2.4. Simplex and multiplex PCRSimpl

2.4. Simplex and multiplex PCR
Simplex PCR amplification was performed in a final volume of
25 lL containing 16 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris–HCl (pH 8.8),
0.01% Tween-20, 2.0 mM MgCl2, 200 lM of dNTP mix, 0.3 lM of
primers, 1 U Taq DNA polymerase (Invitrogen, USA), and 100 ng
of cDNA template. Amplification was performed using the following
cycling conditions: initial heat denaturation at 95 C for
5 min, followed by 35 cycles at 95 C for 30 s, 62 C for 30 s, and
72 C for 30 s, with a final extension at 72 C for 5 min.
To detect each of the mixed species in a single reaction,
one-step multiplex PCR was developed using the primer sets
P-f/P-r, GT3-f/GT3-r, OS2-f/OS2-r, B6-f/B6-r and CK2-f/CK2-r
(Supplemental Table 2). In the reaction, the primer concentration
ranged from 0.1 to 0.2 lM, and 200 ng of cDNA template was used.
Thermal cycling was programmed following the same procedure as
used for simplex PCR. The amplification products were resolved
through electrophoresis on 2% agarose gels (Invitrogen, USA) in
TBE Buffer for 30 min at 110 V and subsequently stained with
ethidium bromide (0.5 lg/mL).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4. simplex และ multiplex PCRทำ PCR simplex ขยายในปริมาตรสุดท้ายของจะมี 16 มม. (NH4) 2SO4, 67 mM ตรี – HCl (pH 8.8), 250.01% Tween-20, 2.0 มม. MgCl2, 200 lM ของ dNTP ผสม 0.3 lM ของไพรเมอร์ 1 U Taq DNA พอลิเมอเรส (Invitrogen สหรัฐอเมริกา), และ 100 ngของ cDNA ต้นแบบ ขยายได้ดำเนินการใช้ต่อไปนี้สภาพขี่จักรยาน: denaturation ความร้อนเริ่มต้นที่ 95 C สำหรับ5 นาที ตาม ด้วยรอบ 35 ที่ 95 C สำหรับ 30 s, C 62 สำหรับ 30 s และซี 72 สำหรับ 30 s ขยายที่ 72 C สำหรับ 5 นาทีสุดท้ายการตรวจแต่ละชนิดผสมในปฏิกิริยาเดียวขั้นตอนเดียว multiplex PCR ได้รับการพัฒนาโดยใช้ชุดรองพื้นP-f/P-r, GT3-f/GT3-r, OS2-f/OS2-r, B6-f/B6-r และ CK2-f/CK2-r(เพิ่มเติมตารางที่ 2) ในปฏิกิริยา ความเข้มข้นของสีรองพื้นอยู่ในช่วงจาก 0.1 ถึง 0.2 lM และ 200 ng ของ cDNA ต้นใช้ขี่จักรยานความร้อนโปรแกรมวิธีเดียวเป็นใช้สำหรับ simplex PCR ขยายผลิตภัณฑ์ได้รับการแก้ไขผ่าน electrophoresis บน 2% agarose (Invitrogen สหรัฐอเมริกา) ในTBE บัฟเฟอร์สำหรับ 30 นาทีที่ 110 V และสีในเวลาต่อมาด้วยโบรไมด์ ethidium (0.5 lg/มล.)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 Simplex และ PCR multiplex
Simplex ขยาย PCR ได้ดำเนินการในเล่มสุดท้ายของ
25 จะมี 16 มิลลิ (NH4) 2SO4 67 มิลลิ Tris-HCl (pH 8.8)
0.01% Tween-20 2.0 มิลลิ MgCl2 200 LM ผสม dNTP, 0.3 LM
ของไพรเมอร์1 U Taq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (Invitrogen, USA) และ 100
นาโนกรัมแม่แบบยีน ขยายได้ดำเนินการใช้ต่อไปนี้เงื่อนไขการขี่จักรยาน: denaturation ความร้อนเริ่มต้นที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 35 รอบที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที 62 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและ? 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีด้วยสุดท้ายหรือไม่? ส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที. เพื่อตรวจสอบแต่ละสายพันธุ์ผสมในปฏิกิริยาเดียวหลายขั้นตอนเดียว PCR ได้รับการพัฒนาโดยใช้ไพรเมอร์ชุด Pf / การประชาสัมพันธ์, GT3-f / GT3-R, OS2-f / OS2- R, B6-f / B6-R และ CK2-f / CK2-R (เพิ่มเติมตารางที่ 2) ในการตอบสนองความเข้มข้นไพรเมอร์อยู่ในช่วง 0.1-0.2 LM และ 200 นาโนกรัมแม่แบบยีนถูกนำมาใช้. ขี่จักรยานความร้อนเป็นโปรแกรมทำตามขั้นตอนเช่นเดียวกับที่ใช้สำหรับการ PCR เริม การขยายผลิตภัณฑ์ได้รับการแก้ไขผ่านทางอิเลค 2% agarose เจล (Invitrogen สหรัฐอเมริกา) ใน TBE บัฟเฟอร์ 30 นาทีที่ 110 V สีและต่อมากับโบรไมด์ethidium (0.5 LG / มิลลิลิตร)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . เริมเริม multiplex PCR PCR และ
( แสดงในหมวดสุดท้ายของ
25 จะประกอบด้วย 16 มม. ( NH4 ) 2so4 67 มม. นอกจากนี้ – HCl ( พีเอช 8.8 )
0.01 % tween-20 ไอโซโทป , 2.0 มม. 200 LM ของ dntp ผสม 0.3 ของไพรเมอร์ LM
1 U แท็ค DNA polymerase ( Invitrogen สหรัฐอเมริกา ) และ 100 ng
แม่แบบดีเอ็นเอ . ขยายการใช้ต่อไปนี้
จักรยานเงื่อนไขเริ่มต้นความร้อน ( 95  C
5 นาที ตามด้วย 35 รอบ 95  C 30 , 62  C 30 S ,
72  เป็นเวลา 30 วินาที ด้วยส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที 
ตรวจสอบแต่ละชนิดที่ผสมอยู่ในปฏิกิริยาขั้นตอนเดียวเดียว
multiplex PCR ที่พัฒนาโดยใช้ไพรเมอร์ ชุด
p-f / P-R gt3-f gt3-r , / , / os2-r os2-f , และ b6-f / b6-r ck2-f / ck2-r
( โต๊ะเสริม 2 ในการเกิดปฏิกิริยา ความเข้มข้นของรองพื้นระหว่าง 0.1 ถึง 0.2 โดย
,และ 200 นาโนแม่แบบดีเอ็นเอ การใช้ความร้อน จักรยานถูกโปรแกรมต่อไปนี้

ใช้กระบวนการเดียวกับเริม PCR ผลิตภัณฑ์ขยายถูกแก้ไข
ผ่านอิเลค 2 % เจลโรส ( Invitrogen , USA )
ทีบีบัฟเฟอร์ 30 นาทีที่ 110 V และต่อมาเปื้อน
ทิเดียมโบรไมด์ ( 0.5 LG / ml )