contain 20 ng μl–1 of nucleic acid.

contain 20 ng μl–1 of nucleic acid. The nucleic acid was
10-fold serially diluted down to 2 fg μl–1 and 1 μl of
each dilution used as template in the m-PCR assay
described. To determine the sensitivity in mixed culture,
initial pure cultures of each bacterium (F.
columnare, E. ictaluri and A. hydrophila) at log-phase
growth were 10-fold diluted 4 times and then 2-fold
serially diluted in PBS pH 7.2. Corresponding dilutions
of each bacterial species were mixed. Total nucleic
acid was extracted from 200 μl of each mixture and 1μl
subjected to m-PCR as described above.
For additional analytical sensitivity assessment, tissues
(blood, gills and kidney) from naïve fish were
spiked with serial dilutions of log-phase cultures of the
3 bacteria Flavobacterium columnare, Edwardsiella
ictaluri and Aeromonas hydrophila. The concentration
of log-phase cultures was first adjusted to optical densities
(OD) at 540 nm of 0.7 for F. columnare and 1.0 for
E. ictaluri and A. hydrophila. These dilutions were
determined to contain 1.6 × 109 CFU ml–1 F. columnare,
3.5 × 109 CFU ml–1 E. ictaluri , and 2.5 × 109 CFU ml–1
A. hydrophila. One hundred microliters of each bacterial
dilution was mixed with 100 μl of tissue (blood) or
tissue homogenate (gills or kidney) and total nucleic
acid prepared from the mixture using guanidinium
thiocyanate acid as previously described (Casas et al.
1995); 1 μl of the 10 μl of isolated nucleic acid from
each sample was used in the m-PCR reaction mixture.
Diagnostic sensitivity of each primer set for its target
species was assessed by PCR amplification of nucleic
acid extracted from pure cultures of 10 isolates of each
species (Flavobacterium columnare, Edwardsiella
ictaluri and Aeromonas hydrophila). Template nucleic
acids from 1 isolate of each species of bacteria were
also amplified together in each possible combination.Additionally, nucleic acid extracted from 11 Gramnegative
bacteria listed in Table 1, which are either
taxonomically related or ubiquitous in the aquatic
environment and 2 Gram-positive bacteria (Streptococcus
iniae and S. agalactiae) previously isolated
from diseased fish (bass or mullet) were tested in the
m-PCR to confirm diagnostic specificity.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ประกอบด้วย 20 ng μl – 1 ของกรดนิวคลีอิก กรดนิวคลีอิกได้10-fold serially แตกออกลง fg 2 μl-1 และ μl 1 ของเจือจางแต่ละใช้เป็นแบบทดสอบ m PCRอธิบาย การกำหนดความไวในการผสมวัฒนธรรมเริ่มต้นวัฒนธรรมบริสุทธิ์ของแบคทีเรียแต่ละ (เอฟcolumnare, E. ictaluri และ A. hydrophila) ในขั้นตอนการบันทึกเจริญเติบโตได้ 10-fold ผสม 4 ครั้ง และ 2-fold แล้วserially diluted PBS pH 7.2 Dilutions สอดคล้องกันแต่ละพันธุ์แบคทีเรียที่ผสม รวม nucleicกรดที่สกัดจาก μl 200 ของแต่ละส่วนผสมและ 1μlต้อง m-PCR ที่อธิบายข้างต้นสำหรับการประเมินความไวการวิเคราะห์เพิ่มเติม เนื้อเยื่อ(เลือด gills และไต) จากขำน่า ปลาได้spiked กับ dilutions ลำดับของขั้นตอนการบันทึกวัฒนธรรมของการ3 แบคทีเรีย Flavobacterium columnare, Edwardsiellaictaluri และ Aeromonas hydrophila ความเข้มข้นขั้นตอนการบันทึกวัฒนธรรมถูกก่อนปรับความหนาแน่นออปติคอล(OD) ที่ 540 nm สำหรับ F. columnare 0.7 และ 1.0 สำหรับE. ictaluri และ A. hydrophila Dilutions เหล่านี้ได้กำหนดให้ประกอบด้วย 1.6 × 109 CFU ml-1 F. columnare3.5 × 109 CFU ml-1 E. ictaluri และ 2.5 × 109 CFU ml-1A. hydrophila Microliters หนึ่งร้อยของแบคทีเรียแต่ละเจือจางที่ผสมกับ μl 100 ของเนื้อเยื่อ (เลือด) หรือเนื้อเยื่อ homogenate (gills หรือไต) และรวม nucleicกรดที่เตรียมจากส่วนผสมที่ใช้ guanidiniumกรด thiocyanate (Casas et al ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้เป็น1995); Μl 1 ของ μl 10 ของกรดนิวคลีอิกที่แยกจากแต่ละตัวอย่างที่ใช้ในส่วนผสมของปฏิกิริยา m PCRความไวในการวินิจฉัยแต่ละพื้นที่ตั้งเป้าหมายของการพันธุ์ถูกประเมิน โดยขยาย PCR ของ nucleicกรดที่สกัดจากวัฒนธรรมบริสุทธิ์ของ 10 แยกของแต่ละสปีชีส์ (Flavobacterium columnare, Edwardsiellaictaluri ก Aeromonas hydrophila) แม่ nucleicกรดจากแยก 1 ของแบคทีเรียแต่ละชนิดได้นอกจากนี้ยัง ขยายกันในแต่ละชุดได้ นอกจากนี้ กรดนิวคลีอิกสกัดจาก 11 Gramnegativeแบคทีเรียที่แสดงในตารางที่ 1 ที่อยู่taxonomically ที่เกี่ยวข้อง หรือในน้ำ2 แบคทีเรีย (อุณหภูมิและสภาพแวดล้อมiniae และ S. agalactiae) ก่อนหน้านี้แยกต่างหากปลาเส้น (เบสหรือปลา) ถูกทดสอบในการm-PCR เพื่อยืนยันการวินิจฉัย specificity

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

มี 20 นาโนกรัมไมโครลิตร-1 ของกรดนิวคลี กรดนิวคลีอิกได้
10 เท่าปรับลดลงเป็นลำดับ 2 ไมโครลิตร FG-1 และ 1
ไมโครลิตรของแต่ละเจือจางใช้เป็นแม่แบบในการทดสอบของm-PCR
อธิบาย การตรวจสอบความไวในวัฒนธรรมผสมเชื้อบริสุทธิ์เริ่มต้นของแต่ละแบคทีเรีย (เอฟ columnare อี ictaluri และ A. hydrophila) ที่เข้าสู่ระบบขั้นตอนการเจริญเติบโตเป็น10 เท่าปรับลดครั้งที่ 4 แล้ว 2 เท่าปรับลดลำดับในค่าpH 7.2 พีบีเอส . เจือจางที่สอดคล้องกันของสายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรียแต่ละถูกผสม นิวคลีอิกรวมกรดถูกสกัดจาก 200 ไมโครลิตรของแต่ละส่วนผสมและ1μlยัดเยียดให้ม-PCR ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น. สำหรับการประเมินความไวของการวิเคราะห์เพิ่มเติมเนื้อเยื่อ(เลือดเหงือกและไต) จากปลาไร้เดียงสาถูกแทงด้วยเจือจางอนุกรมของวัฒนธรรมเข้าสู่ระบบขั้นตอนของการ3 แบคทีเรีย Flavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri เชื้อ Aeromonas hydrophila และ ความเข้มข้นของวัฒนธรรมเข้าสู่ระบบขั้นตอนการปรับครั้งแรกที่จะมีความหนาแน่นแสง(OD) ที่ 540 นาโนเมตร 0.7 สำหรับเอฟ columnare และ 1.0 สำหรับอี ictaluri และ A. hydrophila เจือจางเหล่านี้ถูกกำหนดให้มี 1.6 × 109 CFU ml-1 เอฟ columnare, 3.5 × 109 CFU ml-1 อี ictaluri และ 2.5 × 109 CFU ml-1 เอ hydrophila หนึ่งร้อย microliters ของแต่ละแบคทีเรียเจือจางผสมกับ100 ไมโครลิตรของเนื้อเยื่อ (เลือด) หรือhomogenate เนื้อเยื่อ (เหงือกหรือไต) และนิวคลีอิกรวมกรดที่ทำจากส่วนผสมที่ใช้Guanidinium กรด thiocyanate ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Casas et al. 1995); 1 ไมโครลิตร 10 ไมโครลิตรของกรดนิวคลีอิกที่แยกได้จากแต่ละตัวอย่างที่ใช้ในม-PCR ผสมปฏิกิริยา. ไววินิจฉัยของแต่ละชุดไพรเมอร์สำหรับเป้าหมายของสายพันธุ์ที่ได้รับการประเมินโดยการขยาย PCR ของนิวคลีอิกกรดที่สกัดจากเชื้อบริสุทธิ์10 สายพันธุ์ของแต่ละสายพันธุ์ (Flavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri และ Aeromonas hydrophila) แม่แบบนิวคลีอิกกรดจากแยก 1 ของแต่ละสายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรียที่ได้รับยังขยายร่วมกันในแต่ละcombination.Additionally กรดนิวคลีอิกสกัดจาก 11 Gramnegative แบคทีเรียที่ระบุไว้ในตารางที่ 1 ซึ่งมีทั้งtaxonomically ที่เกี่ยวข้องหรือที่แพร่หลายในน้ำและสิ่งแวดล้อม2 แกรมบวก แบคทีเรีย (Streptococcus iniae และ S. agalactiae) ก่อนหน้านี้แยกได้จากปลาที่เป็นโรค(เบสหรือกระบอก) ได้รับการทดสอบในม-PCR เพื่อยืนยันความจำเพาะในการวินิจฉัย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ประกอบด้วย 20 นาโนμแอล– 1 ของกรดนิวคลีอิก กรดนิวคลีอิกเป็น
10 เท่าเป็นเจือจางลง 2 FG μแอล– 1 และ 1 μ l
แต่ละเจือจางที่ใช้เป็นแม่แบบใน m-pcr assay
อธิบาย เพื่อศึกษาความไวในการเพาะเชื้อบริสุทธิ์เริ่มต้นผสม
แต่ละ bacterium ( F .
columnare เช่น A . hydrophila และ ictaluri ) ในการบันทึกเป็น 10 เท่า (
4 ครั้งแล้วถึง
เจือจางเป็นเจือจางใน PBS pH 7.2 . ที่สอดคล้องกันของแต่ละชนิดมีวิธีการ
แบคทีเรียผสม
รวมกรดนิวคลีอิกกรดสกัดจาก 200 μ L ของแต่ละส่วนผสม 1 μ L
ภายใต้ m-pcr ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น เพื่อประเมินความไวเชิงวิเคราะห์เพิ่มเติม

( เลือด เนื้อเยื่อเหงือกและไต ) นาไตได้ปลา
C อนุกรมวิธีการ log phase
วัฒนธรรมของ3 columnare แบคทีเรียฟลาโวแบคทีเรียม , และ edwardsiella
ictaluri hydrophila . ความเข้มข้นของ log phase วัฒนธรรมเป็นครั้งแรก

ปรับแสงความหนาแน่น ( OD ) 540 นาโนเมตร 0.7 สำหรับ F . columnare และ 1.0 สำหรับ
E ictaluri และ A . hydrophila . วิธีการเหล่านี้
มุ่งมั่นที่จะมี 1.6 × 109 CFU / ml ) 1 F . columnare
3.5 × 109 CFU / ml , - 1 E ictaluri 2.5 × 109 CFU / ml และ– 1
A . hydrophila .หนึ่งร้อยตัวเลขของแต่ละแบคทีเรีย
เจือจางผสมกับ 100 μชั้นของเนื้อเยื่อ ( เลือด ) หรือ ( เหงือกหรือเนื้อเยื่อไตอน

) และปริมาณกรดนิวคลีอิกกรดที่เตรียมจากส่วนผสมที่ใช้ guanidinium
ไทโอไซยาเนตกรดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( Casas et al .
1995 ) ; 1 μลิตร 10 ลิตรμแยกได้ กรดนิวคลีอิกจาก
แต่ละตัวอย่างถูกใช้ใน m-pcr
ปฏิกิริยาผสมความไวของการวินิจฉัยของแต่ละชุดรองพื้นชนิดเป้าหมายของการประเมินโดยวิธี PCR

เพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิกกรดสกัดจากเชื้อบริสุทธิ์ของเชื้อแต่ละชนิด ( 10
columnare ฟลาโวแบคทีเรียม , และ edwardsiella
ictaluri hydrophila ) แม่แบบคลี
กรดจาก 1 แยกแต่ละชนิดของแบคทีเรียถูก
ยังขยายด้วยกันในแต่ละชุดได้ นอกจากนี้กรดนิวคลีอิก สารสกัดจากแบคทีเรียแกรมลบ 11
แสดงในตารางที่ 1 ซึ่งมีทั้ง
taxonomically เกี่ยวข้องหรือทั่วไปในสิ่งแวดล้อมทางน้ำ
2 แบคทีเรียแกรมบวก ( Streptococcus
iniae และ S . แลคเตีย ) ที่แยกได้จากปลาที่ป่วยก่อนหน้านี้
( เบสหรือปลากระบอก ) ทำการทดสอบเพื่อยืนยันการวินิจฉัย m-pcr

specificity