After a 6-day osteogenic induction,

After a 6-day osteogenic induction, murineMC3T3-E1 cells were incubated
using a serum-free medium, which contained Rb2 and/or H2O2
for 2 days. The total cellular RNA was extracted from these cells using
Trizol reagent. Single strand cDNA synthesis was determined using the
Prime Script RT reagent kit (TaKaRa). The RT-PCR was performed
using the CFX96 (BIO-RAD) instrument, and individual PCRs were conducted
in 96-well optical reaction plates using SYBR Green-I (TaKaRa)
according to the manufacturer's instructions. Target gene (Alp, Col1a1,
Ocn and Opn) expressions were normalized to the reference gene
β-actin. The 2−ΔΔCt method was applied to calculate the relative gene
expression. These PCR products were subjected to a melting curve
analysis and a standard curve to confirm the correct amplification. All
of the PCRs were performed in triplicate, and the primers used for PCR
are shown in Table 1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

หลังจากที่ 6-วัน osteogenic เหนี่ยวนำ เซลล์ murineMC3T3 E1 ได้ incubatedใช้สื่อฟรีเซรั่ม ซึ่งประกอบด้วย Rb2 หรือ H2O2วัน 2 รวมเซลล์อาร์เอ็นเอที่สกัดจากเซลล์เหล่านี้โดยใช้รีเอเจนต์ Trizol การสังเคราะห์ cDNA สแตรนด์เดียวถูกกำหนดโดยใช้การนายกชุดรีเอเจนต์ RT สคริปต์ (TaKaRa) ทำการ RT-PCRใช้ CFX96 ที่ทำตราสาร (ไบ-RAD) และ PCRs แต่ละในปฏิกิริยาแสงดี 96 แผ่นใช้ SYBR Green-ฉัน (TaKaRa)ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ยีนเป้าหมาย (แอลป์ Col1a1Ocn และ Opn) นิพจน์ได้ตามปกติการยีนอ้างอิงΒแอกติน วิธี 2−ΔΔCt ถูกใช้เพื่อคำนวณยีนญาตินิพจน์ ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกต้องโค้งละลายวิเคราะห์และเส้นโค้งมาตรฐานเพื่อยืนยันขยายถูกต้อง ทั้งหมดของ PCRs ได้ดำเนินการใน triplicate และไพรเมอร์ที่ใช้ PCRจะแสดงในตารางที่ 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

หลังจากที่มีการเหนี่ยวนำ osteogenic 6 วันเซลล์ murineMC3T3-E1
ถูกบ่มโดยใช้สื่อกลางในซีรั่มฟรีที่มีRb2 และ / หรือ H2O2
2 วัน RNA
รวมโทรศัพท์มือถือถูกสกัดจากเซลล์เหล่านี้โดยใช้น้ำยาTrizol การสังเคราะห์ยีนสาระเดี่ยวถูกกำหนดโดยใช้นายกรัฐมนตรีสคริปต์ RT ชุดน้ำยา (Takara)
RT-PCR
ได้ดำเนินการโดยใช้CFX96 (BIO-RAD) เครื่องมือและ PCRs
ของแต่ละบุคคลได้ดำเนินการในแผ่นปฏิกิริยา96 หลุมโดยใช้แสงสีเขียว SYBR-I (Takara)
ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ยีนเป้าหมาย (Alp, Col1a1,
OCN และ OPN)
การแสดงออกเป็นปกติยีนอ้างอิงβ-โปรตีน วิธีที่ 2
ΔΔCtถูกนำมาใช้ในการคำนวณยีนญาติแสดงออก ผลิตภัณฑ์เหล่านี้ PCR
ถูกยัดเยียดให้โค้งละลายการวิเคราะห์และการโค้งมาตรฐานเพื่อยืนยันการใช้เครื่องขยายเสียงที่ถูกต้อง ทั้งหมดของ PCRs ถูกดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่าและไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ PCR จะแสดงในตารางที่ 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

หลังจาก 6 วัน osteogenic เหนี่ยว murinemc3t3-e1 เซลล์ถูกบ่ม
ใช้ serum-free ขนาดกลาง ซึ่งมี rb2 และ / หรือ H2O2
2 วัน ยีนของเซลล์ทั้งหมดสกัดจากเซลล์เหล่านี้ใช้
trizol เกิดปฏิกิริยา การสังเคราะห์ cDNA เส้นเดียวใช้วิเคราะห์
นายกรัฐมนตรีสคริปต์ RT รีเอเจนต์ Kit ( ทาการะ ) RT-PCR ทำการ
ใช้ cfx96 ( Bio-rad ) เครื่องดนตรีpcrs บุคคลและทดสอบในปฏิกิริยาด้วยแสง
96 แผ่นโดยใช้ SYBR green-i ( ทาการะ )
ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ยีนเป้าหมาย ( ALP col1a1
, , และ ocn OPN ) สีหน้าเป็นปกติเพื่อการอ้างอิงยีนบีตา - actin
. 2 −ΔΔ CT วิธีถูกนำมาใช้เพื่อคำนวณการแสดงออกของยีน
ญาติ ผลิตภัณฑ์ PCR เหล่านี้ถูกหลอม
โค้งการวิเคราะห์และเส้นโค้งมาตรฐานเพื่อยืนยันการเพิ่มปริมาณที่ถูกต้อง ทั้งหมด pcrs
ของจำนวนทั้งสามใบ และไพรเมอร์ที่ใช้ PCR
จะแสดงในตารางที่ 1