Sequencing, Amino Acid Sequence Ana

Sequencing, Amino Acid Sequence Analysis, Phylogenetic Construction
Primer sets (5'-ATG GGCY CCA GAY CTT CTA C-3' (ฟอร์เวิร์ด) (SEQ ID NO:17), 5'-
CTG CCA CTG CTA GTT GTG ATA ATC C-3' (รีเวิร์ส)(SEQ ID NO:18) were used for
amplifying the fusion protein gene of Newcastle Disease Virus. The PCR protocol was
established with modifications from the วิธี previously described (Berhanu et al., Virol J., 7:183, 2010). The real time PCR ของผสมs consisted of 10 pi of SYBR green master mix, the
respective primer sets and PCR grade water to make up the final volume of 20 IA per reaction. The PCR ของผสมs were subjected to real time PCR amplification in a 384-well microplate in the LC480 Real Time PCR instrument (LC 480, Roche). The melting peaks and melting curves were observed by using the Absolute Quant Software provided with the instrument. The thermal
profile was set at: pre-การทำให้เสียสภาพ at 95°C เป็นเวลา 3 วินาที, followed by 45 cycles of 1 minute
การทำให้เสียสภาพ at 95°C, 1 minute for annealing at 56°C and 1 minute for elongation at 72°C.
Melting curve analysis was performed to measure the specificity of PCR product. After PCR cycling, samples were heated to 95°C เป็นเวลา 1 second and 65°C เป็นเวลา 15 วินาที and then heated to 95°C continuously at a linear transition rate. The real time PCR cycle was run using the
LightCycler 480 (Rochee).
The same primer sets were used for sequencing. The PCR products of the expected
แอมพลิคอน sizes were purified by using the PCR clean-up gel extraction kit according to the
manufacturer's protocol with slight modifications (Analytik Jena, Geimany). Sequencing of the fusion protein gene of NDV was done in a commercial sequencing facility using the BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit. In order to confirm that all positive cases were true
Newcastle disease virus, a Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) search of the sequence was done in the Genbank database. The sequence editing and assembly were done by using
BioEdit การเทียบเรียงลำดับ Editor version 7.0.5.2 (Tom Hall, US). การเทียบเรียงลำดับs were


done by using ClustalX. The phylogenetic tree was constructed by using the distance-based
neighbor joining วิธี by using Mega 5 software (Biodesign Institute, Tempe, Arizona) and evaluated using the bootstrapping วิธี calculated on 1000 repeats of the alignment. The
ความเหมือนกันของลำดับ matrix was generated with BioEdit การเทียบเรียงลำดับ Editor version 7.0.5.2 (Tom Hall, US).
DIVA (Differentiation of Infected versus Vaccine) assay
Positive NDV samples were subjected to the DIVA assay. The DIVA assay was
established by using primer sets: ฟอร์เวิร์ด primer 5'-CTG CCA CTG CTA GTT GIG ATA ATC C-3' (SEQ ID NO:31, I = inosine), รีเวิร์ส primer 5'-CCT TGG TGA ITC TAT CCG IAG G-3' (@E0 DD NO:32, I = inosine) that amplify the hyper-variable region of the fusion protein gene of NDV. The assay consisted of lOul of the highly saturated fluorescent dye master mix (Roche), 2111 of 25mM MgCl2' 0.50 of the primer pair, template and PCR grade water. The samples were loaded into the 384-well microwell plate and subjected to PCR amplification in areal time PCR machine (LightCycler 480, Roche). The thermal cycling reactions consisted of an initial
การทำให้เสียสภาพ (3s at 95°C). The amplification consisted of การทำให้เสียสภาพ (1 mM at 95°C), annealing (1 mM at 60°C) and extension (1 นาทีที่ 72°C). The PCR was immediately followed by high
reสารละลาย melting curve analysis. The differentiation of the true NDV virus isolates versus the vaccine สายพันธุ์ was achieved by using vaccines as positive controls and comparing their melting curve signatures.
NDV genotype differentiation by วีวีing (HRM) Curve analysis
Positive NDV samples were subjected to the HRM assay. The HRM assay was
established by using primer sets (SEQ ID NO:17 and SEQ ID NO:18) that amplify the fusion
protein gene of NDV. The assay consisted of 10111 of the highly saturated fluorescent dye master mix (Roche), 20 of 25mM MgCl2, 0.50 of the primer pair, template and PCR grade water. The samples were loaded into the 384-well microwell plate and subjected to PCR amplification in a เรียลไทม์ PCR machine (LightCycler 480, Roche). The thermal cycling reactions consisted of an initial การทำให้เสียสภาพ (3s at 95°C). The amplification consisted of การทำให้เสียสภาพ (1 mM at 95°C), annealing (1 mM at 60°C) and extension (1 mM at 72°C). The PCR was immediately followed by วีวีing curve analysis. The differentiation of the NDV genotypes was achieved by using known positive NDV genotypes as positive controls and comparing their melting curve signatures. Confirmation of the assay was done by sequencing the positive NDV isolates.

Validation
A typical validation based on ISO 17025 and MIQE (Minimum Information for
Publication of Quantitative เรียลไทม์ PCR Experiments has 8 parameters (Analytical sensitivity, specificity, repeatability, recovery, reproducibility, ruggedness/robustness and
purity/concentration) that should be tested. Upon completion of the development of the assays, a simple validation of the protocols was carried out to distinguish its analytical sensitivity,
specificity and confirmation by sequencing and amino acid sequence analysis.
Analytical sensitivity
The aim of the study is to determine the limit of detection (LOD)/lowest concentration of the target agent of interest that can be detected. All concentration of reference materials were measured by using a UV Spectrophotometer. Concentrations were standardized to 10pg/ptl. An end-point dilution (ten-fold serial dilution) was used until the assay could no longer detect the target organism (no detection signals).
Specificity
The aim of the study is to assess the specificity of the assay to detect the target agent of interest in the presence of other infectious agents. The specificity of the test was conducted by testing the protocol against 5 other organisms (Infectious Bronchitis Virus, Infectious Bursal
Disease Virus, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma gallisepticum, Avian pneumovirus). To pass this parameter, the assay should not produce the same detection signals (melting peaks) or should not produce any detection signals for other organisms. The วิธี should be specific enough to detect only the target agent of interest even in the presence of other flora.
Sequencing and amino acid sequence analysis.
The parameter was conducted as described above.
Results
Sampling
Samples from all 14 farms were found to be positive for NDV.
Sequencing, Amino Acid Sequence Analysis, Phylogenetic Construction
BLAST analysis showed that all sequences samples were true NDV cases when
compared with other sequences in Genbank. Amino acid sequence analysis of the fusion (F) gene of fourteen Malaysian NDV isolates showed that eleven (11) of the isolates were categorized as velogenic virus and three (3) were lentogenic. The 11 velogenic สายพันธุ์ had the F cleavage site motif 112R-R-R-K-R-F117 (SEQ ID NO:33) while 2 of the lentogenic สายพันธุ์ had the F cleavage

site motif 112G-R-Q-G-R-L117 (SEQ ID NO:34), whilst 1 sequence had the F cleavage site
motif 112G-K-Q-G-R-L117 (SEQ ID NO:35) at the C-terminus of the F2 protein and
ฟีนิลอะลานีน (F) residue at amino acid position 117 of the N-terminus of the Fl protein
(Berhanu et al., Virol J., 7:183, 2010). Phylogenetic analysis revealed that 11 of the Malaysian isolates clustered tightly with the genotype VIId สายพันธุ์, 1 Malaysian isolate grouped together with genotype I and 2 of our isolates grouped with genotype II. Of the 11 Malaysian isolates that grouped to form genotype VIId, 10 (F1, F2, F3, F4, F9, F10, F11, F12, F13, F14) had between
97.9 to 98.7% ความเหมือนกันของลำดับ similarities with other Malaysian isolates responsible for the
Newcastle disease outbreaks in 2004-2005 and 2007 which were previously reported by
researchers from UPM. All these isolates have between 91-92% similarities with the Indonesian สายพันธุ์ (cockatoo/14698/90). One (F8) of the Malaysian isolate which grouped with genotype VIId had 96.1% similarities with the China สายพันธุ์ (Ch/2000). Of the 3 lentogenic สายพันธุ์ isolates from this study, two (F5, F6) had between 97.4-97.5 % นิวคลีโอไทด์ sequence similarities with สายพันธุ์ Lasota, genotype 2 while one isolate (F7) had around 88.8% นิวคลีโอไทด์ sequence
similarities with สายพันธุ์ Ulster/67.
DIVA (Differentiation of Infected versus Vaccine) assay
DIVA assay for all the positive Malaysian isolates showed that they had no relationship with the Avinew or Lasota (รูป 24). The assay was analyzed by using the Gene Scanning software supplied with the instrument. The clustering algorithm of the software allows all
melting curves to be normalized and it subsequently clusters all samples and data that have the same melting signatures.
NDV genotype differentiation by วีวีing (HRM) Curve analysis
The HRM assay to distinguish the NDV genotypes correlated with the gene scanning analysis and amino acid sequence analysis (รูป 25). Similar to the DIVA assay described above, the same Gene Scanning software from Roche was used for analyzing the data. Amino acid sequence analysis of the fusion (F) gene of fourteen Malaysian NDV isolates showed that eleven (11) of the isolates were categorized as velogenic virus and three (3) was lentogenic. The
11 velogenic สายพันธุ์ had the F cleavage site motif 112 R-R-R-K-R-F 117 (SEQ ID NO:33) while
2 of the lentogenic สายพันธุ์ had the F cleavage site motif 112 G-R-Q-G-R-L 117 (SEQ ID NO:34) and 1 sequenc

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ลำดับ การวิเคราะห์กรดอะมิโน Phylogenetic ก่อสร้างชุดรองพื้น (5'-ATG GGCY CCA เกย์ CTT CTA C - 3' (ฟอร์เวิร์ด) (ลำดับ ID ไม่: 17), 5' -CTG CCA CTG CTA GTT GTG ATA ATC C-3' (รีเวิร์ส) (ลำดับ ID ไม่: 18) ใช้สำหรับ มือการฟิวชั่นยีนของไวรัสโรคนิวคาสเซิล โพรโทคอ PCR ก่อตั้งขึ้น ด้วยการปรับเปลี่ยนจากการวิธีอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Berhanu et al., Virol J., 7:183, 2010) เวลาจริงที่ PCR ของผสมs ประกอบด้วยปี่ 10 สีเขียว SYBR หลักการผสม การ PCR และชุดรองพื้นแต่ละชั้นปีน้ำจะทำให้ค่าปริมาตรสุดท้ายของ 20 IA ต่อปฏิกิริยาการ PCR ของผสมs ถูกต้องเวลาจริงขยาย PCR ใน microplate 384-ดีในเครื่องมือ LC480 Real Time PCR (LC 480 โร) ยอดเขาละลายและละลายเส้นโค้งถูกสังเกตโดยซอฟต์แวร์ Quant สัมบูรณ์ที่มีเครื่องมือ ความร้อน มีการตั้งค่าโพรไฟล์ที่: การทำให้เสียสภาพก่อนที่ 95° C เป็นเวลา 3 วินาที ตามรอบของเวลา 1 นาที 45 การทำให้เสียสภาพที่ 95° C, 1 นาทีสำหรับการอบเหนียวที่ 56° C และ 1 นาทีสำหรับ elongation ที่ 72 องศาเซลเซียส ละลายการวิเคราะห์โค้งทำวัด specificity ผลิตภัณฑ์ PCR หลังจาก PCR ในการขี่จักรยาน ตัวอย่างมีอุณหภูมิ 95° C เป็นเวลา 1 สอง และ 65 ° C เป็นเวลา 15 วินาที และอุณหภูมิ 95° C อย่างต่อเนื่องที่อัตราการเปลี่ยนแปลงเชิงเส้นแล้ว วงจรเวลาจริง PCR ถูกเรียกใช้โดยใช้การ LightCycler 480 (Rochee)ชุดพื้นเดียวกันถูกใช้สำหรับการจัดลำดับ ผลิตภัณฑ์ PCR ของที่คาดขนาดแอมพลิคอนที่บริสุทธิ์ โดยใช้ชุดสกัดล้างเจล PCR ตามโพรโทคอของผู้ผลิต ด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย (Analytik Jena, Geimany) ลำดับของยีนโปรตีนฟิวชั่นของ NDV ได้ทำในสิ่งอำนวยความสะดวกการค้าลำดับใช้เทอร์มิเนเตอร์ BigDye v3.1 วงจรลำดับชุด เพื่อยืนยันว่า กรณีทั้งหมดบวกได้จริง ไวรัสโรคนิวคาสเซิล พื้นฐานท้องถิ่นตำแหน่งค้นหาเครื่องมือ (ระเบิด) ค้นหาลำดับที่ทำในฐานข้อมูลของ Genbank แก้ไขลำดับการประกอบทำ โดยการใช้ BioEdit การเทียบเรียงลำดับแก้ไขรุ่น 7.0.5.2 (Tom ฮอลล์ เรา) การเทียบเรียงลำดับs ได้ทำโดย ClustalX ต้น phylogenetic ถูกสร้างโดยระยะห่างตามเพื่อนบ้านที่เข้าร่วมวิธี โดยใช้ซอฟต์แวร์ 5 ร็อค (สถาบัน Biodesign, Tempe, Arizona) และถูกประเมินโดยใช้วิธี bootstrapping ที่คำนวณ 1000 ซ้ำของตำแหน่งที่ ที่ มีสร้างเมตริกซ์ความเหมือนกันของลำดับ BioEdit การเทียบเรียงลำดับแก้ไขรุ่น 7.0.5.2 (Tom ฮอลล์ เรา)วิเคราะห์ DIVA (สร้างความแตกต่างของการติดเชื้อและวัคซีน)ตัวอย่าง NDV บวกถูกต้องวิเคราะห์ DIVA ทดสอบร้องถูกก่อตั้งขึ้นโดยชุดรองพื้น: รองพื้นฟอร์เวิร์ด 5'-CTG CCA CTG CTA GTT กิ๊ก ATA ATC C-3 (ลำดับ ID ไม่: 31 ฉัน = inosine), รองพื้นรีเวิร์ส 5'-CCT TGG TGA ซีททท. CCG IAG G-3 (@E0 DD ไม่: 32 ฉัน = inosine) ที่ขยายเขตไฮเปอร์ตัวแปรของยีนโปรตีนฟิวชั่นของ NDV การวิเคราะห์ประกอบด้วย lOul ของการผสมผสานหลักย้อมฟลูออเรสอิ่มตัวสูง (Roche), 2111 25 มม. MgCl2' 0.50 รองพื้นคู่ แม่แบบ และ PCR เกรดน้ำ ตัวอย่างถูกโหลดลงในจาน microwell 384-ดี และการขยาย PCR ในเวลา areal เครื่อง PCR (LightCycler 480 โร) ปฏิกิริยาการขี่จักรยานที่ความร้อนประกอบด้วยการเริ่มต้นการทำให้เสียสภาพ (3s ที่ 95° C) ขยายที่ประกอบด้วยการทำให้เสียสภาพ (1 มม.ที่ 95° C) การอบเหนียว (1 มม.ที่ 60° C) และส่วนขยาย (1 นาทีที่ 72° C) PCR ได้ถูกตามทันทีสูง reสารละลาย ละลายวิเคราะห์เส้นโค้ง สร้างความแตกต่างของการจริง NDV ไวรัสที่แยกได้เมื่อเทียบกับสายพันธุ์วัคซีนสำเร็จ โดยใช้ค่าวัคซีนควบคุมบวก และเปรียบเทียบลายเซ็นเส้นโค้งของพวกเขาละลายสร้างความแตกต่างลักษณะทางพันธุกรรม NDV โดยวิเคราะห์เส้นโค้ง วีวีing (HRM)ตัวอย่าง NDV บวกถูกต้องวิเคราะห์ HRM ถูกทดสอบ HRMก่อตั้งขึ้น โดยใช้ชุดสีรองพื้น (ลำดับ ID ไม่: 17 และลำดับ ID ไม่: 18) ที่ขยายการฟิวชั่นยีนของ NDV การวิเคราะห์ประกอบด้วย 10111 ย้อมฟลูออเรสอิ่มตัวสูงหลักผสม (Roche), 20 25 มม. MgCl2, 0.50 รองพื้นคู่ แม่แบบ และ PCR ชั้นน้ำ ตัวอย่างถูกโหลดลงในจาน microwell 384-ดี และอยู่ภายใต้การขยาย PCR ในเครื่อง PCR เรียลไทม์ (LightCycler 480 โร) ปฏิกิริยาการขี่จักรยานที่ความร้อนประกอบด้วยการทำให้เสียสภาพการเริ่มต้น (3s ที่ 95° C) ขยายที่ประกอบด้วยการทำให้เสียสภาพ (1 มม.ที่ 95° C) การอบเหนียว (1 มม.ที่ 60° C) และส่วนขยาย (1 มม.ที่ 72° C) PCR ถูกทันทีตาม ด้วยการวิเคราะห์เส้นโค้ง วีวีing สร้างความแตกต่างของ NDV ที่สำเร็จ โดยใช้รู้จักบวก NDV ศึกษาจีโนไทป์เป็นบวกควบคุม และเปรียบเทียบลายเซ็นเส้นโค้งของพวกเขาละลาย ทำการยืนยันการวิเคราะห์ โดยจัดลำดับแยก NDV บวกการตรวจสอบตรวจสอบโดยทั่วไปตามมาตรฐาน ISO 17025 และ MIQE (ข้อมูลขั้นต่ำสำหรับพิมพ์การทดลองเชิงปริมาณเรียลไทม์ PCR มีพารามิเตอร์ 8 (วิเคราะห์ความไว specificity ทำซ้ำใน กู้คืน reproducibility, ruggedness/เสถียรภาพ และ ความบริสุทธิ์/ความเข้มข้น) ที่ควรจะทดสอบ เมื่อเสร็จสิ้นการพัฒนา assays การตรวจสอบโพรโทคอลที่เรียบง่ายถูกดำเนินการแยกแยะระดับความสำคัญวิเคราะห์ specificity และยืนยัน โดยการวิเคราะห์ลำดับและกรดอะมิโนวิเคราะห์ความไวจุดมุ่งหมายของการศึกษาคือการ กำหนดขีดจำกัด ของการตรวจสอบ (ลอด) / ต่ำสุดของตัวแทนเป้าหมายของดอกเบี้ยที่สามารถตรวจจับ ความเข้มข้นทั้งหมดของเอกสารอ้างอิงถูกวัด โดยใช้เครื่องทดสอบกรดด่างมี UV ความเข้มข้นได้มาตรฐานการ 10pg/บริษัท การเลือกเจือจาง (เจือจางประจำ ten-fold) ถูกใช้จนกว่าการทดสอบไม่สามารถตรวจพบสิ่งมีชีวิตเป้าหมาย (ไม่ตรวจจับสัญญาณ)Specificityจุดมุ่งหมายของการศึกษาจะประเมิน specificity ของวิเคราะห์สืบแทนเป้าหมายที่น่าสนใจในต่อหน้าของตัวแทนอื่นติดเชื้อ Specificity ของการทดสอบที่ดำเนินการ โดยทดสอบโพรโทคอลกับ 5 อื่น ๆ สิ่งมีชีวิต (ไวรัสหลอดลมอักเสบติดเชื้อ ติดเชื้อเบอร์ซ่าอักเสบติดต่อ โรคไวรัส Mycoplasma synoviae, Mycoplasma gallisepticum, pneumovirus นก) ผ่านพารามิเตอร์นี้ การวิเคราะห์ควรผลิตตรวจสอบสัญญาณเดียวกัน (ละลายพีคส์) หรือควรผลิตสัญญาณตรวจจับใด ๆ สำหรับสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ วิธีการควรระบุพอตรวจเฉพาะแทนเป้าหมายน่าสนใจแม้ในต่อหน้าของพืชอื่น ๆจัดลำดับและกรดอะมิโนลำดับวิเคราะห์พารามิเตอร์ถูกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ข้างต้นผลลัพธ์สุ่มตัวอย่างตัวอย่างจากฟาร์มทั้งหมด 14 พบต้องเป็นค่าบวกสำหรับ NDVลำดับ การวิเคราะห์กรดอะมิโน Phylogenetic ก่อสร้างระเบิด วิเคราะห์พบว่า ตัวอย่างลำดับทั้งหมดมีจริง NDV กรณีเมื่อเปรียบเทียบกับลำดับอื่น ๆ ใน Genbank การวิเคราะห์หาลำดับกรดอะมิโนของยีนฟิวชั่น (F) ของโฟร์ทีนอะเกน NDV มาเลเซียที่แยกได้พบว่าที่นี่ (11) ของแยกได้ถูกจัดประเภทเป็น velogenic ไวรัสและสาม (3) lentogenic สายพันธุ์ 11 velogenic ได้ F ปริไซต์แปลน 112R-R-R-K-R-F117 (ลำดับ ID ไม่: 33) ในขณะที่ปริ F มี 2 lentogenic สายพันธุ์เว็บไซต์แปลน 112G-R-Q-G-R-L117 (ลำดับ ID ไม่: 34), ในขณะที่ลำดับ 1 มีไซต์ปริ F แปลน 112G-K-Q-G-R-L117 (ลำดับ ID ไม่: 35) ที่นัส C โปรตีน F2 และ ฟีนิลอะลานีน (F) สารตกค้างที่กรดอะมิโนตำแหน่งที่ 117 ของ N-นัสโปรตีน Fl (Berhanu et al., Virol J., 7:183, 2010) วิเคราะห์ phylogenetic เปิดเผยว่า 11 ของแยกมาเลเซียจับกลุ่มแน่น มีลักษณะทางพันธุกรรม VIId สายพันธุ์ 1 มาเลเซียแยกจัดกลุ่มร่วมกับลักษณะทางพันธุกรรมผมและ 2 ของเราแยกจัดกลุ่มมีลักษณะทางพันธุกรรมที่สอง ของ 11 มาเลเซียแยกที่จัดกลุ่มในลักษณะทางพันธุกรรมแบบฟอร์ม VIId, 10 (F1, F2, F3, F4, F9, F10, F11, F12, F13, F14) ได้ระหว่าง97.9 ถึง 98.7% ความเหมือนกันของลำดับความคล้ายคลึงกับมาเลเซียอื่น ๆ แยกรับผิดชอบการแพร่ระบาดของโรคนิวคาสเซิลในปี 2004-2005 และ 2007 ที่มีรายงานก่อนหน้านี้โดยresearchers from UPM. All these isolates have between 91-92% similarities with the Indonesian สายพันธุ์ (cockatoo/14698/90). One (F8) of the Malaysian isolate which grouped with genotype VIId had 96.1% similarities with the China สายพันธุ์ (Ch/2000). Of the 3 lentogenic สายพันธุ์ isolates from this study, two (F5, F6) had between 97.4-97.5 % นิวคลีโอไทด์ sequence similarities with สายพันธุ์ Lasota, genotype 2 while one isolate (F7) had around 88.8% นิวคลีโอไทด์ sequence similarities with สายพันธุ์ Ulster/67.DIVA (Differentiation of Infected versus Vaccine) assayDIVA assay for all the positive Malaysian isolates showed that they had no relationship with the Avinew or Lasota (รูป 24). The assay was analyzed by using the Gene Scanning software supplied with the instrument. The clustering algorithm of the software allows all melting curves to be normalized and it subsequently clusters all samples and data that have the same melting signatures.NDV genotype differentiation by วีวีing (HRM) Curve analysisThe HRM assay to distinguish the NDV genotypes correlated with the gene scanning analysis and amino acid sequence analysis (รูป 25). Similar to the DIVA assay described above, the same Gene Scanning software from Roche was used for analyzing the data. Amino acid sequence analysis of the fusion (F) gene of fourteen Malaysian NDV isolates showed that eleven (11) of the isolates were categorized as velogenic virus and three (3) was lentogenic. The11 velogenic สายพันธุ์ had the F cleavage site motif 112 R-R-R-K-R-F 117 (SEQ ID NO:33) while2 of the lentogenic สายพันธุ์ had the F cleavage site motif 112 G-R-Q-G-R-L 117 (SEQ ID NO:34) and 1 sequenc

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ลำดับกรดอะมิโนวิเคราะห์ลำดับวิวัฒนาการก่อสร้าง
รองพื้นชุด (5'-ATG GGCY CCA GAY CTT CTA C-3 '(ฟอร์เวิร์ด) (SEQ ID NO: 17) 5'-
CTG CCA CTG CTA GTT GTG ATA ATC C-3 (รีเวิร์ส) (ID SEQ NO: 18) ถูกนำมาใช้สำหรับการ
ขยายยีนโปรตีนฟิวชั่นของนิวคาสเซิโรคไวรัสโปรโตคอล PCR ถูก.
จัดตั้งขึ้นโดยมีการปรับเปลี่ยนจากวิธีอธิบายไว้ก่อนหน้า (Berhanu, et al, เจ Virol 7. :. 183, 2010) เวลาจริง PCR ของผสม s ประกอบด้วย 10 ปี่ของ SYBR ผสมต้นแบบสีเขียว
ชุดไพรเมอร์ที่เกี่ยวข้องและน้ำเกรด PCR เพื่อให้ได้ปริมาณสุดท้ายของ 20 IA ต่อปฏิกิริยา PCR ของผสม s ถูกยัดเยียด. เวลาขยาย PCR จริงใน microplate 384 ดีในเครื่องมือแบบ Real Time PCR LC480 (LC 480, Roche). ยอดเขาละลายและเส้นโค้งละลายถูกตั้งข้อสังเกตโดยใช้แอ็บโซลูควอนท์ซอฟแวร์ให้กับเครื่องดนตรี. ความร้อน
รายละเอียดเป็นที่ตั้ง : ก่อนการทำให้เสียสภาพที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 วินาทีตามด้วย 45 รอบ 1 นาที
การทำให้เสียสภาพที่ 95 องศาเซลเซียส 1 นาทีสำหรับการอบที่ 56 องศาเซลเซียสและ 1 นาทีสำหรับการยืดตัวที่ 72 องศาเซลเซียส
การวิเคราะห์โค้งละลายได้ดำเนินการในการวัดความจำเพาะของผลิตภัณฑ์ PCR หลังจากที่การขี่จักรยาน PCR ตัวอย่างถูกความร้อนถึง 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 วินาทีและ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 วินาทีและจากนั้นความร้อนถึง 95 องศาเซลเซียสต่อเนื่องในอัตราการเปลี่ยนแปลงเชิงเส้น รอบเวลา PCR จริงก็วิ่งใช้
LightCycler 480 (Rochee).
ชุดเดียวกันไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการจัดลำดับ ผลิตภัณฑ์ PCR ของที่คาดว่า
แอมพลิคอนขนาดบริสุทธิ์โดยใช้วิธี PCR สะอาดขึ้นชุดเจลสกัดตาม
โปรโตคอลของผู้ผลิตมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย (Analytik เจ Geimany) ลำดับของยีนโปรตีนฟิวชั่นของ NDV ได้ทำในสิ่งอำนวยความสะดวกทางการค้าโดยใช้ลำดับ Terminator BigDye v3.1 ชุดลำดับวงจร เพื่อที่จะยืนยันว่ากรณีบวกทั้งหมดเป็นจริง
โรคไวรัสนิวคาสเซิจัดท้องถิ่นพื้นฐานเครื่องมือค้นหา (ระเบิด) การค้นหาลำดับที่ได้กระทำในฐานข้อมูล Genbank แก้ไขลำดับและการชุมนุมได้ทำโดยใช้
BioEdit การเทียบเรียงลำดับบรรณาธิการรุ่น 7.0.5.2 (ทอมฮอลล์สหรัฐ) การเทียบเรียงลำดับของถูกทำได้โดยใช้ ClustalX phylogenetic ต้นไม้ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ระยะทางที่ใช้วิธีการเข้าร่วมเพื่อนบ้านโดยใช้ซอฟแวร์ 5 ล้าน (Biodesign สถาบันเทมแอริโซนา) และการประเมินโดยใช้วิธีคำนวณร่วมมือ 1000 ซ้ำของการจัดตำแหน่ง ความเหมือนกันของลำดับเมทริกซ์ได้รับการสร้างขึ้นด้วย BioEdit การเทียบเรียงลำดับรุ่นแก้ไข 7.0.5.2 (ทอมฮอลล์สหรัฐ). DIVA (ความแตกต่างของการติดเชื้อเมื่อเทียบกับวัคซีน) ทดสอบบวกตัวอย่าง NDV ถูกยัดเยียดให้ทดสอบ DIVA ทดสอบ DIVA ได้รับการจัดตั้งขึ้นโดยใช้ชุดไพรเมอร์: ไพรเมอร์ฟอร์เวิร์ด 5'-CTG CCA CTG CTA GTT GIG ATA ATC C-3 '(SEQ ID NO: 31, I = inosine) รีเวิร์สไพรเมอร์ 5'-CCT TGG TGA ITC ททท CCG บริษัท ไอเอจี G-3 '(@ E0 DD NO: 32, I = inosine) ที่ขยายพื้นที่มากเกินไปตัวแปรของยีนโปรตีนฟิวชั่นของ NDV ทดสอบประกอบด้วย lOul ของความอิ่มตัวสูงต้นแบบผสมสีย้อมเรืองแสง (Roche) 2111 ของ 25mm MgCl2 '0.50 ของคู่ไพรเมอร์, แม่แบบและน้ำเกรด PCR กลุ่มตัวอย่างที่ถูกโหลดลงในแผ่น microwell 384 ดีและอยู่ภายใต้การขยาย PCR ในเวลาขนหัวลุกเครื่อง PCR (LightCycler 480, Roche) ปฏิกิริยาความร้อนประกอบด้วยเริ่มต้นการทำให้เสียสภาพ (3s ที่ 95 ° C) ขยายประกอบด้วยการทำให้เสียสภาพ (1 มิลลิที่ 95 ° C) การหลอม (1 มิลลิที่ 60 ° C) และการขยาย (1 นาทีที่ 72 ° C) PCR ตามมาทันทีโดยสูงอีกครั้งสารละลายวิเคราะห์โค้งละลาย ความแตกต่างของความจริงไวรัส NDV แยกเมื่อเทียบกับวัคซีนสายพันธุ์ก็ประสบความสำเร็จโดยใช้วัคซีนควบคุมบวกและเปรียบเทียบลายเซ็นของพวกเขาโค้งละลาย. NDV ความแตกต่างของยีนโดยวีวีไอเอ็นจี (HRM) การวิเคราะห์โค้งบวกตัวอย่าง NDV ถูกยัดเยียดให้ทดสอบการบริหารทรัพยากรมนุษย์ ทดสอบการบริหารทรัพยากรมนุษย์ได้รับการจัดตั้งขึ้นโดยใช้ชุดไพรเมอร์ (SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18) ที่ขยายฟิวชั่นของยีนโปรตีน NDV ทดสอบประกอบด้วย 10111 ของความอิ่มตัวสูงต้นแบบผสมสีย้อมเรืองแสง (Roche) 20 ของ MgCl2 25mm, 0.50 ของคู่ไพรเมอร์, แม่แบบและน้ำเกรด PCR ตัวอย่างที่ถูกโหลดลงในแผ่น microwell 384 ดีและอยู่ภายใต้การขยาย PCR ในเรียลไทม์เครื่อง PCR (LightCycler 480, Roche) ปฏิกิริยาความร้อนประกอบด้วยการเริ่มต้นทำให้เสียสภาพ (3s ที่ 95 ° C) ขยายประกอบด้วยการทำให้เสียสภาพ (1 มิลลิที่ 95 ° C) การหลอม (1 มิลลิที่ 60 ° C) และการขยาย (1 มิลลิที่ 72 ° C) PCR ตามมาทันทีโดยไอเอ็นจีวีวีวิเคราะห์เส้นโค้ง ความแตกต่างของยีน NDV ก็ประสบความสำเร็จโดยใช้ยีน NDV ที่รู้จักกันในเชิงบวกเป็นตัวควบคุมในเชิงบวกและการเปรียบเทียบลายเซ็นโค้งละลายของพวกเขา ยืนยันการทดสอบทำโดยลำดับบวก NDV แยก. ตรวจสอบการตรวจสอบโดยทั่วไปขึ้นอยู่กับมาตรฐาน ISO 17025 และ MIQE (ข้อมูลขั้นต่ำสำหรับการเผยแพร่ปริมาณเรียลไทม์พีซีอาทดลองมี 8 พารามิเตอร์ (ไววิเคราะห์จำเพาะการทำซ้ำ, การกู้คืนการทำซ้ำ , ความทนทานแข็งแรง / และความบริสุทธิ์ / ความเข้มข้น) ที่ควรจะทดสอบ. เมื่อเสร็จสิ้นการพัฒนาชุดตรวจ, การตรวจสอบที่เรียบง่ายของโปรโตคอลได้ดำเนินการที่จะแยกแยะวิเคราะห์ความไวของมันที่เฉพาะเจาะจงและการยืนยันโดยลำดับและอะมิโนกรดวิเคราะห์ลำดับ. วิเคราะห์ ไววัตถุประสงค์ของการศึกษาคือการกำหนดขีด จำกัด ของการตรวจสอบ (LOD) / ความเข้มข้นต่ำสุดของตัวแทนเป้าหมายที่น่าสนใจที่สามารถตรวจพบ. ความเข้มข้นของวัสดุอ้างอิงทั้งหมดถูกวัดโดยใช้ Spectrophotometer UV. ความเข้มข้นได้รับการมาตรฐานเพื่อ 10pg / PTL . เจือจางจุดสิ้นสุด (สิบเท่าเจือจางอนุกรม) ถูกนำมาใช้จนการทดสอบไม่สามารถตรวจสอบสิ่งมีชีวิตเป้าหมาย (ไม่มีสัญญาณการตรวจสอบ). ความจำเพาะวัตถุประสงค์ของการศึกษาคือการประเมินความจำเพาะของการทดสอบการตรวจสอบตัวแทนเป้าหมาย ที่น่าสนใจในการปรากฏตัวของการติดเชื้ออื่น ๆ ความจำเพาะของการทดสอบได้ดำเนินการโดยการทดสอบกับโปรโตคอล 5 มีชีวิตอื่น ๆ (หลอดลมอักเสบติดเชื้อไวรัสติดเชื้อ Bursal โรคไวรัส Mycoplasma synoviae, Mycoplasma gallisepticum, นก pneumovirus) ที่จะผ่านพารามิเตอร์นี้ทดสอบไม่ควรผลิตการตรวจสอบสัญญาณเดียวกัน (ยอดเขาละลาย) หรือไม่ควรผลิตสัญญาณการตรวจสอบใด ๆ สำหรับการมีชีวิตอื่น ๆ วิธีที่ควรจะเป็นที่เฉพาะเจาะจงมากพอที่จะตรวจสอบเพียงตัวแทนเป้าหมายที่น่าสนใจแม้ในการปรากฏตัวของพืชอื่น ๆ . ลำดับและกรดอะมิโนวิเคราะห์ลำดับ. พารามิเตอร์ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ข้างต้น. ผลการเก็บตัวอย่างตัวอย่างจากทั้งหมด 14 ฟาร์มพบว่ามีผลบวกต่อ NDV. ลำดับ, กรดอะมิโนวิเคราะห์ลำดับก่อสร้างวิวัฒนาการการวิเคราะห์แสดงให้เห็นว่าระเบิดทั้งหมดลำดับกลุ่มตัวอย่างเป็นกรณี NDV จริงเมื่อเทียบกับคนอื่น ๆ ในลำดับ Genbank อะมิโนกรดวิเคราะห์ลำดับของฟิวชั่น (F) ยีนสิบสี่แยกมาเลเซีย NDV แสดงให้เห็นว่าสิบเอ็ด (11) ของสายพันธุ์แบ่งเป็นไวรัส velogenic และสาม (3) เป็น lentogenic velogenic 11 สายพันธุ์มีบรรทัดฐานเว็บไซต์แตกแยก F-112R-F117 RRKR (SEQ ID NO: 33) ในขณะที่ 2 ของ lentogenic สายพันธุ์มีความแตกแยก F บรรทัดฐานเว็บไซต์ 112g-RQGR-L117 (SEQ ID NO: 34) ในขณะที่ ลำดับที่ 1 มีความแตกแยกเว็บไซต์ F บรรทัดฐาน 112g-KQGR-L117 (SEQ ID NO: 35) ที่ C-ปลายทางของโปรตีน F2 และฟีนิลอะลานีน (F) สารตกค้างที่ตำแหน่งกรดอะมิโน 117 ของ N-ปลายทาง ของโปรตีนชั้น(Berhanu, et al, Virol เจ, 7:. 183, 2010) การวิเคราะห์วิวัฒนาการเปิดเผยว่า 11 สายพันธุ์มาเลเซียคลัสเตอร์แน่นด้วยจีโนไทป์ VIId สายพันธุ์ 1 แยกมาเลเซียรวมกลุ่มกันกับฉันจีโนไทป์และ 2 ของสายพันธุ์ของเราจัดกลุ่มกับจีโนไทป์ครั้งที่สอง 11 สายพันธุ์มาเลเซียที่จัดกลุ่มในรูปแบบจีโนไทป์ VIId 10 (F1, F2, F3, F4, F9, F10, F11, F12, F13, F14) ได้ระหว่าง97.9-98.7% ความเหมือนกันของลำดับความคล้ายคลึงกันกับสายพันธุ์อื่น ๆ ที่มาเลเซีย รับผิดชอบในการระบาดของโรคนิวคาสเซิใน 2004-2005 และ 2007 ซึ่งได้รับรายงานก่อนหน้านี้โดยนักวิจัยจาก UPM สายพันธุ์เหล่านี้มีระหว่าง 91-92% ความคล้ายคลึงกันกับสายพันธุ์อินโดนีเซีย (นกกระตั้ว / 14698/90) หนึ่ง (F8) ของมาเลเซียซึ่งแยกกลุ่มกับจีโนไทป์ VIId มีความคล้ายคลึงกัน 96.1% โดยมีประเทศจีนสายพันธุ์ (ch / 2000) 3 lentogenic สายพันธุ์ที่แยกได้จากการศึกษาครั้งนี้สอง (F5, F6) มีระหว่าง 97.4-97.5% นิวคลีโอไทด์ที่มีความคล้ายคลึงกันตามลำดับสายพันธุ์ Lasota, จีโนไทป์ 2 ในขณะที่หนึ่งแยก (F7) มีรอบ 88.8% นิว คลีโอไทด์ลำดับความคล้ายคลึงกันกับสายพันธุ์คลุม / 67. DIVA (ความแตกต่างของการติดเชื้อเมื่อเทียบกับวัคซีน) ทดสอบทดสอบ DIVA สำหรับทุกสายพันธุ์มาเลเซียบวกแสดงให้เห็นว่าพวกเขาไม่มีความสัมพันธ์กับ Avinew หรือ Lasota (รูป 24) การทดสอบที่ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟแวร์สแกนยีนที่มาพร้อมกับเครื่อง ขั้นตอนวิธีการจัดกลุ่มของซอฟต์แวร์ที่จะช่วยให้ทุกโค้งหลอมให้เป็นปกติและต่อมากลุ่มที่ตัวอย่างและข้อมูลทั้งหมดที่มีลายเซ็นหลอมเดียวกัน. NDV ความแตกต่างของยีนโดยวีวีไอเอ็นจี (HRM) การวิเคราะห์ Curve ทดสอบการบริหารทรัพยากรมนุษย์ที่จะแยกแยะยีน NDV มีความสัมพันธ์กับ การวิเคราะห์การสแกนของยีนและการวิเคราะห์ลำดับอะมิโนกรด (รูป 25) คล้ายกับการทดสอบ DIVA ที่อธิบายข้างต้นยีนเดียวกันซอฟต์แวร์การสแกนจาก Roche ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูล อะมิโนกรดวิเคราะห์ลำดับของฟิวชั่น (F) ยีนสิบสี่แยกมาเลเซีย NDV แสดงให้เห็นว่าสิบเอ็ด (11) ของสายพันธุ์แบ่งเป็นไวรัส velogenic และสาม (3) เป็น lentogenic velogenic 11 สายพันธุ์มีบรรทัดฐานเว็บไซต์แตกแยก F 112 RRRKRF 117 (SEQ ID NO: 33) ในขณะที่ 2 ของ lentogenic สายพันธุ์มีบรรทัดฐานเว็บไซต์แตกแยก F 112 GRQGRL 117 (SEQ ID NO: 34) และ 1 sequenc

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ลำดับ การวิเคราะห์ลำดับกรดอะมิโน ซึ่งการก่อสร้าง
ชุดไพรเมอร์ ( 5 ' - ATG ggcy CCA Gay ซีทีที CTA c-3 ' ( ฟอร์เวิร์ด ) ( seq id : 17 ) , 5 ' -
CTG CCA CTG CTA gtt GTG ATA ATC c-3 ' ( รีเวิร์ส ) ( seq id : 18 ) ใช้สำหรับ
amplifying ส่วนของโปรตีนยีนของ นิวคาสเซิล โรคไวรัส pcr protocol คือ
ก่อตั้งขึ้นด้วยการปรับเปลี่ยนจากวิธีอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( berhanu et al . , virol เจ 7:183 , 2010 ) เวลาจริงของ PCR ของผสมจำนวน 10 ปี่ของ SYBR กรีนมาสเตอร์ผสม
ชุดรองพื้นและน้ำซึ่งแต่ละเกรดให้ขึ้นปริมาตรสุดท้ายของ 20 IA ต่อปฏิกิริยาร่วมของผสม S ถูกเวลาจริงสามารถขยายในพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย lc480 384 ได้ดีในเวลาจริง ) เครื่องดนตรี ( LC 480 , โรช ) การหลอมละลายจากยอดเขาและเส้นโค้งโดยใช้แบบจํานวนซอฟต์แวร์ให้กับเครื่องดนตรี ความร้อน
โปรไฟล์ไว้ที่ : pre - การทำให้เสียสภาพที่ 95 องศา C เป็นเวลาวินาที 3 ,ตามด้วย 45 รอบการทำให้เสียสภาพ 1 นาที
ที่ 95 องศา C , 1 นาทีที่ 56 ° C สำหรับการอบและ 1 นาทีที่ 72 ° C .
ยืดตัวจุดหลอมเหลวการวิเคราะห์เส้นโค้งแสดงการวัดความจำเพาะของผลิตภัณฑ์ PCR หลังจากการขี่จักรยาน PCR ,ร้อนถึง 95 องศา C จำนวนเป็นเวลา 1 วินาทีและวินาที 65 ° C เป็นเวลา 15 แล้ว ร้อนถึง 95 องศา C อย่างต่อเนื่องที่อัตราการเปลี่ยนแปลงเชิงเส้น ในเวลาจริงโดยรอบถูกเรียกใช้
lightcycler 480 ( rochee ) .
ชุดเดียวกันถูกใช้รองพื้นของ pcr ผลิตภัณฑ์ของคาด
แอมพลิคอนขนาดได้ทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ PCR ทำความสะอาดเจลสกัดจากผู้ผลิตชุด
ขั้นตอนกับการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ( ANALYTIK JENA geimany , ) ลำดับของส่วนของโปรตีนยีนของ ndv นั้นเป็นไปตามลำดับสถานที่เชิงพาณิชย์โดยใช้ bigdye Terminator v3.1 ลำดับรอบชุด เพื่อยืนยันว่า กรณีที่เป็นบวกจริง
ไวรัสโรคนิวคาสเซิล , เครื่องมือค้นหาการปรับพื้นฐานท้องถิ่น ( ระเบิด ) การค้นหาของลำดับ ได้ขนาดของฐานข้อมูล ลำดับการแก้ไขและประกอบเสร็จ ใช้
bioedit การเทียบเรียงลำดับบรรณาธิการรุ่น 7.0.5.2 ( ทอม ฮอล เรา ) การเทียบเรียงลำดับ 2


ทำได้โดยการใช้ clustalx . ต้นไม้ซึ่งถูกสร้างโดยใช้ระยะทางจาก
เพื่อนบ้านร่วมวิธีโดยใช้ซอฟต์แวร์ใหญ่ 5 ( สถาบันเทมแอริโซนา biodesign ) และประเมินการใช้วิธี bootstrapping คำนวณ 1000 ซ้ำของแนว
ความเหมือนกันของลำดับเมทริกซ์ถูกสร้างขึ้นด้วย bioedit การเทียบเรียงลำดับบรรณาธิการรุ่น 7.0.5.2 ( ทอม ฮอล เรา ) .
ทิวา ( ความแตกต่างของไวรัสและวัคซีน
) การทดสอบตัวอย่าง ndv บวกถูกดีว่า ตามลำดับ ดีว่า assay คือ
ก่อตั้งขึ้นโดยการใช้ชุดหลัก : ฟอร์เวิร์ด primer 5 ' - CTG CCA CTG CTA gtt กิ๊ก ATA ATC c-3 ' ( seq id : 31 = อินโน ) รีเวิร์ส primer 5 ' - CCT tgg TGA ITC ตาด ccg เอจี ( @ 3 ' E0 DD : 32 = อินโน ) ที่ขยายขอบเขตของไฮเปอร์ ตัวแปรของโปรตีนยีนของ ndv .( ประกอบด้วย loul ของไขมันอิ่มตัวสูงเรืองแสงย้อมต้นแบบผสม ( ยา ) , 2111 25mm MgCl2 ' 0.50 ของไพรเมอร์คู่ แม่แบบและน้ำเกรด PCR จำนวนโหลดลงเครื่องก็ microwell จาน และต้องสามารถขยายในเครื่อง PCR เวลาเทค ( lightcycler 480 , โรช ) ความร้อนปฏิกิริยาเริ่มต้น
) จักรยานการทำให้เสียสภาพ ( 3s ที่ 95 องศา C ) โดยการเพิ่มจำนวนการทำให้เสียสภาพ ( 1 มม. ที่ 95 องศา C ) อบ 1 มม. ที่ 60 ° C ) และนามสกุล ( 1 นาทีที่ 72 ° C ) pcr ได้ทันทีตามด้วยสูง
Re สารละลายจุดหลอมเหลวการวิเคราะห์เส้นโค้ง