MethodsClinical specimensRectal swa

Methods
Clinical specimens
Rectal swabs submitted to our laboratory for screening were received from multiple hospitals within the Gauteng province of South Africa. Screening rectal swabs are submitted from patients considered to be at risk of being colonized with CPE. Although these risk factors may vary between hospitals, there is general agreement among the major hospital groups as to what is considered a risk factor. These include: prior hospi- talization within the last three to 12 months; transfer from any other healthcare facility; admission from a long-term care facility; intensive care unit (ICU) admission; use of broad- spectrum antibiotics; invasive device usage; patients on dial- ysis; and immunocompromised patients. A single dry rayon rectal swab (Copan Diagnostics, Inc., Brescia, Italy) was sub- mitted for analysis, and, upon receipt in the laboratory, was put into 2 mL sterile saline.
PCR-based assay
PCR was performed using the Roche assay developed by TIB MolBiol GmBH (Berlin, Germany) for the detection of six car- bapenemase genes. Briefly, 1 mL of the sample-saline solution was processed by the Nuclisens! Easymag instrument (bio- Me ́rieux, Marcy l’Etoile, France) to produce a 55 mL eluate, containing isolated nucleic acid from the sample. Five micro- litres of the eluate were then added to 15 mL of two separate PCR reaction mixes containing primers and probes for the following carbapenemase genes: (i) blaNDM, blaOxA-48-like, blaKPC; (ii) blaGES, blaIMP, blaVIM. The sample mixture was then analysed by real-time PCR on a LightCycler 2.0 instrument. A cycle threshold (CT) value of 36 was considered positive in accordance with the recommendations of the assay developer (TIB MolBiol).
Culture-based assay
A modified CDC protocol for detection of carbapenemase- producing Klebsiella spp. and Escherichia coli was employed.12 A 5 mL volume of nutrient broth containing a 10 mg ertapenem disk was inoculated with the remaining 1mL of rectal swab saline sample, and incubated overnight at 35C ambient air. The sample was then vortexed and 100 mL sub- cultured on to a MacConkey agar plate. After 24e48 h incuba- tion, all Gram-negative colonies were identified to species level using matrix-assisted laser desorptioneionization time-of-flight mass spectrometry (bioMe ́rieux) and subjected to the PCR- based assay as described above for determination of the pres- ence of carbapenemase genes: blaNDM, blaKPC, blaOxA-48, blaVIM, blaIMP, blaGES.
Determination of analytical sensitivity and specificity
Control strains
With the exception of Klebsiella pneumoniae ATCC! BAA- 1705 (KPC) control strains utilized in this study were obtained from clinical isolates of K. pneumoniae (OXA-48; NDM-1; GES) and Enterobacter cloacae (VIM-1; IMP). These isolates had been independently verified, using PCR techniques, by other private and/or National Institute for Communicable Diseases labora- tories. The MIC to ertapenem for each control strain was determined by Etest! (bioMe ́rieux).
PCR and culture
For each control strain, the following procedure was per- formed. From an initial inoculum of 105 cfu/mL, serial 10-fold dilutions were made in normal saline to give a range of 105e101 cfu/mL. These dilutions were then used for both PCR and culture analytical sensitivity and specificity analysis. A swab (the same one used for collection of rectal screening swab) was inserted into each dilution, rotated and mixed, and then transferred to 2 mL of normal saline in line with the pro- cedure for clinical samples. PCR and culture were then per- formed on each dilution as described above.
Effect of varied inoculum and MIC on culture results
Six clinical isolates of OXA-48-like K. pneumoniae with ertapenem MIC ranging from 2 to 4 mg/mL were prepared in serial 10-fold dilutions of 105e101 cfu/mL. These were then cultured as described above to determine the limit of

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิธีการไว้เป็นตัวอย่างที่ทางคลินิกไส้ swabs ส่งไปห้องปฏิบัติการของเราสำหรับคัดกรองได้รับจากโรงพยาบาลหลายภายใน Gauteng จังหวัดของแอฟริกาใต้ มีส่งตรวจไส้ swabs จากผู้ป่วยถือว่าเป็นความเสี่ยงของการยึดครองกับ CPE แม้ว่าปัจจัยเสี่ยงเหล่านี้อาจแตกต่างกันระหว่างโรงพยาบาล มีข้อตกลงทั่วไประหว่างกลุ่มโรงพยาบาลที่สำคัญเป็นสิ่งที่ถือว่าเป็นปัจจัยเสี่ยง เหล่านี้รวมถึง: hospi talization ทราบภายในสามเดือน 12 สุดท้าย โอนย้ายจากใด ๆ อื่น ๆ สุขภาพสิ่งอำนวยความสะดวก เข้าชมจากสถานการดูแลระยะยาว เข้าชมเร่งรัดดูแลหน่วย (ฉุกเฉิน) ใช้ยาปฏิชีวนะสเปกตรัมกว้าง การใช้อุปกรณ์รุกราน ทางโทรศัพท์-ysis และผู้ป่วยภูมิคุ้มกัน เป็นเรยองเดียวแห้งไส้กวาด (Copan วินิจฉัย Inc. เบรสเซีย อิตาลี) ถูกย่อย-mitted สำหรับการวิเคราะห์ และ เมื่อได้รับในห้องปฏิบัติการ ได้ใส่ลงในน้ำเกลือฆ่าเชื้อ 2 mLผลวิเคราะห์PCR ที่ดำเนินการโดยใช้ทดสอบโรโดย TIB MolBiol GmBH (เบอร์ลิน เยอรมนี) สำหรับการตรวจพบยีน bapenemase รถหก สั้น ๆ 1 มิลลิลิตรของตัวอย่างน้ำเกลือถูกประมวลผล โดยการ Nuclisens เครื่องมือ Easymag (ไบ - ฉัน ́rieux, Marcy l'Etoile ฝรั่งเศส) ผลิตเป็น eluate 55 mL ประกอบด้วยกรดนิวคลีอิกแยกจากตัวอย่าง ไมโครลิตรห้าของ eluate ถูกเพิ่มเข้าไป 15 mL ของสองแยก PCR ปฏิกิริยาออกแบบผสมผสานประกอบด้วยไพรเมอร์และคลิปปากตะเข้สำหรับยีน carbapenemase ต่อไปนี้: (i) blaNDM, blaOxA-48-เหมือน blaKPC (ii) blaGES, blaIMP, blaVIM ส่วนผสมตัวอย่างได้แล้ว analysed โดย PCR แบบเรียลไทม์บนเครื่องมือ LightCycler 2.0 ค่าขีดจำกัด (CT) รอบ 36 เขาก็บวกตามคำแนะนำของนักวิเคราะห์ (TIB MolBiol)วิเคราะห์ตามวัฒนธรรมโพรโทคอ CDC แก้ไขตรวจโอ Klebsiella carbapenemase-ผลิตและ Escherichia coli employed.12 A 5 mL ปริมาณธาตุอาหารซุปประกอบด้วยดิสก์ ertapenem 10 มก. inoculated กับมล. 1 เหลือของไส้กวาดอย่าง saline และ incubated ค้างคืนที่ 35 C สภาวะอากาศได้ ตัวอย่างได้แล้ว vortexed และ 100 มลย่อย-อ่างระบบจาน MacConkey agar หลังจาก 24e48 h incuba-สเตรชัน อาณานิคมทั้งหมดแบคทีเรียแกรมลบได้ระบุระดับสายพันธุ์ที่ใช้เลเซอร์ช่วยเมตริกซ์ desorptioneionization เวลาของเที่ยวบินโตรเมทรี (ชีวนิเวศ ́rieux) และอยู่ภายใต้การทดสอบ PCR-ตามที่อธิบายข้างต้นสำหรับการกำหนด ence เค้นของยีน carbapenemase: blaNDM, blaKPC, blaOxA 48, blaVIM, blaIMP, blaGESกำหนดวิเคราะห์ความไวและ specificityสายพันธุ์ควบคุมยกเว้น Klebsiella pneumoniae ATCC สายพันธุ์ควบคุมบา - 1705 (เคพีซี) ที่ใช้ในการศึกษานี้ได้รับมาจากคลินิกแยกของคุณ pneumoniae (OXA-48 NDM-1 GES) และ Enterobacter cloacae (VIM-1 เด็กซน) แยกเหล่านี้ได้รับอิสระตรวจสอบ ใช้เทคนิค PCR โดยส่วนตัวอื่น ๆ และ/หรือ สถาบันแห่งชาติโรค Communicable labora tories MIC เพื่อ ertapenem ในแต่ละต้องใช้ตัวควบคุมถูกกำหนด โดย Etest (ชีวนิเวศ ́rieux)PCR และวัฒนธรรมสำหรับแต่ละการควบคุมต้องใช้ ขั้นตอนต่อไปนี้ถูกต่อ - รูปแบบการ จาก inoculum ที่เริ่มต้นของ 105 cfu/mL, dilutions 10-fold ประจำแปลงในน้ำเกลือปกติให้มาย 105e101 cfu/mL Dilutions เหล่านี้แล้วใช้ PCR และวัฒนธรรมวิเคราะห์ความไว และ specificity วิเคราะห์ กวาดกันหนึ่งใช้สำหรับเก็บของกวาดตรวจไส้) ถูกแทรกลงในแต่ละการเจือจาง หมุนผสม แล้ว โอนย้ายไป 2 mL ของน้ำเกลือปกติกับ cedure โปรสำหรับคลินิกอย่าง PCR และวัฒนธรรมถูกแล้วต่อ - รูปแบบในแต่ละการเจือจางตามที่อธิบายไว้ข้างต้นผลของ inoculum หลากหลายและ MIC วัฒนธรรมผลลัพธ์6 ทางคลินิกแยกของ pneumoniae OXA-48-เหมือนคุณกับ ertapenem MIC ตั้งแต่ 2 ถึง 4 mg/mL ถูกเตรียมใน dilutions 10-fold ประจำของ 105e101 cfu/mL เหล่านี้ได้แล้วอ่างที่อธิบายข้างต้นเพื่อกำหนดขีดจำกัดของ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิธีการ
ตรวจทางคลินิก
Swabs ทวารหนักส่งไปยังห้องปฏิบัติการของเราสำหรับการตรวจคัดกรองที่ได้รับจากโรงพยาบาลหลายภายในจังหวัด Gauteng แอฟริกาใต้ การตรวจคัดกรอง Swabs ทวารหนักที่ถูกส่งจากผู้ป่วยถือเป็นความเสี่ยงของการตั้งรกรากกับ CPE แม้ว่าปัจจัยเสี่ยงเหล่านี้อาจแตกต่างกันระหว่างโรงพยาบาลที่มีความตกลงทั่วไปในกลุ่มโรงพยาบาลที่สำคัญเป็นสิ่งที่ถือว่าเป็นปัจจัยเสี่ยง เหล่านี้รวมถึง: talization hospi- ก่อนภายในสามถึง 12 เดือนที่ผ่านมา; โอนจากสิ่งอำนวยความสะดวกด้านการดูแลสุขภาพอื่น ๆ ; เข้ารับการรักษาจากสิ่งอำนวยความสะดวกการดูแลระยะยาว; หอผู้ป่วยหนัก (ไอซียู) เข้ารับการรักษา; การใช้ยาปฏิชีวนะที่ทำงานแบบกว้างสเปกตรัม; การใช้งานอุปกรณ์รุกราน; ผู้ป่วยที่ ysis dial-; และผู้ป่วยที่มีภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่อง สังเคราะห์แห้งเดียวเช็ดล้างทวารหนัก (Copan วินิจฉัย, Inc, เบรสชา, อิตาลี) ถูกย่อย mitted สำหรับการวิเคราะห์และเมื่อได้รับในห้องปฏิบัติการได้รับการใส่ลงไปใน 2 มิลลิลิตรน้ำเกลือปลอดเชื้อ
ทดสอบ PCR-based
PCR ได้รับการดำเนินการโดยใช้โรช ทดสอบการพัฒนาโดย TIB MolBiol GMBH (เบอร์ลิน, เยอรมนี) สำหรับการตรวจหายีนที่หก bapenemase Car- สั้น ๆ 1 มิลลิลิตรของการแก้ปัญหาตัวอย่างน้ำเกลือถูกประมวลผลโดย Nuclisens! Easymag ตราสาร (ชีวภาพฉัน Rieux ร์ซี่ L'Etoile, ฝรั่งเศส) ในการผลิต 55 มิลลิลิตร eluate ที่ประกอบด้วยกรดนิวคลีอิกที่แยกจากตัวอย่าง ห้าลิตรของไมโคร eluate แล้วเพิ่มถึง 15 มิลลิลิตรของทั้งสองปฏิกิริยา PCR แยกผสมที่มีไพรเมอร์และตรวจหายีน carbapenemase ต่อไปนี้: (i) blaNDM, blaOxA-48 เหมือน blaKPC; (ii) blaGES, blaIMP, blaVIM ส่วนผสมตัวอย่างได้รับการวิเคราะห์แล้วโดย Real-time PCR ที่ 2.0 เครื่องมือ LightCycler ค่าเกณฑ์วงจร (CT) ของ 36 ได้รับการพิจารณาในเชิงบวกในตามคำแนะนำของนักพัฒนาทดสอบ (TIB MolBiol)
ทดสอบวัฒนธรรมที่ใช้
โปรโตคอล CDC แก้ไขสำหรับการตรวจหา carbapenemase- ผลิต Klebsiella spp และ Escherichia coli ถูก employed.12 ปริมาณ 5 มิลลิลิตรของน้ำซุปที่มีส่วนผสมของสารอาหารที่ดิสก์ ertapenem 10 มก. ได้รับเชื้อด้วยส่วนที่เหลืออีก 1 mL ของทวารหนักตัวอย่างน้ำเกลือเช็ดล้างและบ่มค้างคืนที่ 35 องศาเซลเซียสอากาศแวดล้อม กลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการ vortex แล้วและ 100 มลย่อยที่เพาะเลี้ยงบนจาน MacConkey agar หลังจาก 24e48 ชั่วโมง incuba- การทั้งหมดอาณานิคมแกรมลบมีการระบุสายพันธุ์ระดับการใช้เมทริกซ์ช่วย desorptioneionization เลเซอร์เวลาของเที่ยวบินมวลสาร (นิเวศน์วิทยา Rieux) และภายใต้การทดสอบตาม PCR- ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นสำหรับความมุ่งมั่นของปธน - ence ของยีน carbapenemase: blaNDM, blaKPC, blaOxA-48, blaVIM, blaIMP, blaGES
กำหนดการวิเคราะห์ความไวและความจำเพาะ
การควบคุมสายพันธุ์
ด้วยข้อยกเว้นของ Klebsiella pneumoniae ATCC! BAA- สายพันธุ์ 1705 (KPC) การควบคุมที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ได้มาจากเชื้อทางคลินิกของเค pneumoniae (OXA-48; NDM-1; GES) และน้ำใต้ดิน Enterobacter (VIM-1; IMP) เชื้อเหล่านี้ได้รับการตรวจสอบโดยใช้เทคนิค PCR โดยอื่น ๆ ภาคเอกชนและ / หรือสถาบันแห่งชาติเพื่อโรคติดต่อดังสนั่นองทดลอง MIC จะ ertapenem สำหรับสายพันธุ์แต่ละตัวควบคุมถูกกำหนดโดย Etest! (นิเวศน์วิทยา Rieux)
วิธี PCR และวัฒนธรรม
สำหรับสายพันธุ์ควบคุมแต่ละขั้นตอนต่อไปที่ถูกสร้างขึ้นที่แน่นอนได้ จากหัวเชื้อเริ่มต้นของ 105 cfu / ml อนุกรมเจือจาง 10 เท่าได้ทำในน้ำเกลือเพื่อให้ช่วงของ 105e101 cfu / mL เจือจางเหล่านี้ถูกนำมาใช้ทั้งวิธี PCR และวัฒนธรรมการวิเคราะห์ความไวและความจำเพาะในการวิเคราะห์ ไม้กวาด (หนึ่งเดียวกับที่ใช้ในการเก็บรวบรวมของไม้กวาดคัดกรองทางทวารหนัก) ถูกใส่เข้าไปในแต่ละเจือจางหมุนผสมและจากนั้นโอนไปยัง 2 มิลลิลิตรน้ำเกลือสอดคล้องกับ cedure โปรสำหรับตัวอย่างทางคลินิก PCR และวัฒนธรรมได้แล้วลำดับที่เกิดขึ้นในแต่ละเจือจางตามที่อธิบายไว้ข้างต้น
ผลกระทบของเชื้อที่หลากหลายและ MIC วัฒนธรรมผล
หกเชื้อทางคลินิกของ OXA-48 เหมือน pneumoniae เคโดยมีค่า MIC ertapenem ตั้งแต่ 2-4 mg / ml ได้จัดทำขึ้น อนุกรมเจือจาง 10 เท่าของ 105e101 cfu / mL เหล่านี้เป็นแล้วเพาะเลี้ยงตามที่อธิบายไว้ข้างต้นเพื่อกำหนดขีด จำกัด ของ