cDNA probe isolation: The procedure

cDNA probe isolation: The procedure for isolating clones and screening for polymorphism is similar to that described by POCSON and ZOUROS (1994). Approximately 2 g of liver was removed from an anesthetized adult cod, immediately frozen in liquid nitrogen, and used as a source of mRNA for the construction of a cDNA library in the phagemid vector lambda Bluemid (Clontech) . cDNA clones were isolated by plating out the library at low density and transferring individual plaques to 100 p1 SM buffer (100 mM Tris-HC1, 10 mM MgC12, pH 7.4). Phage DNA was prepared for amplification by the polymerase chain reaction (PCR) by two cycles of freeze- thawing at -80". cDNA inserts were amplified by 30 cycles of denaturation (94" for 1 min), primer annealing (45" for1 min) and extension (72" for 2.5 min) on a Perkin-Elmer Cetus DNA thermal cycler. Reactions were carried out in 10 mM Tris-HCI (pH 8.3 at 25"), 50 mM KCl, 1.5 mM MgC12, 200 p~ dATP, dGTP, dCTP and dTTP, 0.4 p~ SK primer (5'- TCTAGAACTAGTGCATC-3') ,0.4 p~ KS primer (5"CGAGG TCGACGGTATCG3'), 3 p1 phage DNA and one unit Taq polymerase in a final volume of 50 pl. Amplified cDNA clones were visualized on 0.8% agarose gels stained with ethidium bromide.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แยกโพรบ cDNA: ขั้นตอนในการแยกโคลน และคัดกรองสำหรับความแตกต่างคือคล้ายกับที่อธิบายไว้ โดย POCSON และ ZOUROS (1994) ประมาณ 2 กรัมของตับถูกเอาออกจาก cod ผู้ใหญ่ผิดด้วย ทันทีแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว และใช้เป็นแหล่งของ mRNA การก่อสร้างห้องสมุด cDNA ในแลมบ์ดาเวกเตอร์ phagemid Bluemid (Clontech) cDNA โคลนถูกแยก โดยชุบออกไลบรารีที่ความหนาแน่นต่ำ และการโอนย้ายแต่ละโล่ 100 p1 SM บัฟเฟอร์ (100 มม.ทริสเรทติ้ง HC1, 10 มม. MgC12, pH 7.4) DNA ของ phage ถูกจัดเตรียมไว้สำหรับขยาย โดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) โดยรอบสองของแช่แข็ง-ละลายที่ -80 " แทรก cDNA ถูกขยาย โดยการแปรสภาพ (94" 1 นาที), 30 รอบรองพื้นหลอม (45" นาที for1) และส่วนขยาย (72 นิ้ว 2.5 นาที) cycler ความร้อนที่ดีเอ็นเอลเมอเพอร์ Cetus ปฏิกิริยาดำเนินการใน 10 มม.ทริสของ HCI (pH 8.3 ที่ 25"), 50 มม. KCl, 1.5 มม. MgC12, 200 p ~ dATP, dGTP, dCTP และ dTTP, 0.4 p ~ SK ไพรเมอร์ (5'-TCTAGAACTAGTGCATC-3'), 0.4 p ~ KS สีรองพื้น (5 " CGAGG TCGACGGTATCG3'), 3 DNA ของ phage p1 และพอลิเมอเรส Taq หน่วยหนึ่งในเสียงที่ดีสุดท้ายของ 50 ปรับ Amplified cDNA โคลนถูกแสดงเป็นภาพบน 0.8% agarose เจเลอะโบรไมด์ ethidium

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

cDNA สอบสวนแยก: ขั้นตอนการแยกโคลนและการตรวจคัดกรองความแตกต่างจะคล้ายกับที่อธิบายโดย POCSON และ ZOUROS (1994) ประมาณ 2 กรัมของตับจะถูกลบออกจากปลาผู้ใหญ่อสัญญีแช่แข็งทันทีในไนโตรเจนเหลวและใช้เป็นแหล่งที่มาของ mRNA สำหรับการก่อสร้างห้องสมุด cDNA ใน phagemid เวกเตอร์แลมบ์ดา Bluemid ที่ (Clontech) โคลนยีนที่แยกได้โดยการชุบออกห้องสมุดที่ความหนาแน่นต่ำและถ่ายโอนโล่บุคคล 100 P1 บัฟเฟอร์เอสเอ็ม (100 มิลลิเมตร Tris-HC1 10 มิลลิ MgC12 ค่า pH 7.4) Phage ดีเอ็นเอกำลังเตรียมพร้อมสำหรับการขยายโดยวิธี Polymerase chain reaction (PCR) สองรอบของการละลาย freeze- ที่ -80 ". แทรกยีนถูกขยายจาก 30 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติ (94" เป็นเวลา 1 นาที) หลอมไพรเมอร์ (45 "for1 นาที ) และการขยาย (72 "2.5 นาที) ในการระบายความร้อน Cycler เพอร์กินเอลเมอ Cetus ดีเอ็นเอ ปฏิกิริยาที่ได้ดำเนินการใน 10 มิลลิ Tris-HCI (pH 8.3 ที่ 25 ") ขนาด 50 มมโพแทสเซียมคลอไรด์ 1.5 มิลลิ MgC12 200 P ~ dATP, dGTP, dCTP และ dTTP 0.4 P ~ SK ไพรเมอร์ (5'- TCTAGAACTAGTGCATC-3 ' ) 0.4 P ~ KS ไพรเมอร์ (5 "CGAGG TCGACGGTATCG3 ') 3 P1 ดีเอ็นเอทำลายจุลินทรีย์และหนึ่งหน่วย Taq โพลิเมอร์ในปริมาณสุดท้ายของ 50 PL ขยายโคลนยีนถูกมองเห็นได้ที่ 0.8% agarose เจลย้อมด้วย ethidium bromide

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดีเอ็นเอโพรบแยก : ขั้นตอนสำหรับการโคลนและการคัดกรองรูปแบบจะคล้ายกับที่อธิบายโดย pocson และ zouros ( 1994 ) ประมาณ 2 กรัมของตับจะถูกลบออกจากการวางยาสลบ ผู้ใหญ่ คอด ทันทีแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว และใช้เป็นแหล่งของ mRNA สำหรับการก่อสร้างของ cDNA ห้องสมุดใน phagemid เวกเตอร์แลมบ์ดา bluemid ( clontech ) โคลน cDNA ที่แยกได้โดยการชุบจากห้องสมุดที่ความหนาแน่นต่ำและถ่ายโอนโล่บุคคล 100 P1 SM บัฟเฟอร์ ( 100 มม. tris-hc1 10 มม. mgc12 pH 7.4 ) ฟาเตรียมขยายดีเอ็นเอโดยปฏิกิริยาลูกโซ่โดยสองรอบแช่แข็ง - ละลายที่อุณหภูมิ - 80 " วิธีแทรกอยู่โดยขยาย 30 รอบ ( 94 " ( 1 นาที ) , ไพรเมอร์อบ 45 " for1 มิน ) และนามสกุล ( 72 " 2.5 นาที ) ในเพอร์กินเอลเมอร์ ซีตัส ดีเอ็นเอ Thermal cycler . ปฏิกิริยาออกมาโดยบริษัท 10 มม. ( pH 8.3 ที่ 25 " ) , . 50 มม. 1.5 มม. mgc12 200 P ~ datp dgtp dctp dttp , , และ 0.4 P ~ SK รองพื้น ( 5 " - tctagaactagtgcatc-3 " ) , 0 p ~ KS รองพื้น ( 5 " cgagg tcgacggtatcg3 3 P1 " ) เฟจดีเอ็นเอและหนึ่งหน่วยได้ดีใช้ในปริมาณขั้นสุดท้าย 50 ต้นขยาย cDNA โคลนคือปรากฏการณ์ที่ 0.8% เจล ( เปื้อนทิเดียมโบรไมด์ .