2.7. Fe2+chelation assayFe2+-chelat

2.7. Fe
2+
chelation assay
Fe
2+
-chelating capacity of the extracts was determined as described byMinotti
and Aust (1987)and modified byPuntel et al. (2005). Briefly, 500 lM of freshly-prepared FeSO4was added to a reaction mixture comprising 0.1 M Tris–HCl (pH 7.4),
0.9% NaCl and the extract or 0.1 M Tris–HCl (blank) or reference (EDTA). After a
5-min incubation at room temperature, 0.35% 1,10-phenanthroline (w/v) was
added and the absorbance at 510 nm was determined.
2.8. Lipid peroxidation assay
C57BL/6 mice (male, 25–30 g, 3–4 months old) were sourced from the animal
house at the Centre for Molecular and Structural Biomedicine, University of Algarve,
Portugal, and were housed in polyacrylic cages at 20–23C and 40–55% relative
humidity, withad libitumaccess to food. The animal experiments conformed to ethical standards for clinical research and EU guidelines. Mice were killed by CO2
asphyxiation and the cerebral tissue (whole brain) was rapidly dissected, placed
on ice and weighted, and then homogenized in 0.1 M Tris–HCl (pH 7.4) (1/10, w/
v). The homogenate was centrifuged (Eppendorf, Centrifuge 5804 R, Hamburg, Germany) for 10 min at 3000gand the low-speed supernatant was used for the lipid
peroxidation assay (Bellé et al., 2004).
Lipid peroxidation was estimated by measuring thiobarbituric acid-reactive
substances (TBARS), as described byOhkawa et al. (1979). The brain homogenate
was incubated at 37C for 1 h in a medium containing 0.1 M Tris–HCl buffer (pH
7.4), sample or references (Trolox and BHT), 250lM of freshly-prepared FeSO4
and distilled water. After incubation, the reaction was stopped by adding 8.1%
SDS, acetic acid/HCl (pH 3.4) and 0.8% TBA. The TBARS were measured by determining absorbance at 532 nm using a standard curve of malondialdehyde (MDA).
2.9. In vitro anti-cholinesterases inhibition assay
The evaluation of AChE and BChE inhibitory activities was based on Ellman’s
method (Ellman et al., 1961), using a 96-well microplate reader. Firstly, 3 mM
DTNB, 15 mM substrate (ATCI or BTCI), 100 mM phosphate buffer (pH 8.0) and extract (2.5 mg/ml), buffer or galanthamine (standard inhibitor) were mixed. Finally,
AChE or BChE (0.28 U/ml) were added and the absorbance was read at 405 nm for
5 min. The reaction enzyme activity was calculated as a percentage of the velocities
compared to that of the assay using buffer without any inhibitor. Inhibitory activity
was calculated from 100 subtracted by the percentage of enzyme activity.
2.10. Statistical analysis
All the experiments were carried out three times using triplicate samples. The
data were expressed as the mean ± standard error and were subjected to one-way
analysis of variance (ANOVA). Multiple comparisons of means were carried out
70 P. Costa et al. / Food and Chemical Toxicology 57 (2013) 69–74
using Duncan’s New Multiple Range Test. All statistical analysis was carried out
using the SPSS statistical package for Windows (release 18.0; SPSS Inc., Chicago,
IL, USA).
3. Results and discussion

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.7. Fe2 +ทดสอบรวมFe2 +-คีเลตสารสกัดจุถูกกำหนดเป็น byMinotti อธิบายไว้และ Aust (1987) และแก้ไข byPuntel et al. (2005) สั้น ๆ 500 lM ของ FeSO4was ที่ปรุงสดใหม่ลงจากปฏิกิริยาส่วนผสมประกอบด้วย 0.1 M ทริสเรทติ้ง – HCl (pH 7.4),0.9% NaCl และสารสกัด หรือ 0.1 M ทริสเรทติ้ง – HCl (ว่าง) หรือการอ้างอิง (EDTA) หลังจาก5 นาทีบ่มที่อุณหภูมิห้อง 0.35% 1, 10-phenanthroline (w/v) คือเพิ่ม และค่าที่ 510 nm กำหนด2.8 ทดสอบการ peroxidation ของไขมันหนู C57BL/6 (ชาย 25 – 30 กรัม 3 – 4 เดือน) ที่ได้มาจากสัตว์บ้านที่ศูนย์โมเลกุลและโครงสร้างเวชศาสตร์ชีวภาพ มหาวิทยาลัย Algarveโปรตุเกส และมา polyacrylic กรงที่สัมพัทธ์ 40-55% และ 20-23 Cความชื้น withad libitumaccess อาหาร การทดลองในสัตว์ควรทำตามมาตรฐานทางจริยธรรมสำหรับการวิจัยทางคลินิกและแนวทางของ EU หนูถูกฆ่าตาย โดย CO2asphyxiation และเนื้อเยื่อสมอง (สมองทั้งหมด) ได้อย่างรวดเร็ว dissected วางบนน้ำแข็ง และถ่วงน้ำหนัก และ homogenized แล้ว ใน 0.1 M ทริสเรทติ้ง – HCl (pH 7.4) (1/10 พร้อมv) . homogenate การถูก centrifuged (Eppendorf เหวี่ยง 5804 R ฮัมบูร์ก เยอรมนี) 10 นาทีที่ 3000gand supernatant ความเร็วต่ำใช้สำหรับไขมันperoxidation assay (Bellé et al. 2004)ประเมิน โดยการวัด thiobarbituric กรดปฏิกิริยา peroxidation ของไขมันสาร (TBARS), เป็นอธิบาย byOhkawa et al. (1979) Homogenate สมองมี incubated 37 c เป็นเวลา 1 ชั่วโมงในขนาดกลางที่ประกอบด้วย 0.1 M ทริสเรทติ้ง – HCl บัฟเฟอร์ (pH7.4), ตัวอย่างหรือการอ้างอิง (Trolox และบาท), 250lM ของ FeSO4 ปรุงสดใหม่และน้ำกลั่น หลังจากบ่ม หยุดปฏิกิริยา โดยการเพิ่ม 8.1%สารเคมี กรดอะซิ ติก/HCl (pH 3.4) และ 0.8% TBA TBARS ถูกวัด โดยการกำหนดค่าที่ 532 nm ใช้เส้นโค้งมาตรฐานของ malondialdehyde (MDA)2.9 ทดสอบการยับยั้ง cholinesterases ต้านที่ในหลอดทดลองการประเมินผลของกิจกรรมการยับยั้งอาการปวดและ BChE ตามของ Ellmanวิธี (Ellman et al. 1961), ใช้อ่าน microplate 96 หลุม ประการแรก 3 มม.DTNB, 15 มม.พื้นผิว (ATCI หรือ BTCI), 100 mM ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 8.0) และสารสกัด (2.5 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร), บัฟเฟอร์ หรือ galanthamine (มาตรฐานยับยั้ง) ถูกผสม ในที่สุดปวดหรือ BChE (0.28 U/มิลลิลิตร) เพิ่ม และค่าที่ถูกอ่านที่ 405 nm สำหรับ5 นาที คำนวณเป็นเปอร์เซ็นต์ของความเร็วของปฏิกิริยาเอนไซม์เมื่อเทียบกับการทดสอบที่ใช้บัฟเฟอร์โดยไม่ยับยั้งใด ๆ ยับยั้งกิจกรรมคำนวณจาก 100 หักออก โดยเปอร์เซ็นต์ของเอนไซม์2.10. สถิติวิเคราะห์การทดลองดำเนินการ 3 ครั้งโดยใช้ตัวอย่างตสแควร์ การข้อมูลถูกแสดงเป็นข้อผิดพลาดมาตรฐานของค่าเฉลี่ย± และถูกทางเดียวการวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) เปรียบเทียบหลายวิธีดำเนินการคอสตา 70 P. et al. / อาหารและพิษวิทยาสารเคมี 57 (2013) 69 – 74ใช้ของ Duncan ใหม่หลายช่วงทดสอบ ดำเนินการวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดใช้แพคเกจทางสถิติ SPSS สำหรับ Windows (ปล่อย 18.0 SPSS Inc. ชิคาโกIL สหรัฐอเมริกา)3. ผล และการอภิปราย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.7 เฟ
2+
ขับทดสอบ
Fe
2+
จุ -chelating ของสารสกัดถูกกำหนดตามที่อธิบายไว้ byMinotti
และ Aust (1987) และการแก้ไข byPuntel et al, (2005) สั้น ๆ , LM 500 ของสดใหม่เตรียม FeSO4was เพิ่มไปยังผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4)
0.9% โซเดียมคลอไรด์และสารสกัดหรือ 0.1 M Tris-HCl (ว่าง) หรือการอ้างอิง (EDTA) หลังจาก
บ่ม 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง 0.35% 1,10-Phenanthroline (w / v) คือการ
เพิ่มและการดูดกลืนแสงที่ 510 นาโนเมตรถูกกำหนด.
2.8 lipid peroxidation ทดสอบ
C57BL / 6 หนู (ชาย, 25-30 กรัมอายุ 3-4 เดือน) มีที่มาจากสัตว์
บ้านที่ศูนย์โมเลกุลและโครงสร้าง Biomedicine มหาวิทยาลัยแอลการ์ที่
โปรตุเกสและถูกตั้งอยู่ในกรง polyacrylic ที่ 20 -23? C และญาติ 40-55%
ความชื้น libitumaccess withad อาหาร การทดลองในสัตว์เป็นไปตามมาตรฐานทางจริยธรรมสำหรับการวิจัยทางคลินิกและแนวทางของสหภาพยุโรป หนูถูกฆ่าโดย CO2
สลบและเนื้อเยื่อสมอง (ทั้งสมอง) ถูกชำแหละอย่างรวดเร็ววาง
บนน้ำแข็งและถ่วงน้ำหนักแล้วปั่นใน 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4) (1/10 W /
V) homogenate ถูกหมุนเหวี่ยง (Eppendorf, เครื่องปั่นเหวี่ยง 5804 R, ฮัมบูร์ก, เยอรมนี) เป็นเวลา 10 นาทีที่ 3000gand ใสความเร็วต่ำที่ใช้สำหรับไขมัน
ทดสอบ peroxidation (Belle et al., 2004).
เกิด lipid peroxidation ถูกประเมินโดยการวัดกรด thiobarbituric ปฏิกิริยา
สาร (TBARS) ตามที่อธิบายไว้ byOhkawa et al, (1979) homogenate สมอง
ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงในสื่อที่มี 0.1 M Tris-HCl บัฟเฟอร์ (pH
7.4) ตัวอย่างหรือการอ้างอิง (Trolox และ BHT) 250lM ของสดใหม่เตรียม FeSO4
และน้ำกลั่น หลังจากการบ่มปฏิกิริยาก็หยุดโดยการเพิ่ม 8.1%
SDS, กรดอะซิติก / HCl (pH 3.4) และ 0.8% TBA TBARS ถูกวัดโดยการพิจารณาการดูดกลืนแสงที่ 532 นาโนเมตรโดยใช้เส้นโค้งมาตรฐาน Malondialdehyde (MDA).
2.9 ในหลอดทดลองต่อต้าน cholinesterases ยับยั้งการทดสอบ
การประเมินผลการเจ็บและ BChE กิจกรรมยับยั้งอยู่บนพื้นฐานของ Ellman
วิธี (Ellman et al., 1961) โดยใช้เครื่องอ่าน microplate 96 หลุม ประการแรก 3 mm
DTNB, 15 มมสารตั้งต้น (ATCI หรือ BTCI) 100 มิลลิเมตรฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 8.0) และสารสกัดจาก (2.5 mg / ml) หรือ buffer galanthamine (ยับยั้งมาตรฐาน) ถูกผสม สุดท้าย
เจ็บหรือ BChE (0.28 U / ml) มีการเพิ่มและการดูดกลืนแสงที่ถูกอ่านได้ที่ 405 นาโนเมตรสำหรับ
5 นาที กิจกรรมของเอนไซม์ปฏิกิริยาที่คำนวณเป็นเปอร์เซ็นต์ของความเร็วที่
เมื่อเทียบกับการทดสอบโดยใช้บัฟเฟอร์โดยไม่ต้องยับยั้งใด ๆ ยับยั้ง
ที่คำนวณได้จาก 100 หักเปอร์เซ็นต์ของเอนไซม์.
2.10 การวิเคราะห์สถิติ
การทดสอบทั้งหมดได้ดำเนินการสามครั้งโดยใช้ตัวอย่างเพิ่มขึ้นสามเท่า
ข้อมูลที่ได้แสดงเป็นข้อผิดพลาดมาตรฐาน±หมายและถูกยัดเยียดให้ทางเดียว
การวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) เปรียบเทียบหลายวิธีได้ดำเนินการ
70 พีคอสตา, et al อาหาร / อาหารและสารเคมีพิษวิทยา 57 (2013) 69-74
ใช้การทดสอบช่วงหลายใหม่ของดันแคน ทั้งหมดการวิเคราะห์ทางสถิติได้ดำเนินการ
โดยใช้โปรแกรมสำเร็จรูปทางสถิติ SPSS สำหรับ Windows (ปล่อย 18.0; SPSS อิงค์, Chicago,
IL, USA).
3 ผลการค้นหาและการอภิปราย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.7 . เฟ2 +คีเลชั่น การทดสอบเฟ2 +- และความสามารถของสารสกัดถูกกำหนดไว้ byminottiAUST ( 1987 ) และการ bypuntel et al . ( 2005 ) สั้น , 500 LM ของเตรียมสด feso4was เพิ่มปฏิกิริยาผสมความเข้มข้น 0.1 M HCl ซึ่งประกอบด้วย– ( pH 7.4 )โซเดียมคลอไรด์ 0.9% และสารสกัดความเข้มข้น 0.1 M HCl หรือบริษัท– ( ว่าง ) หรืออ้างอิง ( EDTA ) หลังจาก5 นาทีบ่มที่อุณหภูมิห้อง 1,10-phenanthroline 0.35 % ( w / v ) คือการเพิ่มและการดูดกลืนแสงที่ 510 nm ได้กำหนดไว้2.8 . การเกิด lipid peroxidation )c57bl / 6 หนู ( อายุ 25 – 30 กรัม , 3 - 4 เดือน ) มีที่มาจากสัตว์บ้านที่ศูนย์เพื่อ Biomedicine โมเลกุลและโครงสร้างที่มหาวิทยาลัยโปรตุเกสและถูกขังในกรงที่โพลีอาครายลิค 20 – 40 – 55% และ 23C สัมพัทธ์ความชื้น , withad libitumaccess อาหาร สัตว์ทดลองให้สอดคล้องกับมาตรฐานจริยธรรมสำหรับแนวทางการวิจัยทางคลินิกและ EU หนูถูกฆ่าโดยคาร์บอนไดออกไซด์การขาดอากาศหายใจ และเนื้อเยื่อสมอง ( สมองทั้งหมด ) คืออย่างรวดเร็วผ่าวางไว้แข็งและหนัก แล้วบดใน 0.1 M HCl ( pH 7.4 ) บริษัทฯ ( 1 / 10 W /5 ) โดยแยกเป็นระดับ ( เพนดอร์ฟ , เครื่องปั่นเหวี่ยง 5804 R , ฮัมบูร์ก , เยอรมนี ) สำหรับ 10 นาทีที่ 3000gand ต่ำความเร็วสูงที่ใช้สำหรับไขมัน- การใช้ระฆังé et al . , 2004 )การเกิด lipid peroxidation คือประมาณเท่ากับปฏิกิริยาโดยวัดกรดสาร ( ปกติ ) ตามที่อธิบายไว้ byohkawa et al . ( 1979 ) สมองแยกคืออุณหภูมิ 37c เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในอาหารที่มีความเข้มข้น 0.1 M HCl บัฟเฟอร์ pH โดยจำกัด7.4 ) ตัวอย่างหรืออ้างอิง ( สาร BHT และ 250lm ของเตรียมสด feso4 )และน้ำกลั่น หลังจากบ่ม , ปฏิกิริยาถูกหยุดโดยการเพิ่ม 8.1%SDS , กรดน้ำส้ม / HCl ( pH 3.4 ) และ 0.8% TBA . วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ปกติโดยการกำหนดที่ 532 นาโนเมตรโดยใช้เส้นโค้งมาตรฐานของมาลอนไดอัลดีไฮด์ ( MDA )2.9 . ในการต่อต้านเอนไซม์โคลีนเอสเตอเรสในการยับยั้งการประเมินอาการปวดและ bche กิจกรรมการยับยั้งบนพื้นฐานของเอลเมิ่นวิธี ( เอลเมิ่น et al . , 1961 ) โดยใช้เครื่องอ่าน 96 ดีพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย . ประการแรก , 3 มม.dtnb 15 มม. ฐานรอง ( เอทีซีไอ หรือ btci ) 100 มิลลิเมตร ( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 8.0 ) และสารสกัด ( 2.5 มก. / มล. ) , บัฟเฟอร์หรือ galanthamine ( ไม่ได้มาตรฐาน ) ผสม ในที่สุดปวดหรือ bche ( 0.28 U / ml ) ถูกเพิ่มและการดูดกลืนแสงก็อ่านที่ 405 nm สำหรับ5 นาที ปฏิกิริยาเอนไซม์คำนวณเป็นเปอร์เซ็นต์ของความเร็วเมื่อเทียบกับที่ของแบคทีเรียใช้บัฟเฟอร์โดยไม่ยับยั้ง . กิจกรรมการยับยั้งคำนวณได้จาก 100 หักออกโดยร้อยละของกิจกรรมของเอนไซม์2.10 . สถิติที่ใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูลการทดลองทั้งหมดพบว่าสามครั้งโดยใช้ตัวอย่างทำสำเนาสามฉบับ . ที่ข้อมูลที่แสดงเป็นค่าเฉลี่ยความคลาดเคลื่อนมาตรฐาน และ±ถูก ?การวิเคราะห์ความแปรปรวน ( ANOVA ) การเปรียบเทียบพหุวิธีทดลอง70 . คอสตา et al . / สารเคมีในอาหารและพิษวิทยา ( 2013 ) 69 และ 74 ครั้งโดยใช้ Duncan ' s New Multiple Range Test สถิติวิเคราะห์ทั้งหมดโดยใช้โปรแกรมสำเร็จรูป SPSS / PC สำหรับ Windows ( รุ่น 18.0 ; SPSS Inc , ชิคาโกIL , USA )3 . ผลและการอภิปราย