As shown in รูป 28 (n=2), ไคเมริก ฮ

As shown in รูป 28 (n=2), ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone 20E5 and all six versions of ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone 20E5 dose-dependently and specifically bound to รีคอมบิแนนต์
20 ฮิวเมน CD134. ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5
and ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 versions
20E5 VL1H3, 20E5_VL2H1, 20E5_VL2VH2 and 20E5_VL2VH3 showed identical
titration curves, which indicated that their CD134 antigen binding affinity was
identical (half-maximum binding EC5O 100 ng/mL), whereas ฮิวเมไนซ์ IgG4k 25 แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 version 20E5_VL1H1 and 20E5 VL1H2
seemed to show a slightly lower binding affinity (EC5O 150 ng/mL). Due to usage
of different immunoglobulin chain-specific secondary antibodies (i.e., mouse
antibodies were detected with แอนติ-Fey chain specific antibodies, while ไคเมริก
ฮิวเมน and ฮิวเมไนซ์ antibodies were detected with แอนติ-x chain specific
30 antibodies), comparison between titration curve (data not shown) from parental
mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 and titration curves from ไคเมริก ฮิวเมน and ฮิวเมไนซ์ IgG4ic แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 versions could not be made.
As shown in รูป 29 (n=2), ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k. แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone 12H3 and all six versions of ฮิวเมไนซ์ IgG4k. แอนติ-ฮิวเมน CD134 5 antibody clone 12H3 dose-dependently and specifically bound to รีคอมบิแนนต์
ฮิวเมน CD134. ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3
and ฮิวเมไนซ์ IgG4k. แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 — all six versions
12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 and
12H3_VL2VH3 — showed non-identical titration curves, which indicated that all six
10 ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 versions showed a
slightly higher CD134 antigen binding affinity (EC50 50 ng/mL) than ไคเมริก
ฮิวเมน IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 (EC5o 100 ng/mL). Due to
usage of different immunoglobulin chain-specific secondary antibodies (i.e., mouse
antibodies were detected with แอนติ-Fey chain specific antibodies, while ไคเมริก 15 ฮิวเมน and ฮิวเมไนซ์ antibodies were detected with แอนติ-x chain specific
antibodies), comparison between titration curve (data not shown) from parental
mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 and titration curves from ไคเมริก
ฮิวเมน and ฮิวเมไนซ์ IgG4-K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 versions
could not be made.
20
(b). Competition of ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 with biotinylated parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 for binding with รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein (ELISA).
25 Prior to performing the competition ELISA measurements, the EC5o of
biotinylated (using N-hydroxysuccinimido-biotin from Pierce) parental mouse แอนติ-
ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 was determined (see below for
method), and was identified to be about 20 ng/mL (see รูป 30, n=3).
Displacement of the biotinylated parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล 30 antibody clone 12H3 at its the identified EC50 concentration by unlabeled parental
mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3, ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k แอนติ-
ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3, and six versions of ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 was subsequently investigated.
Ninety six-wells flat-bottom ELISA plates (Corning) were coated with 50
ng/well รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fey (IgG1) fusion protein (R&D
Systems) in PBS o/n at 4°C. After extensive washing in PBS/0.05% Tween 20,
5 plates were blocked in PBS/0.05% Tween 20/1% BSA fraction V (Roche) for 1 hour
at RT. Subsequently, plates were incubated with 0, 0.001 - 60.0 (3-fold dilution
steps in block buffer) gg/mL unlabeled parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone 12H3, ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone
12H3, หรือ six versions of ฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 10 in combination with 20 ng/mL (EC50) biotinylated parental mouse แอนติ-ฮิวเมน
CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 for 1 hour at RT. After extensive washing
in PBS/0.05% Tween 20, การยึดเกาะของ biotinylated parental mouse แอนติ-ฮิวเมน
CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 was determined with 1:5000 diluted
horseradish peroxidase-conjugated สเตร็ปทาวิดิน (Jackson ImmunoResearch) for 1 15 hour at RT, followed by a ready-to-use สารละลาย of TMB substrate (Invitrogen) for
colorimetric detection. After adding 1 M 112SO4, optical densities were measured at
a wavelength of 450 nm (reference wavelength of 655 nm) using a microplate
reader (BioRad).
As shown in รูป 31 (n=2), unlabeled parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 20 antibody clone 12H3 and unlabeled ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone 12H3 demonstrated identical displacement of biotinylated parental
mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3, which indicated that
parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 and ไคเมริก ฮิวเมน
IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 exhibited an identical CD134
25 antigen binding affinity (half-maximum displacement หรือ inhibition (IC50) of
biotinylated parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3
at 750 ng/mL). All six unlabeled ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody
clone 12H3 versions — 12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1,
12H3_VL2VH2 and 12H3_VL2VH3 — demonstrated similar displacement of
30 biotinylated parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3,
which indicated that all six unlabeled ฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone 12H3 versions exhibited a similar CD134 antigen binding affinity


(ICH :-..-: 250-300 ng/mL).

These results demonstrated that all six ฮิวเมไนซ์ IgG4K. แอนติ-ฮิวเมน
CD134 antibody clone 12H3 versions showed a higher CD134 antigen binding
affinity than parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 and ไคเมริก 5 ฮิวเมน IgG4-tc แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3.

(c). การยึดเกาะของ ฮิวเมไนซ์ IgG4k. แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clones 20E5 and 12H3 with full-length ฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์ expressed on 293-F cell line (FACS)
10 In order to analyze the การยึดเกาะของ ฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibody clones 20E5 and 12H3 in detail, the binding capacity of
ฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clones 20E5 and 12H3
with surface ฮิวเมน full-length CD134 on (stable transfectants) 293-F cell lines
was determined by โฟลไซโตเมทรี, and, furthermore, compared with the binding 15 characteristics of their corresponding parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody
counterparts.
Full-length ฮิวเมน CD134 (SEQ ID NO. 1) was re-cloned in a pcDNA3.1-
derived expression plasmid (see Example 11 (d) below). This full-length ฮิวเมน
CD134 plasmid was transfected in FreeStyleTM 293-F cells (Life Technologies)
20 using the FreeStyleTM 293 Expression System (Life Technologies). Stable ฮิวเมน
full-length CD134-transfected cells (clone no. 5 with high surface CD134 expression
level and clone no. 23 with intermediate surface CD134 expression level; see รูป
32) were selected using 125 pg/mL G418 (Gibco), and were harvested and put at 1-
2x106 cells/mL in ice-chilled PBS/BSA/NaN3 supplemented with 50 lig/mL purified 25 ฮิวเมน IgG (Sigma; blocking Fcy รีเซปเตอร์). Cells were incubated with 0, 0.005-50
gg/mL (10-fold dilution steps in PBS/BSA/NaN3; all clone 20E5 versions) หรือ 0.002-
20 1.tg/mL (10-fold dilution steps in PBS/BSA/NaN3; all clone 12H3 versions)
parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 หรือ 12H3, ไคเมริก ฮิวเมน
IgG4-K. แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 หรือ 12H3, and six versions of
30 ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 หรือ 12H3 for 30 minutes
at 4°C. In parallel, mouse IgG1K ไอโซไทป์คอนโทรล (BD Biosciences; 50.0 หรือ 20.0
gg/mL) and ไคเมริก ฮิวเมน IgGhlx ไอโซไทป์คอนโทรล (clone ch5D12 from
PanGenetics; 50.0 หรือ 20.0 gg/mL) were used as เนกาทีฟ controls. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were subsequently incubated with 1:200 diluted PE-conjugated goat แอนติ-mouse IgG (Fey specific) antibodies (Jackson
ImmunoResearch) หรือ with 1:200 diluted PE-conjugated goat แอนติ-ฮิวเมน IgG (Fcy 5 specific) antibodies (Jackson ImmunoResearch) for 30 minutes at 4°C.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ดังแสดงในรูปที่ 28 (n = 2), ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติฮิวเมน CD134แอนติบอดีโคลน 20E5 และฮิวเมไนซ์ทั้งหมด 6 รุ่น CD134 แอนติ-ฮิวเมน IgG4k แอนติบอดีโคลน 20E5 ยา dependently และโดยเฉพาะกับรีคอมบิแนนต์ 20 ฮิวเมน CD134 ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 รุ่นและ 20E5 VL1H3, 20E5_VL2H1, 20E5_VL2VH2 และ 20E5_VL2VH3 แสดงให้เห็นเหมือนกัน เส้นโค้งการไทเทรต ซึ่งระบุการ CD134 ตรวจหาผูกความสัมพันธ์ได้ เหมือนกัน (เกินครึ่งรวม EC5O 100 ng/mL), ใน ขณะที่แอนติบอดีฮิวเมไนซ์ IgG4k 25 แอนติฮิวเมน CD134 โคลน 20E5 รุ่น 20E5_VL1H1 และ 20E5 VL1H2 ดูเหมือนจะ แสดงความสัมพันธ์ผูกต่ำกว่าเล็กน้อย (EC5O 150 ng/mL) เนื่องจากการใช้ ของ immunoglobulin ที่แตกต่างกันเฉพาะโซ่รองแอนตี้ (เช่น เมาส์ ตรวจพบแอนตี้ ด้วยแอนติ Fey โซ่เฉพาะแอนตี้ ในขณะที่ไคเมริก แอนตี้ฮิวเมนและฮิวเมไนซ์พบกับห่วงโซ่แอนติ x เฉพาะ แอนตี้ 30), การเปรียบเทียบระหว่างการไทเทรตทางโค้ง (ข้อมูลไม่แสดง) จากผู้ปกครอง แอนติบอดี CD134 แอนติ-ฮิวเมนเมาส์โคลนเส้นโค้งการไทเทรตและ 20E5 จากไคเมริกฮิวเมนและฮิวเมไนซ์ IgG4ic แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 ไม่ทำรุ่นดังแสดงในรูปที่ 29 (n = 2), ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134รุ่น H 12 6 3 และทั้งหมดโคลนแอนติบอดีฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติบอดีแอนติ-ฮิวเมน CD134 5 โคลน 12H 3 ยา dependently และโดยเฉพาะกับรีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134 ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 และฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติบอดีแอนติ-ฮิวเมน CD134 โคลน 12H 3 — 6 รุ่นทั้งหมด 12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 และ 12H3_VL2VH3 — แสดงเส้นโค้งการไทเทรตไม่เหมือนกัน ซึ่งบ่งชี้ที่ 6 ทั้งหมด10 ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 รุ่นแสดงให้เห็นว่าการสูงขึ้นเล็กน้อย CD134 ตรวจหาผูกความสัมพันธ์ (EC50 50 ng/mL) มากกว่าไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 (EC5o 100 ng/mL) เนื่องการใช้งานของ immunoglobulin ที่แตกต่างกันเฉพาะโซ่รองแอนตี้ (เช่น เมาส์ แอนตี้พบกับห่วงโซ่แอนติ Fey เฉพาะแอนตี้ ในขณะที่ฮิวเมนไคเมริก 15 และแอนตี้ฮิวเมไนซ์พบกับห่วงโซ่แอนติ x เฉพาะ แอนตี้), การเปรียบเทียบระหว่างการไทเทรตทางโค้ง (ข้อมูลไม่แสดง) จากผู้ปกครอง แอนติบอดี CD134 แอนติ-ฮิวเมนเมาส์โคลน 12H 3 และเส้นโค้งของการไทเทรตจากไคเมริก ฮิวเมนและฮิวเมไนซ์ IgG4 K แอนติ-ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H รุ่น 3 ไม่สามารถทำ20(ข) การแข่งขันฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 biotinylated เมาส์ปกครองแอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 สำหรับผูกกับรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy อาหารโปรตีน (ELISA)25 ก่อนที่จะดำเนินการแข่งขัน ELISA วัด EC5o ของbiotinylated (การใช้ N-hydroxysuccinimido-ไบโอตินจากเพียร์ซ) เมาส์ปกครองแอนติ- ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนกำหนด 12H 3 (ดูด้านล่างสำหรับ วิธี), และระบุให้ ประมาณ 20 ng/mL (ดูรูปที่ 30, n = 3) แทนที่ biotinylated เมาส์ปกครองแอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล 30 แอนติบอดีโคลน 12H 3 ที่มันระบุ EC50 ความเข้มข้น โดยไม่โดยผู้ปกครอง แอนติบอดี CD134 แอนติ-ฮิวเมนเมาส์โคลน 12H 3 ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 และ 6 รุ่นฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 ถูกสอบสวนในเวลาต่อมาไนน์ตี้ซิกซ์บ่อล่างแบน ELISA แผ่น (คอร์นทำ) ถูกเคลือบ ด้วย 50 ng/ดี รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fey (IgG1) อาหารโปรตีน (R & D ระบบ) ใน PBS o/n ที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS/0.05% Tween 20 แผ่นที่ 5 บล็อกในส่วนของบีเอสเอ PBS/0.05% Tween 20/1% V (Roche) 1 ชั่วโมง ที่ RT. ในเวลาต่อมา แผ่นก็ incubated กับ 0, 0.001 - 60.0 (3-fold เจือจาง ขั้นตอนในบัฟเฟอร์บล็อก) gg/mL เพียงผู้ปกครองเมาส์ CD134 แอนติ-ฮิวเมน 12H 3 ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลนโคลนแอนติบอดี 12H 3 รุ่นหรือหกฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลนราคา H 12 3 10 กับ 20 ng/mL (EC50) biotinylated เมาส์ปกครองแอนติ-ฮิวเมนแอนติบอดีโมโนโคลนอล CD134 โคลน 12H 3 1 ชั่วโมงที่ RT. หลังจากซักผ้าอย่างละเอียด ใน PBS/0.05% Tween 20 การยึดเกาะของ biotinylated เมาส์ปกครองแอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนกำหนด 12H 3 กับ 1:5000 ที่ทำให้ horseradish peroxidase กลวงสเตร็ปทาวิดิน (Jackson ImmunoResearch) 1 15 ชั่วโมงที่ RT ตาม ด้วยสารละลายพร้อมใช้ของทหารไทยพื้นผิว (Invitrogen) สำหรับ ตรวจสอบเทียบเคียง หลังจากเพิ่ม 1 M 112SO4 ความหนาแน่นออปติคัลได้วัดที่ ความยาวคลื่นของ 450 nm (ความยาวคลื่นอ้างอิงของ 655 นาโนเมตร) ใช้เป็น microplate อ่าน (BioRad)ดังแสดงในรูปที่ 31 (n = 2), เพียงเมาส์ปกครองแอนติ-ฮิวเมน CD134 20 แอนติบอดีโคลน 12H 3 และไม่ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 แสดงปริมาณกระบอกสูบเหมือนของ biotinylated โดยผู้ปกครอง เมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน H 12 3 ซึ่งบ่งชี้ที่ ผู้ปกครองเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 และไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน CD134 เหมือนจัดแสดง 12H 3 ตรวจหา 25 ผูกความสัมพันธ์ (ปริมาณกระบอกสูบสูงสุดครึ่งหรือยับยั้ง (IC50) biotinylated เมาส์ปกครองแอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 ที่ 750 ng/mL) ทั้งหมดหกไม่ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดี โคลน 12H 3 รุ่นคือ 12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1 12H3_VL2VH2 และ 12H3_VL2VH3 ซึ่งแสดงให้เห็นว่าคล้ายการเคลื่อนย้ายของ 30 biotinylated เมาส์ปกครองแอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 ซึ่งระบุว่า ทั้งหมดหกไม่ฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H รุ่นที่ 3 จัดแสดงคล้าย CD134 ตรวจหาผูกความสัมพันธ์(ICH: -... -: 250-300 ng/mL)ผลเหล่านี้แสดงที่ฮิวเมไนซ์ทั้งหมด 6 IgG4K แอนติ-ฮิวเมนCD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 รุ่นแสดงให้เห็นว่าการผูกข้อมูลตรวจหา CD134 สูงความสัมพันธ์มากกว่าเมาส์ปกครองแอนติ-ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 และไคเมริก 5 ฮิวเมน IgG4 tc แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3(ค) . การยึดเกาะของฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี clones 20E5 และ 12H 3 กับฮิวเมนปราศจาก CD134 คอนสตรัคต์แสดงบรรทัด 293 F เซลล์ (FACS)10 การวิเคราะห์การยึดเกาะของฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติฮิวเมน CD134โมโนโคลนอลแอนติบอดี clones 20E5 และ 12H 3 รายละเอียด กำลังการผลิตรวมของฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี clones 20E5 และ 12H 3 มีฮิวเมนผิวปราศจาก CD134 บรรทัด 293 F เซลล์ (transfectants มั่นคง) ตามโฟลไซโตเมทรี และ นอกจากนี้ เมื่อเทียบกับลักษณะ 15 ผูกของแอนติบอดี CD134 แอนติ-ฮิวเมนเมาส์โดยผู้ปกครองของพวกเขาที่สอดคล้องกัน คู่นี้ฮิวเมนปราศจาก CD134 (ลำดับรหัสหมายเลข 1) ถูกโคลนอีกครั้งใน pcDNA3.1 เป็น - มา plasmid นิพจน์ (ดูตัวอย่าง 11 (d) ด้านล่าง) ฮิวเมนนี้ปราศจาก CD134 plasmid ถูก transfected ในเซลล์ 293-F FreeStyleTM (ชีวิตเทคโนโลยี) ใช้ระบบนิพจน์ 293 FreeStyleTM (ชีวิตเทคโนโลยี) 20 ฮิวเมนมั่นคง เซลล์ที่ปราศจาก CD134 transfected (โคลนหมายเลข 5 กับนิพจน์ CD134 ผิวสูง ระดับและโคลนหมายเลข 23 ด้วยผิว CD134 นิพจน์ระดับกลาง ดูรูป 32) ได้เลือกใช้ pg 125 mL G418 (Gibco), และได้เก็บเกี่ยว และ 1 - 2 x 106 เซลล์/มล.ในน้ำแข็งแช่ PBS/บี เอส เอ/NaN3 เสริม ด้วย lig 50 mL บริสุทธิ์ 25 ฮิวเมน IgG (ซิก บล็อก Fcy รีเซปเตอร์) เซลล์ถูก incubated กับ 0, 0.005-50 gg/mL (ขั้นตอนการเจือจาง 10-fold ใน PBS บีเอส เอ/NaN3 รุ่น 20E5 โคลนทั้งหมด) หรือ 0.002-20 1.tg/mL (10-fold เจือจางขั้นตอนใน PBS บีเอส เอ/NaN3 ทั้งหมดโคลน 12H 3 รุ่น)ผู้ปกครองเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 หรือ 12H 3 ไคเมริกฮิวเมน คุณ IgG4 แอนติ-ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 หรือ 12H 3 และรุ่นที่ 6 30 ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 หรือ 12H 3 30 นาที ที่ 4 องศาเซลเซียส ขนาน เมาส์ IgG1K ไอโซไทป์คอนโทรล (เวลาออก BD; 50.0 หรือ 20.0 gg/mL) และไคเมริกฮิวเมน IgGhlx ไอโซไทป์คอนโทรล (ch5D12 จากโคลนPanGenetics 50.0 หรือ 20.0 gg/มล.) ใช้เป็นตัวควบคุมเนกาทีฟ หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ได้มา incubated กับ 1: 200 ทำให้ IgG (เฉพาะ Fey) แพะ PE กลวงเมาส์แอนติแอนตี้ (JacksonImmunoResearch) กับ 1: 200 หรือผสมแอนตี้ IgG (เฉพาะ Fcy 5) แอนติ-ฮิวเมนแพะ PE กลวง (Jackson ImmunoResearch) 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดังแสดงในรูปที่ 28 (n = 2), ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134
แอนติบอดีโคลน 20E5 และทั้งหกรุ่นฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134
โคลนแอนติบอดี 20E5 ยา dependently และผูกไว้โดยเฉพาะเพื่อรีคอมบิแนนต์
20 ฮิวเมน CD134 ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5
และฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 รุ่น
20E5 VL1H3, 20E5_VL2H1, 20E5_VL2VH2 และ 20E5_VL2VH3
แสดงให้เห็นเหมือนเส้นโค้งไตเตรท, ซึ่งชี้ให้เห็นว่าแอนติเจน CD134
ของพวกเขาผูกพันความสัมพันธ์เป็นเหมือนกัน(ครึ่งสูงสุดผูกพัน EC5O 100 นาโนกรัม / มิลลิลิตร) ในขณะที่ฮิวเมไนซ์ IgG4k 25 แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 รุ่น 20E5 20E5_VL1H1 และ 20E5 VL1H2
ดูเหมือนจะแสดง ความสัมพันธ์ลดลงเล็กน้อยที่มีผลผูกพัน (EC5O 150 นาโนกรัม / มิลลิลิตร) เนื่องจากการใช้งานของแอนติบอดีรองโซ่เฉพาะอิมมูโนที่แตกต่างกัน
(เช่นเมาส์แอนติบอดีตรวจพบกับแอนติห่วงโซ่ -Fey แอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงในขณะที่เมริกไคฮิวเมนและฮิวเมไนซ์แอนติบอดี้ที่ตรวจพบกับแอนติ-x ห่วงโซ่ที่เฉพาะเจาะจง30 แอนติบอดี) เปรียบเทียบระหว่างเส้นโค้งไตเตรท (ไม่ได้แสดงข้อมูล) จากผู้ปกครองเมาส์แอนติ- ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 และเส้นโค้งไตเตรทจากไคเมริกฮิวเมนและฮิวเมไนซ์ IgG4ic แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 รุ่น 20E5 ไม่สามารถทำ. ดังแสดงในรูปที่ 29 (n = 2), ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 และทั้งหกรุ่นฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 5 แอนติบอดีโคลน 12H3 ยา dependently และผูกไว้โดยเฉพาะเพื่อคอมบิรีแนนต์ฮิวเมนCD134 ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 และฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 - ทั้งหกรุ่น12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 และ12H3_VL2VH3 - แสดงให้เห็นเส้นโค้งไตเตรทที่ไม่เหมือนกันซึ่งแสดงให้เห็นว่าทั้งหก10 ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 รุ่นแสดงให้เห็นว่าแอนติเจนที่สูงกว่าเล็กน้อยCD134 สัมพันธ์ที่ใกล้ชิดผูกพัน (EC50 50 นาโนกรัม / มิลลิลิตร) กว่าเมริกไคฮิวเมนIgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 (EC5o 100 นาโนกรัม / มิลลิลิตร) เนื่องจากการใช้งานของแอนติบอดี้รองโซ่เฉพาะอิมมูโนที่แตกต่างกัน(เช่นเมาส์แอนติบอดีตรวจพบกับแอนติ-Fey ห่วงโซ่แอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงในขณะที่ไคเมริก 15 ฮิวเมนและฮิวเมไนซ์แอนติบอดี้ที่ตรวจพบกับแอนติ - ห่วงโซ่ x เฉพาะแอนติบอดี) เปรียบเทียบระหว่างเส้นโค้งไตเตรท (ไม่ได้แสดงข้อมูล) จากผู้ปกครองเมาส์แอนติ- ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 และเส้นโค้งไตเตรทจากไคเมริกฮิวเมนและฮิวเมไนซ์IgG4-K แอน ติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 12H3 รุ่นไม่สามารถทำ. 20 (ข) การแข่งขันของฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 ด้วยเมาส์ของผู้ปกครอง biotinylated แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 ผูกพันกับรีคอมบิแนน ต์ฮิวเมน CD134: ฮิวเมนโปรตีนฟิวชั่น FCY (ELISA). 25 ก่อนที่จะมีการดำเนินการการวัดวิธี ELISA แข่งขันที่ EC5o ของไบโอติน(ใช้ N-hydroxysuccinimido-ไบโอตินจากเพียร์ซ) เมาส์ของผู้ปกครองแอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโน โคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 ถูกกำหนด (ดูด้านล่างสำหรับวิธีการ) และถูกระบุว่าจะเป็นประมาณ 20 นาโนกรัม / มิลลิลิตร (ดูรูปที่ 30 n = 3). การกำจัดของเมาส์ของผู้ปกครอง biotinylated แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโน โคลนอล 30 แอนติบอดี 12H3 โคลนที่มีความเข้มข้น EC50 ของที่ระบุโดยไม่มีป้ายกำกับผู้ปกครองเมาส์แอนติ- ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3, ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 และหก รุ่นฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ -. ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 ได้รับการตรวจสอบต่อมาเก้าสิบหกหลุมจานELISA แบนด้านล่าง (Corning) ถูกเคลือบด้วย 50 ng / ดีรีคอมบิแนนต์ฮิว เมน CD134: ฮิวเมนชอบกล (IgG1) โปรตีนฟิวชั่น (R & D Systems) ในพีบีเอส o / n ที่ 4 ° C หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / 0.05% Tween 20 5 แผ่นถูกบล็อกในพีบีเอส / 0.05% Tween 20/1% ส่วนบีเอสเอวี (Roche) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่RT ต่อมาแผ่นถูกบ่มกับ 0, 0.001-60.0 (3 เท่าเจือจางขั้นตอนในการบล็อกบัฟเฟอร์) GG / mL ไม่มีป้ายกำกับเมาส์ของผู้ปกครองแอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3, ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน12H3, หรือหกรุ่นฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 10 ร่วมกับ 20 นาโนกรัม / มิลลิลิตร (EC50) เมาส์ biotinylated ผู้ปกครองแอนติ - ฮิวเมนCD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี 12H3 โคลนเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ RT หลังจากที่กว้างขวางซักผ้าในพีบีเอส / 0.05% Tween 20 การยึดเกาะของ biotinylated เมาส์ของผู้ปกครองแอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 ถูกกำหนด 1: 5000 ปรับลดมะรุมสเปอร์ออกซิเด-คอนจูเกตเตร็ปทาวิดิน (แจ็คสัน ImmunoResearch) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง 15 RT ตามด้วยพร้อมต่อการใช้สารละลายของพื้นผิวทหารไทย (Invitrogen) สำหรับการตรวจจับสี หลังจากเพิ่ม 1 M 112SO4 ความหนาแน่นแสงวัดที่ความยาวคลื่น450 นาโนเมตร (ความยาวคลื่นอ้างอิง 655 นาโนเมตร) โดยใช้ไมโครอ่าน(BioRad). ดังแสดงในรูปที่ 31 (n = 2) เมาส์ที่ไม่มีป้ายกำกับผู้ปกครองแอนติ - ฮิ วเมน CD134 20 แอนติบอดีโคลน 12H3 และไม่มีป้ายกำกับไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 แสดงให้เห็นถึงการเคลื่อนที่ที่เหมือนกันของผู้ปกครอง biotinylated เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3, ซึ่งชี้ให้เห็นว่าเมาส์ของผู้ปกครองแอนติ- ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 และไคเมริกฮิวเมนIgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 แสดงเหมือน CD134 25 แอนติเจนสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดผูกพัน (รางครึ่งสูงสุดหรือยับยั้ง (IC50) ของเมาส์ของผู้ปกครองbiotinylated แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี 12H3 โคลนที่750 นาโนกรัม / มิลลิลิตร) ทั้งหกที่ไม่มีป้ายกำกับฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 12H3 รุ่น - 12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 และ 12H3_VL2VH3 - แสดงให้เห็นถึงการเคลื่อนที่คล้ายกันของเมาส์30 biotinylated ผู้ปกครองแอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3, ซึ่งชี้ให้เห็นว่าทั้งหกที่ไม่มีป้ายกำกับฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 รุ่นแสดงแอนติเจน CD134 คล้ายผูกพันความสัมพันธ์(ไอซี: -..-: 250-300 นาโนกรัม / มิลลิลิตร). ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าทั้งหกฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลนCD134 12H3 รุ่นแสดงให้เห็นว่าแอนติเจน CD134 ที่สูงขึ้นมีผลผูกพันความสัมพันธ์กว่าเมาส์ของผู้ปกครองแอนติ- ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 และไคเมริก 5 ฮิวเมน IgG4-TC แอนติ - ฮิว เมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3. (ค) การยึดเกาะของฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี 20E5 และ 12H3 กับยาวเต็มรูปแบบฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์แสดงบน 293-F สายพันธุ์ของเซลล์ (FACS) 10 เพื่อที่จะวิเคราะห์การยึดเกาะของ ฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี 20E5 และ 12H3 ในรายละเอียดความจุที่มีผลผูกพันของฮิวเมไนซ์IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี 20E5 และ 12H3 ที่มีพื้นผิวฮิวเมน CD134 ยาวเต็มรูปแบบในวันที่ (transfectants มั่นคง) 293-F เซลล์เส้นถูกกำหนดโดยโฟลไซโตเมทรีและยิ่งเมื่อเทียบกับผลผูกพัน15 ลักษณะของเมาส์ของผู้ปกครองที่สอดคล้องกันของพวกเขาแอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดี. คู่เต็มตัวฮิวเมน CD134 (. SEQ ID NO 1) เป็นอีกครั้งที่โคลนใน pcDNA3.1- มาพลาสมิดแสดงออก (ดูตัวอย่าง 11 (ง) ด้านล่าง) นี้ยาวเต็มรูปแบบฮิวเมนCD134 พลาสมิดที่ถูก transfected ใน FreeStyleTM เซลล์ 293-F (เทคโนโลยีชีวิต) 20 ใช้ FreeStyleTM 293 ระบบการแสดงออก (เทคโนโลยีชีวิต) Stable ฮิวเมนยาวเต็มรูปแบบเซลล์CD134-transfected (โคลนที่ 5 ที่มีพื้นผิวสูงแสดงออก CD134. ระดับและโคลนไม่มี 23 ที่มีพื้นผิวระดับกลางระดับการแสดงออกของ CD134. ดูรูปที่32) ได้รับการคัดเลือกโดยใช้ 125 pg / มิลลิลิตร G418 (Gibco) และได้รับการเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1- 2x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในพีบีเอสน้ำแข็งแช่เย็น / บีเอสเอ / NaN3 เสริมด้วย 50 lig / mL บริสุทธิ์ 25 ฮิวเมน IgG (ซิกม่า; ปิดกั้น FCY รีเซปเตอร์) เซลล์ที่ถูกบ่มกับ 0, .005-50 GG / มิลลิลิตร (10 เท่าตามขั้นตอนในการลดสัดส่วนพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 ทั้งหมดโคลนรุ่น 20E5) หรือ 0.002- 20 1.tg/mL (10 เท่าตามขั้นตอนในการลดสัดส่วนพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 ทั้งหมดโคลน 12H3 รุ่น) ผู้ปกครองเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 20E5 หรือ 12H3, ไคเมริกฮิวเมนIgG4-K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 20E5 หรือ 12H3 หกรุ่นที่30 ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 20E5 หรือ 12H3 30 นาทีที่4 ° C ในแบบคู่ขนานเมาส์ IgG1K ไอโซไทป์คอนโทรล (BD ชีววิทยาศาสตร์; 50.0 หรือ 20.0 GG / มิลลิลิตร) และไคเมริกฮิวเมน IgGhlx ไอโซไทป์คอนโทรล (โคลน ch5D12 จากPanGenetics; 50.0 หรือ 20.0 GG / มิลลิลิตร) ถูกนำมาใช้เป็น ควบคุมเนกาทีฟ หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มต่อมา 1: 200 ปรับลดแพะ PE-ผันแอนติ -mouse IgG (ชอบกลเฉพาะ) แอนติบอดี (แจ็คสันImmunoResearch) หรือ 1: 200 ปรับลดแพะ PE-ผันแอน ติ - ฮิวเมน IgG (5 FCY เฉพาะ) แอนติบอดี (แจ็คสัน ImmunoResearch) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตามที่แสดงใน 28 รูป ( n = 2 ) , ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134
แอนติบอดีโคลน 20e5 ทั้งหมด 6 รุ่น ฮิวเมไนซ์ igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134
แอนติบอดีโคลน 20e5 dose dependently และโดยเฉพาะต้องรีคอมบิแนนต์
20 ฮิวเมน cd134 . ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5
และ ฮิวเมไนซ์ igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 รุ่น
20e5 vl1h3 20e5_vl2h1 20e5_vl2vh2 , และ , 20e5_vl2vh3 พบโค้งไทเทรตเหมือนกัน
ซึ่งพบว่าแอนติเจนของ cd134 ผูกความสัมพันธ์คือ
เหมือนกัน ( สูงสุดครึ่งผูก ec5o 100 ng / ml )ส่วนฮิวเมไนซ์ igg4k 25 แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 และรุ่น 20e5_vl1h1 20e5 vl1h2
ดูเหมือนจะแสดงระดับต่ำลงเล็กน้อย ผูกติด ( ec5o 150 ng / ml ) เนื่องจากการใช้อิมมูโนโกลบูลินแตกต่างกันเฉพาะรองโซ่
ของแอนติบอดี ( เช่น แอนติบอดีเมาส์
ถูกตรวจพบด้วยแอนติโซ่เฟย์แอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงในขณะที่ไคเมริก
และฮิวเมนฮิวเมไนซ์แอนติบอดีพบกับแอนติ - x โซ่เฉพาะ
30 antibodies ) , การเปรียบเทียบระหว่างการไทเทรตโค้ง ( ข้อมูลไม่แสดง ) จากผู้ปกครอง
เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลนและ 20e5 เส้นโค้งไตจากไคเมริกฮิวเมนฮิวเมไนซ์ igg4ic และแอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 รุ่นไม่สามารถทำ .
ตามที่แสดงใน 29 รูป ( n = 2 ) , ไคเมริกฮิวเมน igg4k . แอนติ - ฮิวเมน cd134
แอนติบอดีโคลน 12h3 ทั้งหมด 6 รุ่น ฮิวเมไนซ์ igg4k . แอนติ - ฮิวเมน cd134 5 แอนติบอดีโคลน 12h3 dose dependently และโดยเฉพาะต้องรีคอมบิแนนต์
ฮิวเมน cd134 . ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3
และ ฮิวเมไนซ์ igg4k . แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 - ทั้งหมดหกรุ่น
12h3_vl1h1 12h3_vl1h2 12h3_vl1h3 12h3_vl2h1 , , , , และ 12h3_vl2vh2
12h3_vl2vh3 - แสดงไม่เหมือนเส้นโค้งไต ซึ่งพบว่าทั้งหมดหก
10 ฮิวเมไนซ์ igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 รุ่นแสดง
สูงขึ้นเล็กน้อย cd134 binding affinity แอนติเจน ( ec50 50 นาโนกรัม / มิลลิลิตร ) กว่าไคเมริก
ฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 ( ec5o 100 ng / ml ) เนื่องจากการใช้อิมมูโนโกลบูลิน

โซ่แตกต่างกันเฉพาะมัธยมศึกษาภูมิคุ้มกัน ( เช่น แอนติบอดีเมาส์
ตรวจพบแอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงกับแอนติ - โซ่ เฟย์ ,ในขณะที่ไคเมริก 15 ฮิวเมนฮิวเมไนซ์แอนติบอดีและถูกตรวจพบด้วยแอนติ - x โซ่เฉพาะ
antibodies ) , การเปรียบเทียบระหว่างการไทเทรตโค้ง ( ข้อมูลไม่แสดง ) จากผู้ปกครอง
เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลนและ 12h3 เส้นโค้งไตจากไคเมริก
และฮิวเมนฮิวเมไนซ์ igg4-k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 รุ่น
ไม่สามารถทำ .
20
( B )การแข่งขันของฮิวเมไนซ์ igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนกับผู้ปกครอง 12h3 ไลเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 ผูกพันกับรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน cd134 : ฮิวเมน FCY ของโปรตีน ( ELISA ) .
25 ก่อนการแสดงการแข่งขัน ) วัด , ec5o ของ
ไล ( ใช้ n-hydroxysuccinimido-biotin จาก Pierce ) ผู้ปกครองเมาส์แอนติ -
ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 ตั้งใจ ( ดูด้านล่างสำหรับ
วิธี ) และถูกระบุว่าเป็นเกี่ยวกับ 20 ng / ml ( ดูรูป 30 , n = 3 )
การเคลื่อนที่ของเมาส์แอนติไลผู้ปกครอง - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอล 30 แอนติบอดีโคลน 12h3 ที่ระบุความเข้มข้นใกล้เคียง ec50 โดยผู้ปกครอง
เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 ไคเมริกฮิวเมน , igg4k แอนติ -
ฮิวเมน cd134 12h3 แอนติบอดีโคลน ,6 รุ่นฮิวเมไนซ์ igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 ต่อมาได้ศึกษา .
เก้าสิบหกหลุมด้านล่างแบน 3 แผ่น ( คอร์น ) ถูกเคลือบด้วย 50
ng / ดีรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน cd134 : ฮิวเมนเฟย์ ( ( ) โปรตีน ( R & D
ระบบ ) ใน PBS O / N ที่อุณหภูมิ 4 องศา หลังจาก อย่างละเอียดซักใน PBS / 0.05 เปอร์เซ็นต์ Tween 20
5 แผ่นถูกบล็อกใน PBS / 0.05 เปอร์เซ็นต์ Tween 20 / 1 % ( ส่วน V ( โรช ) 1 ชั่วโมง
ที่ RT . ต่อมา แผ่นถูกบ่มกับ 0 0.001 - 60.0 ( 3-fold เจือจาง
ขั้นตอนในบล็อกบัฟเฟอร์ ) GG / ml unlabeled ผู้ปกครองเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134
แอนติบอดีโคลน 12h3 ไคเมริกฮิวเมน igg4k , แอนติ - ฮิวเมน cd134
12h3 แอนติบอดีโคลน ,ค็อคหกรุ่นของฮิวเมไนซ์ igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 10 ร่วมกับ 20 ng / ml ( ec50 ) ไลผู้ปกครองเมาส์แอนติ - ฮิวเมน
cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 1 ชั่วโมงที่ RT . หลังจากอย่างละเอียดซัก
ใน PBS / 0.05 เปอร์เซ็นต์ Tween 20 , การยึดเกาะของไลเมาส์แอนติฮิวเมน
- ผู้ปกครองcd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 ตั้งใจกับ 1:5000 เจือจาง
. เอนไซม์ conjugated สเตร็ปทาวิดิน ( แจ็คสัน immunoresearch ) 1 15 ชั่วโมงครับ ตามสภาพพร้อมใช้งาน ( สารละลายพื้นผิว ( Invitrogen )
7.4 การตรวจหา หลังจากเพิ่ม 1 เมตร 112so4 แสง ความหนาแน่นและวัดที่