2.3. Yeast identificationITS1-5.8rD

2.3. Yeast identification
ITS1-5.8rDNA-ITS2 PCR-RFLP: yeast isolates identification was performed
by the PCR-RFLP method described by Esteve-Zarzoso et al.
(1999). DNAs from liquid cultures were extracted according to Querol,
Barrio, and Ramon (1992). PCR reaction mixtures (75 μl) containing
0.5 μMprimer ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) and0.5 μMprimer
ITS4 (5′-TCCTCCCGCTTATTGATATGC-3′) (White, Bruns, Lee, & Taylor,
1990), 10 μM deoxynucleotides (Promega), 1.5 mM MgCl2 and 1 unit
DNA polymerase (Promega) were prepared. Amplifications were performed
in a thermocycler (Thermo Electron, USA) in the following conditions:
initial denaturation at 95 °C for 5 min; 30 cycles of denaturating
at 94 °C for 1 min; annealing at 55.5 °C for 2 min; extension at 72 °C for
2min and a final extension step at 72 °C for 10min. PCR products
(10 μl) were digested without further purification with the restriction
endonucleases CfoI, HaeIII and HinfI (Roche). The PCR products and
their restriction fragments were separated on 1% and 3% (w/v) agarose
gels, respectively, with 1× TAE buffer. After electrophoresis, gels were
stained with ethidium bromide, visualized under UV light in a G-Box
Syngene-Genesis 10 UV Scanner (UK). Fragment sizes were estimated
by comparison against a DNA ladder (100 bp BioRad). Yeast isolates
were grouped according to their RFLP profiles and compared with the
RFLP patterns described by Guillamón, Sabaté, Barrio, Cano, and
Querol (1998), Esteve-Zarzoso et al. (1999), Sabate, Cano, Esteve-
Zarzoso, and Guillamon (2002) and de Llanos Frutos, Fernandez-
Espinar, and Querol (2004).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. รหัสยีสต์ITS1-5.8rDNA-ITS2 PCR-RFLP: ดำเนินการรหัสแยกยีสต์โดยวิธี PCR-RFLP อธิบายไว้โดย Esteve Zarzoso et al(1999) การสกัดดีเอ็นเอจากวัฒนธรรมของเหลวตาม Querolพาราไดส์ และ Ramon (1992) ผสมปฏิกิริยา PCR (75 μl) ที่ประกอบด้วย0.5 μMprimer ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) and0.5 μMprimerITS4 (5′-TCCTCCCGCTTATTGATATGC-3′) (สีขาว บรันซ์ ลี และ เทย์เลอร์1990), 10 μ m deoxynucleotides (Promega), 1.5 มม. MgCl2 และ 1 หน่วยมีเตรียมดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (Promega) ดำเนินการ amplificationsในเครื่อง thermocycler (เทอร์โมอิเล็กตรอน สหรัฐอเมริกา) ในเงื่อนไขต่อไปนี้:denaturation เริ่มต้นที่ 95 ° C 5 นาที denaturating 30 รอบที่ 94 ° C สำหรับ 1 นาที หลอมที่ 55.5 ° C สำหรับ 2 นาที นามสกุลที่ 72 ° C สำหรับ2 นาทีและเป็นขั้นตอนสุดท้ายขยาย 72 ° c 10 นาทีผลิตภัณฑ์ PCR(10 μl) ถูกย่อยสลายโดยไม่ฟอกเพิ่มเติมมีข้อจำกัดendonucleases CfoI, HaeIII และ HinfI (Roche) ผลิตภัณฑ์ PCR และส่วนข้อจำกัดของพวกเขาต้องแยกจากกัน 1% และ 3% (w/v) agaroseเจล ตามลำดับ 1 × TAE บัฟเฟอร์ หลังจากอิ เจได้ย้อม ด้วยโบรไมด์ ethidium มองเห็นใต้แสงยูวีใน G-กล่องSyngene-ปฐมกาล 10 UV สแกนเนอร์ (UK) ส่วนขนาดได้ประมาณโดยการเปรียบเทียบ กับดีเอ็นเอบันได (100 bp BioRad) แยกยีสต์จัดกลุ่มตามส่วน RFLP และเมื่อเทียบกับการรูปแบบ RFLP โดย Guillamón, Sabaté พาราไดส์ โน และQuerol (1998), Esteve Zarzoso et al. (1999), Sabate โน Esteve-Zarzoso และ Guillamon (2002) และ de Llanos Frutos เฟอร์นานเดซ -Espinar และ Querol (2004)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 บัตรประจำตัวยีสต์
ITS1-5.8rDNA-ITS2 PCR-RFLP ยีสต์แยกบัตรประจำตัวถูกดำเนินการ
โดยวิธี PCR-RFLP อธิบายโดย Esteve-Zarzoso et al.
(1999) DNAs จากวัฒนธรรมของเหลวถูกสกัดตาม Querol,
ริโอและราโมน (1992) PCR ผสมปฏิกิริยา (75 ไมโครลิตร) ที่มี
0.5 μMprimer ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ') and0.5 μMprimer
ITS4 (5'-TCCTCCCGCTTATTGATATGC-3') (สีขาว, บรูสลีและเทย์เลอร์,
1990), 10 ไมครอน deoxynucleotides (Promega) 1.5 มิลลิ MgCl2 และ 1 หน่วย
DNA Polymerase (Promega) ได้จัดทำ เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการ
ใน thermocycler (เทอร์โมอิเลคตรอน, สหรัฐอเมริกา) ในเงื่อนไขต่อไปนี้:
denaturation เริ่มต้นที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที; 30 รอบของ denaturating
ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที; หลอมที่ 55.5 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาที; ส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
2 นาทีและเป็นขั้นตอนสุดท้ายส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์
(10 ไมโครลิตร) ถูกย่อยสลายโดยไม่บริสุทธิ์ต่อไปด้วยข้อ จำกัด
endonucleases CfoI, HaeIII และ HinfI (Roche) ผลิตภัณฑ์ PCR และ
ชิ้นส่วนข้อ จำกัด ของพวกเขาถูกแยกออกจากกันในวันที่ 1% และ 3% (w / v) agarose
เจลตามลำดับโดยมี 1 × TAE บัฟเฟอร์ หลังจาก electrophoresis เจลถูก
ย้อมด้วย ethidium bromide, มองเห็นภายใต้แสงยูวีใน G-Box
Syngene ปฐม 10 UV เครื่องสแกนเนอร์ (สหราชอาณาจักร) ขนาดชิ้นส่วนประมาณ
โดยเปรียบเทียบกับบันไดดีเอ็นเอ (100 bp BioRad) สายพันธุ์ยีสต์
ถูกจัดกลุ่มตามโปรไฟล์ RFLP ของพวกเขาและเมื่อเทียบกับ
รูปแบบ RFLP อธิบายโดย Guillamon, Sabaté, ริโอคาโนและ
Querol (1998), Esteve-Zarzoso et al, (1999), Sabate, คาโน Esteve-
Zarzoso และ Guillamon (2002) และ Llanos Frutos, Fernandez-
Espinar และ Querol (2004)