2. Materials and methods2.1. Meltin

2. Materials and methods
2.1. Melting points, optical rotation
Melting points were measured on a capillary instrument (Büchi,
CH) and are uncorrected. Optical rotations were measured in a 1 dm
cell on a Perkin Elmer 321 spectropolarimeter (GB).
2.2. NMR
In Prague (Inst. Microbiol.) NMR spectra were recorded with
a Bruker Avance III 400 MHz spectrometer (400.13 MHz for 1H,
100.55 MHz for 13C at 30 ◦C), a Bruker Avance III 600 MHz spectrometer
(600.23 MHz for 1H, 150.93 MHz for 13C at 30 ◦C) and a Bruker
Avance III 700 MHz spectrometer (700.13 MHz for 1H, 176.05 MHz
for 13C at 30 ◦C) in DMSO-d6 (99.9 atom% D, Sigma-Aldrich). Residual
signals of the solvent were used as an internal standard (H
2.500 ppm, C 39.60 ppm). NMR experiments: 1H NMR, 13C NMR, Jresolved,
COSY, HSQC, HSQC-TOCSY, HMBC, and 1D TOCSY were
performed using the manufacturer’s software. 1H NMR and 13C
NMR spectra were zero-filled to fourfold data points and multiplied
by a window function before Fourier transformation. A
two-parameter double-exponential Lorentz–Gauss function was
applied for 1H to improve resolution, and line broadening (1 Hz)
C. Charrier et al. / Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 102 (2014) 167–173 169
was used to obtain a better 13C signal-to-noise ratio. Chemical shifts
are given on a -scale with digital resolution justifying the reported
values.
In Paris (Univ. Descartes) 1H- and 13C-NMR spectra (500.13 MHz
and 125.77 MHz, respectively) were recorded on a Bruker Avance-
500 spectrometer in DMSO-d6 or acetone-d6 solvents. All NMR
spectra were measured at 20 ◦C, and proton and carbon chemical
shifts were referenced to the solvent signals: 2.50 ppm for
proton and 39.52 ppm for carbon in DMSO-d6, and 2.05 ppm for
proton and 29.85 ppm for carbon in (CD3)2CO. Two-dimensional
correlation spectroscopy (COSY) and total correlation spectroscopy
(TOCSY), rotating frame nuclear Overhauser effect spectroscopy
(ROESY), heteronuclear single quantum coherence (HSQC), and heteronuclear
multiple bond correlation (HMBC) experiments were
performed using standard pulse sequences. Proton chemical shift
assignments were obtained by the analysis of COSY and TOCSY
spectra and carbon chemical shift assignments were made by the
analysis of HSQC and HMBC spectra. For reference, a complete proton
and carbon peak assignment of the NMR spectra was made on
the parent compounds.
2.3. MALDI-TOF/TOF
MALDI–MS spectra were measured on a MALDI-TOF/TOF
ultraFLEX III mass spectrometer (Bruker-Daltonics, Bremen, DE).
Positive/negative spectra were calibrated externally using the
monoisotopic [M + H]+ or [M − H]− ions of PepMixII calibrant
(Bruker-Daltonics). -Cyano-4-hydroxycinnamic acid (5 mg/mL)
in 50% CH3CN/0.1% TFA was used as a MALDI matrix. A 0.4 L
of sample dissolved in MeCN was premixed with 0.5 L of the
matrix solution on the target and allowed to dry at ambient
temperature. The MALDI-TOF spectra were collected in reflectron
mode. The exact masses were measured using LTQ Orbitrap XL
hybrid mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
USA) equipped with an electrospray ion source. The mobile phase
consisted of methanol/water (4:1), flow rate 30 L/min and the
samples were injected using a 2-L loop. Spray voltage, capillary
voltage, tube lens voltage and capillary temperature were
4.5 kV, −40 V, −120 V and 275 ◦C, respectively. The mass spectra
were internally calibrated using deprotonated stearic acid as lock
mass.
2.4. HPLC
Analytical chromatography was carried out on the Shimadzu
Prominence UFLC system (Kyoto, JP) consisting of a DGU-20A
mobile phase degasser, two LC-20AD solvent delivery units, a
SIL-20ACHT cooling autosampler, a CTO-10AS column oven and
SPD-M20A diode array detector. The Chromolith Performance RP-
18e monolithic column (100 × 3 mm i.d., Merck, Darmstadt, DE)
coupled with a guard column (5 × 4.6 mm) (Merck, DE) was used
in all analyses. The PDA data were acquired in the 200–450 nm
range and the 285 nm signal was extracted. Binary gradient elution:
mobile phase A (CH3CN/H2O/HCOOH (10/90/0.1; v/v/v);
mobile phase B (CH3CN/H2O/HCOOH (90/10//0.1; v/v/v)); gradient,
0–1.5 min, 100% A; 1.5–15 min, 0–100% B; 16–16.5 min, 100–0%
B. Flow rate was 1 mL/min at 25 ◦C. All samples were dissolved in
water.
The separation and quantification of glucuronide metabolites
was carried out using an Agilent model 1100 liquid chromatograph
interfaced with UV and MS detection. Separations were
performed at 40 ◦C on Nucleodur (Macherey-Nagel) C18 columns
(5 m, 4 × 70 mm for preliminary separations and 3 × 250 mm for
final measurements), using a similar water-acetonitrile gradient,
containing 0.1% formic acid (0.5 mL/min). Detection was carried
out with an Agilent DAD detector (200–400 nm) and a Quatro
Micromass spectrometer (Waters) operated in negative mode from
150 to 900 D.
2.5. Cultivation of microorganism
The Streptomyces sp. strain M52104, isolated from soil (for the
full details of the strain used see [22–24]), was maintained on
ISP medium 2 agar (Difco) slants at 25–28 ◦C. Liquid medium for
cultures contained 2% D-(+)-glucose, 0.5% yeast extract (Difco),
0.5% soytone (Difco), 0.5% NaCl, 0.5% K2HPO4 in deionized water,
adjusted to pH 7 with HCl solution. Media were sterilized by autoclaving
at 121 ◦C for 20 min. Precultures of 50 mL were inoculated
with four drops of a bacterial cell suspension and incubated 72 h at
27 ◦C in the orbital shaker (200 rpm). Each preculture was used to
inoculate 1 L cultures, which were incubated at 27 ◦C (200 rpm) for
72 h.
2.6. Preparative syntheses and isolation of products
Streptomyces sp. M52104 was grown at 27 ◦C with orbital shaking
(200 rpm) in 1L-conical flasks containing 250 mL-volume of
liquid medium during 72 h. Silybin substrates were added to the
culture (0.1 g/L final concentration) and incubations were continued
for 96 h and monitored by HPLC/UV/MS. The cells were
removed by filtration on GF/A filter (Whatman) with celite filter
aid, and the filtrate treated with Amberlite XAD-16. The
resin was repeatedly washed with water and then the glucuronides
were eluted with ethanol. After evaporation in vacuo
to a small volume, the eluate residue was solubilized in a minimal
volume of acetonitrile and submitted to successive injections
(0.5–2 mL) on a semi-preparative Nucleodur (Macherey-Nagel)
C18 column (10 m, 32 × 250 mm) using a water-acetonitrile
gradient, containing 0.1% formic acid (40 mL/min) and detection
at 280 nm. Collected fractions were evaluated for purity by
HPLC/UV/MS and those fractions that contained sufficient quantity
and purity of the glucuronides of interest were pooled, evaporated
and lyophilized. Final purity (in the 80–100% range) was
estimated from analytical HPLC and UV absorption between 230
and 320 nm using the aglycone molecular absorption as a reference.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1 การหลอมเหลวจุด หมุนแสงมีวัดจุดหลอมเหลวในเครื่องมือรูพรุน (บือCH) และ uncorrected หมุนเวียนแสงถูกวัดใน 1 dmเซลล์บน spectropolarimeter เพอร์เอลเมอ 321 (GB)2.2. NMRปราก (Inst. Microbiol) บันทึกด้วย NMR แรมสเป็คตราสเปกโตรมิเตอร์ Bruker Avance III 400 MHz (400.13 MHz สำหรับ 1H100.55 MHz สำหรับ C 13 ที่ 30 ◦C), สเปกโตรมิเตอร์ Bruker Avance III 600 MHz(600.23 MHz ใน 1H, 150.93 MHz สำหรับ C 13 ที่ 30 ◦C) และ Bruker เป็นAvance III 700 MHz สเปกโตรมิเตอร์ (700.13 MHz ใน 1H, 176.05 MHzสำหรับ 13 C ที่ 30 ◦C) ใน DMSO-d6 (อะตอม 99.9% D ซิก Aldrich) ส่วนที่เหลือจากสัญญาณของตัวทำละลายที่ใช้เป็นการภายใน (H2.500 ppm, C 39.60 ppm) การทดลอง NMR: 1H NMR, NMR 13C, Jresolvedโคซี่ HSQC, HSQC TOCSY, HMBC และ 1D TOCSYดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ของผู้ผลิต NMR 1H และ 13Cแรมสเป็คตรา NMR ศูนย์เติมจุดข้อมูล fourfold และคูณโดยฟังก์ชันหน้าต่างก่อนการแปลงฟูรีเย Aพารามิเตอร์สองคู่เนนลอเรนซ์ – เกาส์ฟังก์ชันไม่ใช้สำหรับ H 1 เพื่อปรับปรุงความละเอียด และบรรทัด broadening (1 Hz)C. charrier et al. / สมุดรายวันของการเร่งปฏิกิริยาโมเลกุล b: 102 เอนไซม์ในระบบ (2014) 167-173 169ใช้เพื่อให้ได้อัตราส่วนสัญญาณต่อเสียงของ 13C ดีกว่า เคมีกะได้ในระดับความละเอียดดิจิตอล justifying รายงานค่าในปารีส (มหาวิทยาลัย Descartes) แรมสเป็คตรา H - และ 13C-NMR 1 (500.13 MHz125.77 MHz และตามลำดับ) ได้รับการบันทึกในแบบ Bruker Avance -สเปกโตรมิเตอร์ 500 ใน DMSO d6 หรืออะซีโตน-d6 หรือสารทำละลาย ทั้งหมด NMRแรมสเป็คตราถูกวัดที่ 20 ◦C และโปรตอน และคาร์บอนเคมีมีการอ้างอิงกะให้สัญญาณเป็นตัวทำละลาย: 2.50 ppm สำหรับโปรตอน และ ppm 39.52 สำหรับคาร์บอนใน DMSO d6 และ 2.05 ppm สำหรับโปรตอนและ 29.85 ppm สำหรับคาร์บอนใน 2CO (CD3) แบบสองมิติกความสัมพันธ์ (โคซี่) และความสัมพันธ์รวมก(TOCSY), หมุนกรอบนิวเคลียร์ Overhauser ผลก(ROESY), heteronuclear เดี่ยวโปรเจคควอนตัม (HSQC), และ heteronuclearมีการทดลองหลายพันธะความสัมพันธ์ (HMBC)ดำเนินการโดยใช้ลำดับมาตรฐานชีพจร โปรตอนกะเคมีกำหนดได้รับ โดยการวิเคราะห์โคซี่และ TOCSYแรมสเป็คตราและคาร์บอนกะเคมีกำหนดขึ้นโดยการการวิเคราะห์ของ HSQC และ HMBC แรมสเป็คตรา สำหรับการอ้างอิง โปรตอนสมบูรณ์และคาร์บอนสูงสุดกำหนดแรมสเป็คตรา NMR ในสารประกอบหลัก2.3. MALDI-TOF/TOFแรมสเป็คตรา MALDI – MS ได้วัดบน MALDI-TOF/TOFultraFLEX III โดยรวมสเปกโตรมิเตอร์ (Bruker Daltonics เบรเมน เดอ)บวก/ลบแรมสเป็คตราถูกปรับเทียบภายนอกโดยใช้การmonoisotopic [M + H] + หรือประจุ− [M − H] ของ PepMixII calibrant(Bruker-Daltonics) กรด - Cyano-4-hydroxycinnamic (5 mg/mL)50% มีใช้ CH3CN/0.1% TFA เป็นเมทริกซ์ MALDI 0.4 Lของตัวอย่างละลายใน MeCN ถูกหยดกับ 0.5 ลิตรโซลูชั่นเมตริกซ์ในเป้าหมาย และสามารถอบแห้งที่แวดล้อมอุณหภูมิ แรมสเป็คตรา MALDI TOF ถูกรวบรวมไว้ใน reflectronโหมดการ มวลชนแน่นอนถูกวัดโดยใช้ LTQ Orbitrap XLไฮบริดโดยรวมสเปกโตรมิเตอร์ (เทอร์โม Fisher วิทยาศาสตร์ Waltham, MAสหรัฐอเมริกา) พร้อมกับแหล่งไอออนวิธีพ่นละอองไฟฟ้า ระยะเคลื่อนประกอบด้วยเมทานอล/น้ำ (4:1), กระแสอัตรา 30 L/min และตัวอย่างที่ฉีดใช้วน 2 L สเปรย์แรงดัน เส้นเลือดฝอยแรงดัน ท่อเลนส์แรงดันไฟฟ้า และอุณหภูมิเส้นเลือดฝอยได้4.5 kV, −40 V, −120 V และ 275 ◦C ตามลำดับ แรมสเป็คตรามวลได้ภายในปรับเทียบโดยใช้กรด stearic deprotonated ล็อคมวล2.4 การ HPLCวิเคราะห์ chromatography ถูกดำเนินการกับ Shimadzuความโดดเด่นระบบ UFLC (เกียวโต JP) ประกอบด้วย DGU-20Aระยะเคลื่อน degasser สอง LC 20AD หน่วยส่งตัวทำละลาย การภาษาศาสตร์ 20ACHT autosampler ระบายความร้อน เตาอบ CTO 10AS คอลัมน์ และSPD M20A ไดโอดอาร์เรย์จับ ประสิทธิภาพ Chromolith RP-คอลัมน์เสาหิน 18e (100 × 3 mm ประชาชน เมอร์ค ดาร์มส เดอ)ควบคู่กับการรักษา ใช้คอลัมน์ (5 × 4.6 mm) (เมอร์ค DE)ในการวิเคราะห์ทั้งหมด ข้อมูล PDA ได้รับ nm 200 – 450ช่วงและสัญญาณ nm 285 ถูกสกัด Elution ไล่ระดับแบบไบนารี:เคลื่อนที่ระยะที่เป็น (CH3CN/H2O/HCOOH (10/90/0.1; v/v/v);โมบายระยะ B (CH3CN/H2O/HCOOH (90/10//0.1; v/v/v)); ไล่ระดับสี0-1.5 นาที 100% A 1.5-15 min, 0-100% B 16 – 16.5 นาที 100 – 0%อัตราการไหลเกิดขึ้น 1 mL/min ที่ 25 ◦C ตัวอย่างทั้งหมดที่ละลายในน้ำคัดแยกและนับของ glucuronide metabolitesถูกดำเนินการโดยใช้การ Agilent รุ่น 1100 เหลว chromatographinterfaced กับตรวจจับรังสียูวีและ MS ประโยชน์ได้ดำเนินการใน 40 ◦C คอลัมน์ C18 Nucleodur (Macherey-Nagel)(5 เมตร 4 × 70 มม.หาเบื้องต้นและ 3 × 250 มม.สำหรับการประเมินขั้นสุดท้าย), ใช้ไล่น้ำ acetonitrile คล้ายประกอบด้วย 0.1% กรด (0.5 mL/min) มีดำเนินการตรวจสอบออกตรวจจับพ่อ Agilent (200-400 nm) และมี QuatroMicromass สเปกโตรมิเตอร์ (น้ำ) ที่ดำเนินการในโหมดลบจาก150-900 D.2.5 การเพาะปลูกของจุลินทรีย์พันธุ์ Streptomyces sp. M52104 แยกต่างหากจากดิน (สำหรับการรายละเอียดทั้งหมดของสายพันธุ์ที่ใช้ดู [22-24]), ที่อยู่ในAgar ปานกลาง 2 ISP (Difco) เอียงที่ 25 – 28 ◦C ของเหลวปานกลางวัฒนธรรมประกอบด้วย 2% D- (+) -กลูโคส (Difco), สารสกัดจากยีสต์ 0.5%0.5% soytone (Difco), 0.5% NaCl, 0.5% K2HPO4 น้ำ deionizedปรับค่า pH 7 กับ HCl โซลูชัน สื่อถูก sterilized โดย autoclavingที่ 121 ◦C สำหรับ 20 นาที Precultures ของ 50 mL ถูก inoculatedสี่หยดระงับเซลล์แบคทีเรียและ h incubated 72 ที่◦C 27 ในเชคเกอร์ของวงโคจร (200 รอบต่อนาที) Preculture แต่ละที่ใช้ฉีด 1 L วัฒนธรรม ซึ่งมี incubated ที่ 27 ◦C (200 รอบต่อนาที) สำหรับ72 h2.6. preparative syntheses และแยกของผลิตภัณฑ์Streptomyces sp. M52104 ถูกปลูกที่ ◦C 27 กับการสั่นของวงโคจร(200 rpm) ในน้ำ 1L ทรงกรวยที่ประกอบด้วย 250 mL-ปริมาตรของขนาดกลางของเหลวระหว่าง h. 72 Silybin ที่มีเพิ่มพื้นผิวต่อ incubations และวัฒนธรรม (0.1 g/L ความเข้มข้นสุดท้าย)สำหรับ 96 h และตรวจสอบ โดย HPLC/UV/MS เซลล์ได้เอาออก โดยการกรอง GF/A กรอง (Whatman) กับกรอง celiteช่วยเหลือ และสารกรองที่รักษา ด้วย Amberlite XAD-16 ที่ยางที่ล้าง ด้วยน้ำ แล้ว glucuronides ซ้ำ ๆมี eluted กับเอทานอล หลังจากระเหยใน vacuoการไดรฟ์ข้อมูลเล็ก สารตกค้าง eluate ถูก solubilized ในที่น้อยที่สุดปริมาตรของ acetonitrile และฉีดส่งไปต่อเนื่อง(0.5-2 mL) ใน Nucleodur กึ่ง preparative (Macherey-Nagel)คอลัมน์ C18 (10 เมตร 32 × 250 มม.) ใช้น้ำ-acetonitrileการไล่ระดับสี 0.1% กรด (40 mL/min) และตรวจสอบที่ 280 nm รวบรวมเศษถูกประเมินความบริสุทธิ์โดยHPLC/UV/MS และเหล่าเศษส่วนที่ประกอบด้วยปริมาณเพียงพอความบริสุทธิ์ของ glucuronides น่าสนใจและถูกทางถูกพู หายไปและ lyophilized มีความบริสุทธิ์ขั้นสุดท้าย (ในช่วง 80-100%)ประเมินจากการวิเคราะห์ HPLC และ UV การดูดซึมระหว่าง 230และ 320 nm ที่ใช้ดูดซึมโมเลกุลของ aglycone เป็นอ้างอิง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 ละลายจุดหมุนแสงจุดหลอมละลายวัดเครื่องดนตรีฝอย (Büchi, CH) และไม่ได้แก้ไข ผลัดออฟติคอลอยู่ในวัด 1 DM เซลล์ใน Perkin Elmer 321 spectropolarimeter (GB). 2.2 NMR ในปราก (Inst. Microbiol.) NMR สเปกตรัมถูกบันทึกไว้ด้วยBruker Avance III 400 MHz สเปกโตรมิเตอร์ (400.13 MHz สำหรับ 1H, 100.55 MHz สำหรับ 13C วันที่ 30 ◦C) ซึ่งเป็น Bruker Avance III 600 MHz สเปกโตรมิเตอร์(600.23 MHz สำหรับ 1H, 150.93 MHz สำหรับ 13C วันที่ 30 ◦C) และ Bruker Avance III 700 MHz สเปกโตรมิเตอร์ (700.13 MHz สำหรับ 1H, 176.05 MHz สำหรับ 13C วันที่ 30 ◦C) ใน DMSO-d6 (99.9% อะตอม D, Sigma-Aldrich) เหลือสัญญาณของตัวทำละลายถูกนำมาใช้เป็นมาตรฐานภายใน (H 2.500 ppm, C 39.60 ppm) การทดลอง NMR: 1H NMR, 13C NMR, Jresolved, โคซี่, HSQC, HSQC-TOCSY, HMBC และ 1D TOCSY ถูกดำเนินการโดยใช้ซอฟแวร์ของผู้ผลิต 1H NMR และ 13C NMR สเปกตรัมถูกศูนย์ที่เต็มไปด้วยจุดข้อมูลจาตุรงค์และคูณด้วยฟังก์ชั่นหน้าต่างก่อนที่จะเปลี่ยนแปลงฟูริเยร์ สองพารามิเตอร์สองครั้งที่ชี้แจงฟังก์ชั่นลอเรน-เกาส์ถูกนำมาใช้สำหรับ 1H เพื่อปรับปรุงความละเอียดและขยายสาย (1 Hz) ซี Charrier et al, / วารสารโมเลกุลปฏิกิริยา B: เอนไซม์ 102 (2014) 167-173 169 ถูกนำมาใช้เพื่อให้ได้ดีกว่า 13C สัญญาณต่อเสียงรบกวนอัตราส่วน การเปลี่ยนแปลงทางเคมีจะได้รับใน -scale ดิจิตอลที่มีความละเอียดเหตุผลที่มีการรายงานค่า. ในปารีส (Univ. Descartes) 1H- และสเปกตรัม 13C-NMR (500.13 MHz และ 125.77 MHz ตามลำดับ) ถูกบันทึกไว้ใน Bruker Avance- 500 สเปกโตรมิเตอร์ใน DMSO -d6 หรืออะซีโตน-d6 ตัวทำละลาย ทั้งหมด NMR สเปกตรัมวัดที่ 20 ◦Cและโปรตอนและเคมีคาร์บอนกะถูกอ้างอิงกับตัวทำละลายสัญญาณ: 2.50 ppm สำหรับโปรตอนและ39.52 ppm คาร์บอนใน DMSO-d6 และ 2.05 ppm สำหรับโปรตอนและ29.85 ppm สำหรับคาร์บอน (CD3 ) 2CO สองมิติสเปกโทรสโกสัมพันธ์ (โคซี่) และสเปคโทรสัมพันธ์รวม (TOCSY) หมุนกรอบ Overhauser นิวเคลียร์สเปกโทรสโกผล(ROESY) การเชื่อมโยงกันควอนตัมวิวิธพันธ์เดียว (HSQC) และวิวิธพันธ์สัมพันธ์พันธบัตรหลายๆ (HMBC) ทดลองดำเนินการโดยใช้ลำดับชีพจรมาตรฐาน โปรตอนการเปลี่ยนแปลงทางเคมีที่ได้รับมอบหมายได้จากการวิเคราะห์และโคซี่ TOCSY สเปกตรัมและคาร์บอนที่ได้รับมอบหมายการเปลี่ยนแปลงทางเคมีที่ถูกสร้างขึ้นโดยการวิเคราะห์และ HSQC HMBC สเปกตรัม สำหรับการอ้างอิงโปรตอนสมบูรณ์และคาร์บอนที่ได้รับมอบหมายจุดสูงสุดของสเปกตรัม NMR ถูกสร้างขึ้นในสารผู้ปกครอง. 2.3 MALDI-TOF / TOF MALDI-MS สเปกตรัมวัดใน MALDI-TOF / TOF UltraFlex III สเปกโตรมิเตอร์มวล (Bruker-Daltonics เบรเมน DE). บวก / สเปกตรัมเชิงลบสอบเทียบภายนอกใช้monoisotopic [M + H] + หรือ [ M - H] - ไอออนของ PepMixII calibrant (Bruker-Daltonics) ? -Cyano-4-hydroxycinnamic กรด (5 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร) ใน 50% CH3CN / 0.1% TFA ใช้เป็นเมทริกซ์ MALDI 0.4? L ของกลุ่มตัวอย่างที่ละลายใน MeCN ได้รับการผสมกับ 0.5? L ของการแก้ปัญหาเมทริกซ์ในเป้าหมายและได้รับอนุญาตให้แห้งโดยรอบที่อุณหภูมิ สเปกตรัม MALDI-TOF ถูกเก็บไว้ใน reflectron โหมด ฝูงแน่นอนถูกวัดโดยใช้ LTQ Orbitrap XL ไฮบริดสเปกโตรมิเตอร์มวล (เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์, วอลแทม, MA, USA) พร้อมกับแหล่งกำเนิดไอออน electrospray เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยเมทานอล / น้ำ (4: 1) อัตราการไหล 30 ลิตร / นาทีและตัวอย่างที่ถูกฉีดใช้2 วง L? แรงดันสเปรย์, เส้นเลือดฝอยแรงดันไฟฟ้าแรงดันไฟฟ้าเลนส์หลอดเส้นเลือดฝอยและอุณหภูมิได้4.5 กิโลโวลต์, -40 V, V -120 และ 275 ◦Cตามลำดับ สเปกตรัมมวลได้รับการสอบเทียบภายในโดยใช้กรดสเตียโปรตรอนล็อคมวล. 2.4 HPLC วิเคราะห์สารได้ดำเนินการใน Shimadzu ระบบรุ่งเรือง UFLC (เกียวโต JP) ประกอบด้วย DGU-20A degasser เฟสเคลื่อนที่สอง LC-20AD หน่วยการส่งมอบเป็นตัวทำละลายที่ฉีดตัวอย่างอัตโนมัติระบายความร้อนSIL-20ACHT, เตาอบคอลัมน์ CTO-10AS และเมจิ-M20A ตรวจจับอาร์เรย์ไดโอด ผลการดำเนินงาน Chromolith RP- 18e คอลัมน์เสาหิน (100 × 3 มมรหัสเมอร์ค, ดาร์มสตัด, DE) ควบคู่ไปกับคอลัมน์ยาม (5 × 4.6 มิลลิเมตร) (เมอร์ค, DE) ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ทั้งหมด ข้อมูลที่ได้รับมา PDA ใน 200-450 นาโนเมตรและช่วงสัญญาณ285 นาโนเมตรถูกสกัด ชะลาดไบนารี: เฟสเคลื่อนที่ A (CH3CN / H2O / HCOOH (10/90 / 0.1; v / v / v); เฟสเคลื่อนที่ B (CH3CN / H2O / HCOOH (90/10 // 0.1; v / v / v) ); ลาด0-1.5 นาที, 100%; 1.5-15 นาที, 0-100% B; 16-16.5 นาที, 100-0% ข. อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร / นาทีที่ 25 ◦Cตัวอย่างทุกคน ละลายในน้ำ. การแยกและการหาปริมาณของสาร glucuronide ได้รับการดำเนินการโดยใช้รูปแบบการ Agilent 1100 chromatograph ของเหลวเชื่อมต่อด้วยรังสียูวีและการตรวจสอบMS. แยกถูกดำเนินการใน40 ◦Cใน Nucleodur (Macherey-แจคกี้) คอลัมน์ C18 (5? ม. 4 × 70 มมสำหรับการแยกเบื้องต้นและ 3 × 250 มมสำหรับการวัดสุดท้าย) โดยใช้การไล่ระดับสีน้ำ acetonitrile ที่คล้ายกันที่มี0.1% กรด (0.5 มิลลิลิตร / นาที). การตรวจสอบได้ดำเนินการออกมาพร้อมกับเครื่องตรวจจับAgilent DAD (200-400 นาโนเมตร ) และ Quatro สเปกโตรมิเตอร์ Micromass (น้ำ) ดำเนินการในโหมดเชิงลบจาก150 900 ที่จะดี2.5. การเพาะปลูกของจุลินทรีย์เชื้อStreptomyces sp. จำนวนสายพันธุ์ M52104 ที่แยกได้จากดิน (สำหรับรายละเอียดของสายพันธุ์ที่ใช้ดู[22-24]) , ถูกเก็บรักษาไว้ในกลางISP 2 วุ้น (Difco) slants ที่ 25-28 ◦C อาหารเหลวสำหรับวัฒนธรรมที่มีอยู่ 2% D - (+) - กลูโคสสารสกัดจากยีสต์ 0.5% (Difco) 0.5% soytone (Difco), 0.5% โซเดียมคลอไรด์, 0.5% K2HPO4 ในน้ำปราศจากไอออน, ปรับค่าพีเอช 7 ด้วยสารละลาย HCl สื่อที่ได้รับการฆ่าเชื้อโดยการนึ่งฆ่าเชื้อที่ 121 ◦Cเป็นเวลา 20 นาที Precultures 50 มิลลิลิตรถูกเชื้อกับสี่หยดระงับเซลล์ของแบคทีเรียและบ่ม72 ชั่วโมงที่27 ◦Cในเครื่องปั่นโคจร (200 รอบต่อนาที) แต่ละ preculture ถูกใช้ในการฉีดวัคซีน1 L วัฒนธรรมซึ่งได้รับการบ่มที่ 27 ◦C (200 รอบต่อนาที) สำหรับ72 ชม. 2.6 เตรียมการสังเคราะห์และการแยกของผลิตภัณฑ์Streptomyces SP M52104 ปลูกวันที่ 27 ◦Cกับการโคจรสั่น(200 รอบต่อนาที) ใน 1 ลิตรขวดรูปกรวยที่มี 250 มิลลิลิตรปริมาณของอาหารเหลวในช่วง 72 ชั่วโมง พื้นผิว Silybin ถูกเพิ่มเข้าไปในวัฒนธรรม(0.1 กรัม / ลิตรความเข้มข้นสุดท้าย) และฟักตัวของเชื้อที่ได้รับการอย่างต่อเนื่อง96 ชั่วโมงและตรวจสอบโดยวิธี HPLC / UV / MS เซลล์ที่ถูกลบออกโดยการกรองใน GF / กรอง (เบอร์) กับ Celite กรองช่วยกรองและรับการรักษาด้วยAmberlite XAD-16 เรซินถูกล้างซ้ำด้วยน้ำแล้ว glucuronides ถูกชะด้วยเอทานอล หลังจากระเหยสุญญากาศในปริมาณขนาดเล็กที่เหลือ eluate ถูกละลายในน้อยที่สุดปริมาณของacetonitrile และส่งไปฉีดต่อเนื่อง(0.5-2 มิลลิลิตร) ใน Nucleodur กึ่งเตรียม (Macherey-แจคกี้) คอลัมน์ C18 (10 ม. 32 × 250 มม) โดยใช้น้ำ acetonitrile การไล่ระดับสีที่มี 0.1% กรด (40 มิลลิลิตร / นาที) และการตรวจสอบที่280 นาโนเมตร เศษส่วนที่เก็บรวบรวมได้รับการประเมินเพื่อความบริสุทธิ์โดยวิธี HPLC / UV / MS และเศษส่วนที่มีปริมาณที่เพียงพอและความบริสุทธิ์ของglucuronides ที่น่าสนใจที่ได้รวบรวมระเหยและแห้ง ความบริสุทธิ์รอบชิงชนะเลิศ (อยู่ในช่วง 80-100%) ได้รับการประเมินจากHPLC วิเคราะห์และการดูดซึมรังสียูวีระหว่าง 230 และ 320 นาโนเมตรโดยใช้ aglycone ดูดซึมโมเลกุลเป็นข้อมูลอ้างอิง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . จุดหลอมเหลว , การหมุน
แสงละลายจุดวัดบน C ( B ü chi
เครื่องมือ CH ) และ uncorrected . วัดแสงรอบใน 1 dm
เซลล์บนเพอร์กินเอลเมอร์ 321 spectropolarimeter ( GB ) .
2.2 . โดย
ในปราก ( สถาบัน ธนิดา เหรียญทอง B Sc ) NMR สเปกตรัมได้ถูกบันทึกไว้ด้วย
A BRUKER วนซ์ 3 400 MHz Spectrometer ( 400.13 MHz สำหรับ 1
, 10055 MHz สำหรับ 13C ที่ 30 ◦ C ) , BRUKER วนซ์ 3 600 MHz กล้อง
( 600.23 MHz สำหรับ 1 150.93 MHz , สำหรับ 13C ที่ 30 ◦ C ) และ BRUKER
วนซ์ 3 700 MHz Spectrometer ( 700.13 MHz สำหรับ 1 176.05 MHz ,
สำหรับ 13C ที่ 30 ◦ C ) ใน dmso-d6 ( 99.9 % อะตอม D , ซิกม่า Aldrich ) ส่วนที่เหลือ
สัญญาณของตัวทำละลายที่ใช้เป็นมาตรฐานภายใน ( H
2.500 ppm , C 39.60 ส่วนในล้านส่วน ) โดยทำการ : 1H NMR , 13C NMR , jresolved
, อบอุ่นhsqc hsqc-tocsy , , HMBC และ 1D tocsy ถูก
โดยใช้ซอฟต์แวร์ของผู้ผลิต 1H NMR และ 13C NMR สเปกตรัมมีศูนย์เต็ม

จุดข้อมูลจาตุรงค์และคูณด้วยหน้าต่างก่อนที่ฟูเรียร์ฟังก์ชันการแปลง เป็นสองพารามิเตอร์คู่แบบโลเร็นตซ์ (

ใช้ฟังก์ชันเกาส์เป็น 1 เพื่อปรับปรุงความละเอียด และสายใหม่ ( 1 Hz )
c charrier et al .วารสารของโมเลกุลปฏิกิริยาเอนไซม์ B : 102 ( 2014 ) – 173 167 169
ใช้รับสัญญาณดีกว่า 13C อัตราส่วน
กะเคมีจะได้รับใน - ค่าดิจิตอลความละเอียดอธิบายรายงานค่า
.
ในปารีส ( มหาวิทยาลัย Descartes ) 1 - 13c-nmr Spectra ( 500.13 MHz
125.77 MHz และ ตามลำดับ ) ได้ถูกบันทึกไว้ในบรุคเกอร์วนซ์ -
500 สเปกโตรมิเตอร์ใน dmso-d6 หรือ acetone-d6 สารละลายสเปกตรัม NMR
เป็นวัดที่ 20 ◦ C และ โปรตอนและคาร์บอนเคมี
กะถูกอ้างอิงสัญญาณตัวทำละลาย : 2.50 ppm
โปรตอนและคาร์บอนใน dmso-d6 39.52 ppm และ 2.05 มิลลิกรัมต่อ
โปรตอนและคาร์บอนใน 29.85 ppm ( ทันที ) 2CO สองมิติ
) spectroscopy ( อบอุ่น ) และ ความสัมพันธ์
สเปกโทรสโกปี ( tocsy ) หมุนกรอบนิวเคลียร์ overhauser ผลสเปกโทรสโกปี
( roesy )heteronuclear เดียวในควอนตัม ( hsqc ) และสหสัมพันธ์พหุพันธะ heteronuclear

( ฤทธิ์ ) การทดลองโดยใช้ลำดับชีพจรมาตรฐาน โปรตอนเคมีกะ
งานที่ได้จากการวิเคราะห์ อบอุ่น และ tocsy
spectra และคาร์บอนเคมีงานกะทำโดยการวิเคราะห์สเปกตรัมและ
hsqc ฤทธิ์ . อ้างอิง
โปรตอนที่สมบูรณ์และคาร์บอนงานของ NMR spectra ยอดไว้

แม่สาร 2.3 maldi-tof / tof
มา ดิ– MS spectra ถูกวัดใน maldi-tof / tof
ultraflex III แมสสเปกโตรมิเตอร์ ( บรูกเกอร์ ดอลโทนิก เบรเมน เดอ )
ให้บวกลบ / ทำการสอบเทียบภายนอกใช้
monoisotopic [ M ] หรือ [ M ] −− H ไอออนของ pepmixii calibrant
( บรูกเกอร์ ดอลโทนิก ) - cyano-4-hydroxycinnamic acid 5 mg / ml )
50% ch3cn / 0.1 % ระดับเคยเป็นมา ดิเมทริกซ์ 0.4  L
ตัวอย่างละลายผสมกับ mecn คือ 0.5  l
เมทริกซ์โซลูชั่นในเป้าหมาย และอนุญาตให้แห้งในอุณหภูมิปกติ

การ maldi-tof spectra ถูกเก็บในโหมด reflectron

มวลที่แน่นอนคือการวัดโดยใช้ ltq orbitrap XL
ไฮบริดแมสสเปกโตรมิเตอร์ ( เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์วอลแทม , MA , USA )
พร้อมกับวิธีพ่นละอองไฟฟ้าอิออนแหล่งที่มา
เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยเมทานอลต่อน้ำ ( 4 : 1 ) , อัตราการไหล 30 ลิตร / นาที 
จำนวนฉีดโดยใช้ห่วงชั้น 2 -  . สเปรย์แรงดันหลอดเลือดฝอย
แรงดัน , แรงดันและอุณหภูมิที่กระบอกเลนส์ C
4.5 กิโล− 40 V − 120 V และ◦ 275 องศาเซลเซียส ตามลำดับ มวลสเปกตรัม
อยู่ภายในการปรับ deprotonated กรดสเตียริกเป็นมวลล็อค
.
2.4 . เทคนิคการวิเคราะห์ HPLC
ได้ดําเนินการใน Shimadzu
โดด uflc ระบบ ( เกียวโต , JP ) ประกอบด้วย dgu-20a
เฟสเคลื่อนที่ degasser สอง lc-20ad ตัวทำละลายจัดส่งหน่วย ,
sil-20acht autosampler เย็น , cto-10as คอลัมน์เตาอบและ
spd-m20a ไดโอดอาร์เรย์เครื่องตรวจจับ การ chromolith ประสิทธิภาพ RP -
18e แบบคอลัมน์ ( 100 มม. × 3 ไอดี เมอร์ค ดาร์มชตัท , , )
คู่กับการ์ดคอลัมน์ ( 5 × 4.6 มิลลิเมตร ) ( Merck , ) คือใช้
ในองค์ประกอบ ข้อมูลทั่วไปที่ได้มาในช่วง 200 - 450 nm
และ 285 นาโนเมตรสัญญาณถูกสกัด การใช้ไบนารี :
เฟสเคลื่อนที่ ( ch3cn / H2O / hcooh ( 10 / 90 / 1 ; v / v / v ) B ;
เฟสเคลื่อนที่ ( ch3cn / H2O / hcooh ( 90 / 10 / / 1 ; v / v / v ) ; ลาด ,
0 – 100% 1.5 นาที ; 1 .5 – 15 นาที 0 – 100 % B ; 16 - 16.5 นาที , 100 – 0 %
. อัตราการไหลเท่ากับ 1 มล. / นาทีที่อุณหภูมิ 25 ◦ C ตัวอย่าง

ละลายในน้ำ การแยก และปริมาณของสาร glucuronide
ได้ดำเนินการโดยใช้รูปแบบ Agilent 1100 โครมาโทกราฟีของเหลว
ติดต่อกับยูวี และ MS การค้นหา แยกเป็น
แสดงที่ 40 ◦ C nucleodur ( macherey เนเกิล ) c18 คอลัมน์
( 5  M4 × 70 mm สำหรับเบื้องต้นแยก 3 × 250 มม. สำหรับ
วัดสุดท้าย ) โดยใช้การไล่ระดับสีน้ำไนคล้ายกัน
ที่ประกอบด้วย 0.1% กรด ( 0.5 ml / min ) การตรวจหาการ
ด้วยเครื่องพ่อเลนต์ ( 200 – 400 นาโนเมตร ) และสเปก micromass quatro
( น้ำ ) ในโหมดการเชิงลบจาก 900 D .

150 2.5 การเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์ Streptomyces sp . สายพันธุ์ m52104
,ที่แยกได้จากดิน ( สำหรับ
รายละเอียดของสายพันธุ์ที่ใช้ดู [ 22 24 – ] ) , รักษา
ISP ขนาดกลาง 2 ( difco ) slants ที่ 25 – 26 ◦ซี. อาหารเหลวสำหรับ
วัฒนธรรมที่มีอยู่ 2 % D - ( ) - กลูโคสยีสต์สกัดร้อยละ 0.5 ( difco
0.5 ) % soytone ( difco ) 0.5% NaCl k2hpo4 0.5% ในคล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำ
ค่า pH 7 กับกรดไฮโดรคลอริก . สื่อผ่านการฆ่าเชื้อโดยอัตราส่วนโฟกัส
ที่ 121 ◦ C เป็นเวลา 20 นาทีprecultures 50 มล หัวเชื้อ
4 หยดแบคทีเรียและเซลล์แขวนลอยเชื้อ 72 ชั่วโมงใน
27 ◦ C ในโคจร ( เขย่า 200 รอบต่อนาที ) แต่ละพันธุ์ก็ใช้
ฉีดวัคซีน 1 วัฒนธรรมที่บ่มที่อุณหภูมิ 27 องศาเซลเซียส ( ◦ 200 รอบต่อนาที ) 72 ชั่วโมง

2.6 การสังเคราะห์และการแยกค่าของ Streptomyces sp . ผลิตภัณฑ์
m52104 โตที่ 27 ◦ C กับเบ้าตาสั่น
( 200 รอบต่อนาที ) ในขวด 1 ลิตรทรงกรวยประกอบด้วย 250 มิลลิลิตร ปริมาณของเหลวในช่วง 72 ชั่วโมง

ไซลิบินพื้นผิวที่ถูกวัฒนธรรม ( 0.1 กรัม / ลิตร ความเข้มข้นสุดท้าย ) และมีอย่างต่อเนื่องเพื่อ incubations
96 ชั่วโมงและตรวจสอบด้วย HPLC / UV / คุณเซลล์ก็
ลบออกโดย GF / ตัวกรอง ( กรองบน whatman ) กับสารช่วยกรอง
ได้ดี และการรักษาด้วยสารละลาย xad-16 .
เรซินเป็นซ้ำ ๆล้างด้วยน้ำแล้ว glucuronides
เป็นตัวอย่างกับเอทานอล หลังจากการระเหยใน vacuo
ที่จะไดรฟ์ขนาดเล็ก , สารละลาย ( eluate ) ซึ่งตกค้างในปริมาณที่น้อยที่สุด
ของไนและยื่นให้ต่อเนื่องเช้ามืด
( 0.5 – 2 มล. ) กึ่งเบื้องต้น nucleodur ( macherey เนเกิล ) คอลัมน์
c18 ( 10  M 32 × 250 มม. ) โดยใช้น้ำที่มีไน
ลาด , 01 % กรด ( 40 มล. / นาที ) และการตรวจหา
ที่ 280 nm . เก็บเศษส่วน ได้แก่ ความบริสุทธิ์โดย
MS HPLC / UV / และเศษส่วนที่มี
ปริมาณเพียงพอและความบริสุทธิ์ของ glucuronides สนใจเป็นพู ระเหย และแห้ง
. ความบริสุทธิ์สุดท้าย ( อยู่ในช่วง 80 - 100 % ) คือ
โดยประมาณจาก HPLC วิเคราะห์การดูดกลืน UV ระหว่าง 230
และ 320 nm ใช้ี่โมเลกุลการดูดกลืนเป็นอ้างอิง