Western ImmunoblotTotal protein was

Western Immunoblot
Total protein was extracted from 1.0 mm tissue punches of total MPOA, and tissue from two
animals was pooled into each tube. Tissue samples were homogenized in RIPA buffer 10X
(Cell Signaling), and supernatant was extracted; protein estimates were run on this
supernatant using spectrophotometry (PowerWaveX; BioTek, MD). These protein estimates were used as a standard for loading volume (50 μg of protein each) onto 10%
polyacrylamide gels for separation by SDS electrophoresis.
The fractionated protein from electrophoresis was transferred to a polyvinylidene difluoride
(PVDF) membrane. Between incubations, membranes were washed extensively with 0.1M
phosphate buffered saline (PBS, pH=7.35). All washing and incubations were performed at
room temperature unless otherwise noted. Membranes were incubated in a blocking solution
consisting of 5% non-fat dry milk in PBS + 0.1% Tween for 1 hr. After blocking, the
membrane was incubated overnight (18-20 hours) at 4°C in blocking solution and
DARPP-32, phosphoThr34 rabbit polyclonal antibody (1:1k, Millipore, CA). The following
day membranes were incubated for 1 hr in horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat
anti-rabbit IgG secondary antibody (1:2k, Pierce Biotechnology, IL). The membrane was
then assessed for HRP-conjugated chemiluminescence (ECL; Amersham Biosciences, NJ)
by exposing the membrane to Kodak BioMax film. The membrane was then stripped and
labeled against mouse anti-ß-actin monoclonal antibody (1:1k, Sigma-Aldrich, MO) as a
loading control. The developed films were scanned into a computer and band density was
quantified using the NIH ImageJ program (Version 1.33U, NIH).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Immunoblot ตะวันตกรวมโปรตีนที่สกัดจาก 1.0 มม.เจาะเนื้อเยื่อ MPOA รวม และเนื้อเยื่อจากสองสัตว์ถูกทางถูกพูในแต่ละหลอด ตัวอย่างเนื้อเยื่อถูก homogenized เป็นกลุ่มในบัฟเฟอร์ริป้าราคา 10 X(เซลล์ Signaling), และถูกดึง supernatant ประเมินโปรตีนถูกเรียกใช้นี้supernatant ใช้ spectrophotometry (PowerWaveX BioTek, MD) ประเมินโปรตีนเหล่านี้ถูกใช้เป็นมาตรฐานสำหรับโหลดเสียง (50 μg ของโปรตีนแต่ละ) ลง 10%polyacrylamide gels สำหรับแยกโดย SDS electrophoresisโปรตีน fractionated จาก electrophoresis ถูกถ่ายโอนไป polyvinylidene difluorideเมมเบรน (PVDF) ระหว่าง incubations เยื่อหุ้มถูกล้างอย่างกว้างขวาง ด้วย 0.1Mฟอสเฟต buffered น้ำเกลือ (PBS, pH = 7.35) ซักผ้าและ incubations ทั้งหมดได้ดำเนินการที่ห้องอุณหภูมิแปลง เข้าที่ incubated ในการแก้ปัญหาการบล็อคประกอบด้วย 5% ไม่ใช่ไขมันนมแห้งใน PBS + 0.1% Tween ใน 1 ชม หลังบล็อก การเมมเบรนถูก incubated แอร์พอร์ตโอเวอร์ไนท์ (18-20 ชั่วโมง) ที่ 4° C ในบล็อกแก้ปัญหา และDARPP-32, phosphoThr34 กระต่าย polyclonal แอนติบอดี (1:1 k มาก CA) ต่อไปนี้เข้าวันที่ incubated ใน 1 ชั่วโมงใน horseradish peroxidase (HRP) -แพะกลวงกระต่ายป้องกัน IgG รองแอนติบอดี (1:2 เค เทคโนโลยีชีวภาพเพียร์ซ IL) เยื่อได้แล้ว ประเมิน chemiluminescence HRP กลวง (ECL เวลาออก Amersham, NJ)โดยเปิดเผยเยื่อฟิล์มโกดัก BioMax เมมเบรนจะถูกปล้นแล้ว และป้ายกับเมาส์แอนติบอดี monoclonal ป้องกันบาทแอกติน (1:1 k ซิก Aldrich, MO) เป็นการโหลดตัวควบคุม ฟิล์มพัฒนาถูกสแกนเข้าเครื่องคอมพิวเตอร์ และมีความหนาแน่นของวงquantified โดยใช้โปรแกรม NIH ImageJ (รุ่น 1.33U, NIH)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เวสเทิร์ Immunoblot
รวมโปรตีนสกัดจาก 1.0 มิลลิเมตรเจาะเนื้อเยื่อจากทั้งหมด MPOA และเนื้อเยื่อจากสอง
สัตว์ถูกรวบรวมในแต่ละหลอด ตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกปั่นใน RIPA บัฟเฟอร์ 10X
(สัญญาณมือถือ) และใสสกัด; ประมาณการโปรตีนวิ่งเกี่ยวกับเรื่องนี้
โดยใช้สารละลาย spectrophotometry (PowerWaveX; Biotek, MD) ประมาณการโปรตีนเหล่านี้ถูกนำมาใช้เป็นมาตรฐานสำหรับการโหลดเสียง (50 ไมโครกรัมของโปรตีนแต่ละ) ลง 10%
เจลอะคริเลตสำหรับการแยกโดยอิ SDS.
fractionated โปรตีนจากอิเล็กถูกย้ายไป Polyvinylidene difluoride
(PVDF) เมมเบรน ระหว่างฟักตัวของเชื้อที่เยื่อถูกล้างอย่างกว้างขวางกับ 0.1M
น้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (พีบีเอสพีเอช = 7.35) ทั้งหมดซักผ้าและฟักตัวของเชื้อที่ได้รับการดำเนินการที่
อุณหภูมิห้องถ้าไม่สังเกตเห็น เยื่อถูกบ่มในการแก้ปัญหาการปิดกั้น
ซึ่งประกอบด้วย 5% นมไม่มีไขมันแห้งในพีบีเอส + 0.1% Tween เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากที่ปิดกั้น
เมมเบรนถูกบ่มในชั่วข้ามคืน (18-20 ชั่วโมง) ที่ 4 องศาเซลเซียสในการแก้ปัญหาการปิดกั้นและ
DARPP-32, แอนติบอดีกระต่ายโพลี phosphoThr34 (1: 1k, ค, CA) ต่อไปนี้
วันเยื่อถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงในมะรุม peroxidase (HRP) -conjugated แพะ
IgG ต่อต้านกระต่ายรองแอนติบอดี (1: 2k, เพียร์ซเทคโนโลยีชีวภาพ IL) เมมเบรนได้รับการ
ประเมินแล้วสำหรับ HRP-ผัน chemiluminescence (ECL; Amersham ชีววิทยาศาสตร์, นิวเจอร์ซีย์)
โดยการเปิดเผยเมมเบรนจะ Kodak ภาพยนตร์ Biomax เมมเบรนถูกปลดออกแล้วและ
ติดป้ายกับเมาส์ต่อต้าน SS-โปรตีนแอนติบอดี (1: 1k, Sigma-Aldrich, มิสซูรี่) เช่น
การควบคุมการโหลด ภาพยนตร์ที่ได้รับการพัฒนาที่ถูกสแกนลงในคอมพิวเตอร์และความหนาแน่นของวงดนตรีที่ได้รับการ
วัดโดยใช้โปรแกรม NIH ImageJ (ฉบับ 1.33U, NIH)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตะวันตกมมูโนบล็
รวมโปรตีนสกัดจากเนื้อเยื่อของ mpoa มม. เจาะทั้งหมด และเนื้อเยื่อจากสัตว์คือ 2
รวมลงในแต่ละหลอด ตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกบดใน RIPA บัฟเฟอร์ )
( การส่งสัญญาณของเซลล์ ) และนำโปรตีนสกัด ; ประมาณการวิ่งบนนำโดยใช้วิธีนี้
( powerwavex ; biotek , MD )ประมาณการโปรตีนเหล่านี้ได้ถูกใช้เป็นมาตรฐานสำหรับปริมาณ 50 กรัมของโปรตีนแต่ละμ ) ลง 10%
เจลอะคริลาไมด์สำหรับการแยกโดย SDS electrophoresis พบโปรตีนจากตัวอย่าง

ถูกส่งไปีนไดฟลูออไรด์ ( PVDF ) เยื่อ ระหว่าง incubations membranes ถูกล้างอย่างกว้างขวางกับ 0.1m
ฟอสเฟตในน้ำเกลือ ( PBS , pH = 7.35 )ทั้งหมดล้าง และมีการปฏิบัติอยู่ใน incubations
อุณหภูมิห้อง เว้นแต่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น เยื่อแผ่นแบบบ่มในบล็อกโซลูชั่น
ประกอบด้วย 5 % ปลอดไขมันนมแห้งใน PBS 0.1% Tween เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากการปิดกั้น
เมมเบรนบ่มข้ามคืน ( 1 ชั่วโมง ) ที่ 4 ° C ในการปิดกั้นและโซลูชั่น
darpp-32 phosphothr34 กระต่าย , ใช้แอนติบอดี ( 1:1k มิลลิ , CA ) ต่อไปนี้
วันเยื่อถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงในหัวผักกาด เปอร์ออกซิเดส ( HRP ) - ป้องกันกระต่ายระดับแอนติบอดี IgG conjugated
แพะ ( 1:2k เพียร์ซ , เทคโนโลยีชีวภาพ , อิลลินอยส์ ) เยื่อแผ่น
แล้วประเมินสำหรับ HRP และนโยบายแรงงาน ( ECL ; ที่ชีววิทยาศาสตร์ , NJ )
โดยการเปิดเผย biomax เยื่อฟิล์มภาพยนตร์ เยื่อแผ่นแล้วตัดออก
ป้ายกับเมาส์ actin โมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อต้าน - - ( 1:1k ß ,ซิกม่า Aldrich โม ) เป็น
โหลดการควบคุม การพัฒนาฟิล์มสแกนลงในคอมพิวเตอร์และวงดนตรีความหนาแน่น
quantified ใช้โปรแกรม NIH ImageJ ( 1.33u รุ่น NIH )