ( 2 fermentas วิลนีอุ ,ลิทัวเนีย ) 50 ml
ปริมาณ 40 รอบที่ 94  C เป็นเวลา 1 นาที , 57  C 2 นาที 72 
C 2 นาทีบนระบบ Thermal cycler Primus 25 )
( mwg BIOTECH AG , ebersberg , เยอรมัน )