Basic criteria a method of DNA isolation from any sample type should meet include: (1) Efficient extraction. (2) Sufficient amount of DNA extracted for downstream processes. (3) Removal of contaminants. (4) Quality and purity of DNA. Ultraviolet absorbance can be used to assess the purity of the extracted DNA. For a pure DNA sample, the ratio of absorbance at 260 nm and absorbance at 280 nm (A260/A280) is 1.8. Ratio of < 1.8 indicates the sample is contaminated with protein or organic solvent such as phenol. Figure 1 lists the basic steps involved in all DNA extraction methods.
Common DNA extraction methods
Different extraction methods result in different yields and purity of DNA. Some of the extraction methods have been systematically evaluated for specific applications such as soil and sediment samples [2], human microbiome [3], and human fecal samples [4], [5], [6].
Organic Extraction
In this conventional, widely used method, cells are lysed and cell debris is usually removed by centrifugation. Then proteins are denatured using a protease and precipitated using organic solvents such as phenol, or 1:1 mixture of phenol and chloroform, and the protein precipitate is removed by centrifugation. Purified DNA is usually recovered by precipitation using ethanol or isopropanol. In presence of monovalent cations such as Na+, and at a temperature -20°C, absolute ethanol efficiently precipitates polymeric nucleic acids and leaves behind short chain and monomeric nucleic acid components including the ribonucleotides from RNase treatment in solution. This method uses hazardous organic solvents, is relatively time-consuming, and residual phenol or chloroform may affect downstream applications such as PCR. Easy-DNA® Kit (Invitrogen) is an example.
Silica based technology
This is a widely employed method in current kits. DNA adsorbs specifically to silica membrane/beads/particles in the presence of certain salts and at a particular pH. The cellular contaminants are removed by wash steps. DNA is eluted in a low salt buffer or elution buffer. Chaotropic salts are included to aid in protein denaturation and extraction of DNA. This method can be incorporated in spin columns and microchips, is cost effective, has a simpler and faster procedure than the organic extraction, and is suitable for automation. Kits based on this method include Purelink Genomic DNA extraction kit (Invitrogen), DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen).
Magnetic separation
This method is based on reversibly binding DNA to a magnetic solid surface/ bead/particles, which have been coated with a DNA binding antibody or a functional group that interacts specifically with DNA. After DNA binds, beads are separated from other contaminating cellular components, washed and finally the purified DNA is eluted using ethanol extraction. This method is rapid and can be automated. However, it can be more costly than other methodologies. Examples are Agencourt DNAdvance Kit (Beckman Coulter), Magnetic Beads Genomic DNA Extraction Kit (Geneaid).
Anion exchange technology
This method is based on the specific interaction between negatively charged phosphates of the nucleic acid and positively charged surface molecules on the substrate. DNA binds specifically to the substrate in presence of low salt, contaminants are removed by wash steps using low or medium salt buffer, and purified DNA is eluted using high salt buffer. This technology more commonly employed in plasmid isolation kits such as PureLink® HiPure Plasmid DNA Purification Kits (Invitrogen), Qiagen plasmid mini/midi kits and Genomic-tip, and NucleoBond® PC kits (Macherey Nagel).
Others
Other methods include salting out, cesium chloride density gradients, and chelex 100 resin. DNA isolation methods are often modified and optimized for different cell types. Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) and guanidium thiocynate (GITC) are often included in protocols for DNA extraction from plant materials, and are discussed more in detail in section "DNA extraction from plant tissue and cells".
วิธีการแยกดีเอ็นเอจากตัวอย่างชนิดใดควรตรงกับเกณฑ์พื้นฐานรวม: สกัด (1) ประสิทธิภาพการ (2) จำนวนดีเอ็นเอที่สกัดสำหรับกระบวนการปลายน้ำเพียงพอ (3) การกำจัดสารปนเปื้อน (4) คุณภาพและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ Absorbance รังสีอัลตราไวโอเลตสามารถใช้หาความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่แยก สำหรับอย่างเป็นดีเอ็นเอบริสุทธิ์ อัตราส่วนของ absorbance ที่ 260 nm และ absorbance ที่ 280 nm (A260/A280) คือ 1.8 อัตราส่วนของ < 1.8 บ่งชี้ตัวอย่างถูกปนเปื้อน ด้วยโปรตีนหรือตัวทำละลายอินทรีย์เช่นวาง รูปที่ 1 แสดงขั้นตอนพื้นฐานที่เกี่ยวข้องกับวิธีการสกัดดีเอ็นเอทั้งหมดวิธีการสกัดดีเอ็นเอวิธีการสกัดต่าง ๆ ได้ในอัตราผลตอบแทนที่แตกต่างกันและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ บางวิธีสกัดได้รับระบบประเมินสำหรับการใช้งานเฉพาะเช่นดินตะกอนตัวอย่าง [2], microbiome มนุษย์ [3], และมนุษย์ fecal ตัวอย่าง [4], [5], [6]อินทรีย์สกัดวิธีนี้ใช้กันอย่างแพร่หลาย ทั่วไป มี lysed เซลล์ และมักจะมีเอาเศษเซลล์ โดย centrifugation แล้ว โปรตีนจะ denatured รติเอสใช้ และตกตะกอนการใช้อินทรีย์เช่นวาง หรือส่วนผสม 1:1 วางและคลอโรฟอร์ม และ precipitate โปรตีนจะถูกเอาออก โดย centrifugation ดีเอ็นเอบริสุทธิ์มักจะได้รับการกู้คืน โดยใช้เอทานอลหรือ isopropanol ฝน ในสถานะของเป็นของหายาก monovalent เช่น Na + และ ที่อุณหภูมิ-20 ° C เอทานอลนอน precipitates กรดนิวคลีอิกชนิด และใบหลังโซ่สั้น ๆ และส่วนประกอบของกรดนิวคลีอิก monomeric รวม ribonucleotides จาก RNase รักษาในโซลูชัน วิธีนี้ใช้อินทรีย์วัตถุอันตราย มีวางค่อนข้างใช้เวลานาน และส่วนที่เหลือ หรือคลอโรฟอร์มอาจส่งผลกระทบต่อโปรแกรมประยุกต์ปลายน้ำเช่น PCR ชุด®ง่ายดีเอ็นเอ (Invitrogen) เป็นตัวอย่างซิลิก้าที่ใช้เทคโนโลยีนี้เป็นวิธีที่แพร่หลายเจ้าในชุดปัจจุบัน Adsorbs ดีเอ็นเอโดยเฉพาะกับซิลิกาเมมเบรน/ลูกปัด/อนุภาคในต่อหน้า ของเกลือบาง และ ที่ pH หนึ่ง ๆ สารปนเปื้อนโทรศัพท์มือถือจะถูกเอาออก โดยขั้นตอนการล้าง ดีเอ็นเอเป็น eluted ในบัฟเฟอร์เกลือต่ำหรือบัฟเฟอร์ elution Chaotropic เกลือได้เพื่อช่วยในการสกัดดีเอ็นเอและโปรตีน denaturation วิธีนี้สามารถถูกรวมในคอลัมน์หมุนและ microchips คุ้มค่า มีขั้นตอนที่ง่ายกว่า และเร็วกว่าสกัดอินทรีย์ เหมาะสำหรับทำงานอัตโนมัติ และ ชุดตามวิธีการนี้รวมถึงชุดสกัดดีเอ็นเอ Genomic Purelink (Invitrogen), DNeasy เลือดและเนื้อเยื่อชุด (Qiagen)แม่เหล็กแยกวิธีการนี้จะขึ้นอยู่กับ reversibly ผูกดีเอ็นเอการสังเคราะห์แม่เหล็ก / ลูกปัด/อนุภาค ซึ่งมีการเคลือบ ด้วยแอนติบอดีการรวมดีเอ็นเอหรือทำงานเป็น กลุ่มที่โต้ตอบโดยเฉพาะกับดีเอ็นเอ หลังจากดีเอ็นเอ binds ลูกปัดจะแยกออกจาก contaminating โทรศัพท์มือถือส่วนประกอบอื่น ๆ เครื่องซักผ้า และสุดท้าย ดีเอ็นเอบริสุทธิ์เป็น eluted การใช้สกัดเอทานอล วิธีนี้จะรวดเร็ว และสามารถเป็นแบบอัตโนมัติ อย่างไรก็ตาม มันสามารถเป็นค่าใช้จ่ายสูงกว่าวิธีอื่น ๆ ตัวอย่างคือ Agencourt DNAdvance Kit (Beckman Coulter), แม่เหล็กเม็ด Genomic DNA แยกชุด (Geneaid)Anion แลกเปลี่ยนเทคโนโลยีวิธีการนี้จะขึ้นอยู่กับการโต้ตอบเฉพาะระหว่างคิดฟอสเฟตกรดนิวคลีอิกในเชิงลบ และคิดบวกผิวโมเลกุลบนพื้นผิว ดีเอ็นเอ binds โดยเฉพาะไปกับพื้นผิวในของเค็ม สารปนเปื้อนจะถูกเอาออก โดยขั้นตอนการล้างโดยใช้บัฟเฟอร์เกลือต่ำ หรือปานกลาง และ eluted ดีเอ็นเอบริสุทธิ์ใช้เกลือบัฟเฟอร์สูง เทคโนโลยีนี้ทำงานมากกว่าปกติใน plasmid แยกชุดเช่น PureLink ® HiPure Plasmid DNA ฟอกชุด (Invitrogen), Qiagen plasmid มินิ/midi ชุดแนะ นำ Genomic และชุด NucleoBond ® PC (Macherey Nagel)ผู้อื่นวิธีการอื่น ๆ รวมถึงมารีซอลทิงออก ไล่ระดับสีความหนาแน่นของ cesium คลอไรด์ ยาง chelex 100 วิธีการแยกดีเอ็นเอมีมักจะปรับเปลี่ยน และปรับให้เหมาะกับชนิดของเซลล์ต่าง ๆ Cetyltrimethylammonium โบรไมด์ (CTAB) และ guanidium thiocynate (GITC) มักจะรวมอยู่ในโปรโตคอลการสกัดดีเอ็นเอจากโรงงานวัสดุ และอธิบายเพิ่มเติมในรายละเอียดในส่วน "สกัดดีเอ็นเอจากเซลล์และเนื้อเยื่อพืช"
การแปล กรุณารอสักครู่..

เงื่อนไขพื้นฐานวิธีการสกัดแยกดีเอ็นเอจากตัวอย่างประเภทใดควรตอบสนองรวมถึง : ( 1 ) การสกัดที่มีประสิทธิภาพ ( 2 ) ปริมาณที่เพียงพอของดีเอ็นเอที่สกัดสำหรับกระบวนการปลายน้ำ ( 3 ) การกำจัดสิ่งปนเปื้อน ( 4 ) คุณภาพและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ การดูดกลืนแสงอัลตราไวโอเลตสามารถใช้วัดความบริสุทธิ์ของน้ำสกัดดีเอ็นเอ สำหรับตัวอย่าง DNA ที่บริสุทธิ์ ,อัตราส่วนของค่าการดูดกลืนแสงที่ 260 นาโนเมตรและการดูดกลืนแสงที่ 280 nm ( a260 / a280 ) 1.8 อัตราส่วน < 1.8 บ่งชี้ว่าตัวอย่างที่ปนเปื้อนด้วยโปรตีน หรือตัวทำละลายอินทรีย์ เช่น ฟีนอล รูปที่ 1 แสดงขั้นตอนพื้นฐานที่เกี่ยวข้องในวิธีการสกัดดีเอ็นเอ .
โดยวิธีการสกัดดีเอ็นเอแตกต่างกันวิธีการสกัดผลผลผลิตที่แตกต่างกันและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอบางส่วนของวิธีการสกัดได้อย่างเป็นระบบการประเมินสำหรับการใช้งานที่เฉพาะเจาะจง เช่น ดินตะกอนตัวอย่าง [ 2 ] , [ 3 ] ไมโครไบโ มนุษย์และมนุษย์อุจจาระตัวอย่าง [ 4 ] , [ 5 ] [ 6 ] .
สกัดอินทรีย์ในนี้ปกติใช้วิธี lysed เศษเซลล์และเซลล์ปกติเอาออกโดยการปั่นเหวี่ยงแล้วโปรตีนโปรตีนและเกิดการตกตะกอนโดยใช้ตัวทำละลายอินทรีย์เช่นฟีนอล , หรือ 1 : 1 ผสมฟีนอลและคลอโรฟอร์ม และโปรตีนที่ตกตะกอนจะถูกเอาออกโดยการปั่นเหวี่ยง บริสุทธิ์ดีเอ็นเอมักจะหายโดยการตกตะกอนโดยใช้เอทานอล หรือ ไอโซโพรพานอล . ในการปรากฏตัวของสารกัด เช่น นา และที่อุณหภูมิ - 20 องศา Cแน่นอนเอทานอลมีประสิทธิภาพ precipitates กรดนิวคลีอิกพอลิเมอร์และใบหลังโซ่สั้นและคอมโพเนนต์เกิดกรดนิวคลีอิกได้แก่ ไรโบนิวคลีโอไทด์จากเลสรักษาในสารละลาย วิธีนี้ใช้ตัวทำละลายอินทรีย์ที่อันตราย ค่อนข้างใช้เวลานาน และ ฟีนอลที่เหลือหรืออาจมีผลต่อการใช้งานต่อเนื่อง ( เช่น PCR DNA ชุด®ง่าย ( Invitrogen ) เป็นตัวอย่าง .
ซิลิกาที่ใช้เทคโนโลยีนี้จะใช้กันอย่างแพร่หลาย
วิธีในชุดปัจจุบัน ดีเอ็นเอ adsorbs เฉพาะสมบัติเมมเบรน / ลูกปัด / อนุภาคในการแสดงตนของบางเกลือและที่เฉพาะสาขาสารปนเปื้อนต่างๆของเซลล์จะถูกลบออกโดยขั้นตอนการล้าง ดีเอ็นเอตัวอย่างเกลือต่ำ ( กันชน หรือบัฟเฟอร์ chaotropic เกลือ รวมถึงช่วยในการหยุดชั่วคราวโปรตีนและการสกัดดีเอ็นเอวิธีนี้สามารถรวมอยู่ในคอลัมน์หมุนและไมโครชิป , ค่าใช้จ่ายที่มีประสิทธิภาพได้ง่ายและขั้นตอนได้เร็วกว่าสารอินทรีย์ และเหมาะสำหรับระบบอัตโนมัติ ชุดนี้รวมถึง purelink ขึ้นอยู่กับวิธีการสกัดดีเอ็นเอชุด ( Invitrogen ) dneasy เลือดและเนื้อเยื่อ ( เพิ่มชุดแยกแม่เหล็ก
)วิธีการนี้จะขึ้นอยู่กับซึ่งพลิกกลับได้ดีเอ็นเอมัดกับสนามแม่เหล็กพื้นผิวของแข็ง / ลูกปัด / อนุภาคซึ่งถูกเคลือบด้วยโปรตีนดีเอ็นเอมัดหรือหมู่ฟังก์ชันที่ติดต่อเฉพาะกับดีเอ็นเอ หลังจากดีเอ็นเอมัด ลูกปัดจะแยกจากปนเปื้อนอื่น ๆส่วนประกอบของเซลล์ , ล้างและในที่สุดทำให้ดีเอ็นเอตัวอย่างการสกัดเอทานอลวิธีนี้เป็นวิธีที่รวดเร็วและได้โดยอัตโนมัติ อย่างไรก็ตาม มันสามารถค่าใช้จ่ายมากกว่าลักษณะอื่น ๆ ตัวอย่างชุด dnadvance agencourt ( เบคแมน คูลเตอร์ ) , แม่เหล็กลูกปัดชุดสกัดดีเอ็นเอจีโนม ( geneaid ) .
เทคโนโลยีแลกเปลี่ยนแอนไอออนวิธีการนี้จะขึ้นอยู่กับเฉพาะปฏิสัมพันธ์ระหว่างประจุลบของฟอสเฟตกรดนิวคลีอิกและพื้นผิวโมเลกุลประจุบวกบนพื้นผิว ดีเอ็นเอมัดเฉพาะเพื่อใช้ในการแสดงตนของเกลือต่ำ สิ่งปนเปื้อนจะถูกเอาออก โดยขั้นตอนการล้างบัฟเฟอร์เกลือต่ำหรือปานกลาง และมีตัวอย่างการใช้บัฟเฟอร์ดีเอ็นเอบริสุทธิ์เกลือสูงเทคโนโลยีที่ใช้ในชุดนี้มากกว่าปกติ เช่น การแยกสายพันธุ์ purelink พลาสมิดดีเอ็นเอบริสุทธิ์® hipure อิสระ ( Invitrogen ) เพิ่มมินิ / MIDI และพลาสมิดปลายชุดจีโนม และชุดคอมพิวเตอร์® nucleobond ( macherey เนเกิล ) .
วิธีการอื่น ๆอื่น ๆรวมถึงเกลือ , ซีเซียมคลอไรด์ความหนาแน่นของการไล่ระดับสี และ chelex 100 เม็ด .วิธีการสกัดแยกดีเอ็นเอมักจะแก้ไขและเพิ่มประสิทธิภาพให้เซลล์ที่แตกต่างกัน cetyltrimethylammonium โบรไมด์ ( ctab ) และ guanidium ไทโอไซยาเนต ( gitc ) มักจะรวมอยู่ในระบบการสกัดดีเอ็นเอจากพืช และมีการกล่าวถึงในรายละเอียดในส่วนของ " การสกัดดีเอ็นเอจากเนื้อเยื่อพืช และ เซลล์ "
การแปล กรุณารอสักครู่..
