Under chilled, aerobic storage cond

Under chilled, aerobic storage conditions, several Gram-negative
genera, particularly Pseudomonas, Aeromonas, Shewanella, Enterobacteriaceae,
dominate the spoilage microorganisms of freshwater
and marine fish (Noseda et al., 2012; Wang et al., 2014).
However, vacuum packaging can inhibit the growth of aerobic
bacteria commonly present on fish, resulting in an increase in
Gram-positive bacteria that can respire better than Gram-negative
bacteria in this type of packaging (Lyhs et al., 2002; Mace et al.,
2012; Noseda et al., 2012).
With regard to common carp, Mahmoud et al. (2004) analyzed
the microbiota that cause spoilage in skin, gills and intestines. Their
analysis depended mostly on traditional microbiological methods,
such as plate viable counts, isolation, and biochemical identification.
However, the objective of this study was to characterize and
monitor the changes in the microbial communities of AP and VP
common carp fillets stored at 4
C using a combination of culturebased
and 16S rRNA gene analysis methods. We also hoped to gain
more knowledge on the dominant microorganisms at the species
level so that we could develop suitable control methods.
2. Materials and methods
2.1. Sampling and packaging
Twenty common carp (weight 1150 ± 180 g, length 43 ± 1 cm)
were obtained from an aquatic products market in Beijing, China
and were transported to the laboratory alive in September 2014.
Subsequently, carp were stunned, deheaded, scaled, gutted, filleted,
and washed immediately with cold sterile water. The fillets were
then drained at 4
C for 3 min and prepared for packaging. The
fillets (weight 220 ± 35 g, about 12 10 2 cm3
) were randomly
divided into two portions. Then they were packaged in air (n ¼ 18)
in well-sealed polyvinyl chloride bags (about 250ⅹ200 mm) and
under vacuum (n ¼ 21) in pouches of polyethylene/polyamide film
(about 250 200 mm, having an oxygen permeability of
40e50 cm3
/m2 per 24 h/atm at 85% relative humidity, 23
C),
respectively. All pouches were stored at 4 ± 1
C. Samples of white
dorsal muscle from three fillets were taken randomly for analyzing
sensory scores, pH value, total volatile basic nitrogen (TVB-N),
microbiological enumeration, and biogenic amines every 2 days.
However, microbial communities were identified on days 0, 4, and
8 for AP samples and on days 6 and 12 for VP samples.
2.2. Sensory analyses
The sensory characteristic of each fillet (fresh and cooked) was
evaluated using the method of Hong et al. (2012). Cooked carp
fillets were prepared by steaming for 10 min at 100
C. Seven
members were trained to evaluate the color, odor, elasticity, and the
morphology of raw fish muscle, as well as the flavor, odor, and broth
turbidity of cooked carp fillets, scoring each on a scale from 1 to 5
points. A total score of 35.0 points was considered fresh, while 15.0
was regarded as the lowest acceptable limit.
2.3. Determination of TVB-N and pH
TVB-N value was measured by the semi-micro steam distillation
method (Hong et al., 2012). The pH value was detected using a
digital pH meter (Mettler Toledo FE20/EL20, Shanghai, China).
2.4. Determination of biogenic amines
Extraction and derivatization of biogenic amines (BAs) were
carried out as described by Shi et al. (2012). Subsequently, BAs were
determined and quantified by using HPLC (Shimadzu LC-10A;
Shimadzu, Kyoto, Japan) equipped with a COSMOSIL 5C18-PAQ
(4.6 250 mm) column and an SPD-10A (V) detector. Ammonium
acetate (0.1 M; solvent A) and acetonitrile (solvent B) were used as
mobile phases. The gradient elution program was as follows: 0 min,
50% B; 25 min, 90% B; 35 min, 90% B; 45 min, 50% B. The samples
were detected at 254 nm with a flow rate of 0.8 mL/min and an
injection volume of 50 mL. The column temperature was 30
C.
2.5. Enumeration of microbial communities
Plate dilution gradient methods were carried out on samples to
enumerate different microbial communities using the method of
Wang et al. (2014). For all microbial enumeration, samples of serial
dilutions (100 mL) were spread on the surface of dry media. Total
viable counts (TVC) were determined in plate count agar (PCA) and
they were incubated at 30 ± 1
C for 72 h. Lactic acid bacteria (LAB)
were enumerated in overlaid pour-plates of MRS agar and incubated
at 30
C for 48 h. Pseudomonas sp. were determined on
Pseudomonas CFC Selective Agar (CFC) at 20
C for 48 h. H2S-producing
bacteria were evaluated on iron agar medium (IA); black
colonies produced on IA were enumerated after incubating at 20
C
for 4 days. All colony forming units were recorded as log CFU/g. All
of the culture media were supplied by Hai Bo Biological Technology
Co., Ltd. (Qingdao, China).
2.6. Isolation and identification of microorganisms
2.6.1. Isolation and purification
Bacterial DNA were isolated and purified in accordance with the
method of Wang et al. (2014). After TVC enumeration, bacteria were
isolated on PCA for identification of the dominant microbiota from
fresh carp fillets (53 isolates), AP fillets stored on days 4 and 8 (46
and 55 isolates, respectively), and from VP fillets stored on days 6
and 12 (40 and 48 isolates, respectively), with the goal of purifying
these strains. All of the colonies were selected from the highest
dilution PCA spread plates which usually contained 30e100 isolates,
using an inoculation loop, and sub-cultured at 30 ± 1
C for
24e48 h in 5 mL of tryptic soy broth (TSB) (Aoboxing Universeen
Bio-Tech Co., Ltd., Beijing, China). After being cultured, by repeated
plate streaking, Gram staining and microscopy, the isolates from
each sample were purified for identification by 16S rRNA gene
sequence analysis. A single purified colony was sub-cultured in
5 mL of TSB at 30 ± 1
C for 24e48 h.
2.6.2. Extraction and identification of DNA by 16S rRNA gene
analysis
The 2 mL sample of TSB culture was transferred, each containing
a single purified colony, to a centrifuge tube, where cells were
collected by centrifugation. DNA was extracted from the centrifugal
sediment using the bacterial DNA extraction kit (Bomad Biological
Technology Co., Ltd., Beijing, China) according to the manufacturer's
instructions. 1.0% agarose gel electrophoresis was used to
determine quality of these DNA extracts. These extracts, which
showed the clear, bright ladder in the agarose gel, were picked as
the DNA templates for PCR (TC-512, Techne, UK).
Bacterial 16S rRNA was amplified by PCR using the universal
bacterial forward primer 27f (50
-GAGATTTGATCCTGGCTCAG-30
)
and the reverse primer 1495r (50
-CTACGGCTACCTTGTTACGA-30
)
(Wang et al., 2014). All the oligonucleotide PCR primers used in this
study were received from Bomad Biological Technology Co., Ltd.
(Beijing, China; BBT). The PCR system was comprised of 12.5 mL
2 Taq PCR Master Mix (containing thermostable DNA polymerase,
MgCl2, dNTPs, buffer), 1 mL of template DNA, 10.5 mL double distilled
water, and 0.5 mL of each primer at a concentration of 10 mM with a
total reaction volume of 25 mL. Amplification was performed under
198

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ภายใต้เงื่อนไขเก็บเย็น แอโรบิก หลายแบคทีเรียแกรมลบสกุล โดยเฉพาะอย่างยิ่งลี Aeromonas, Shewanella, Enterobacteriaceaeครองจุลินทรีย์เน่าเสียของปลาและปลาทะเล (Noseda et al., 2012 วัง et al., 2014)อย่างไรก็ตาม บรรจุภัณฑ์สูญญากาศสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของแอโรบิกแบคทีเรียมักนำปลา ผลเพิ่มแบคทีเรียที่สามารถ respire ดีกว่าแบคทีเรียแกรมลบแบคทีเรียชนิดนี้บรรจุ (Lyhs et al., 2002 เมซ et al.,2012 Noseda et al., 2012)กับปลาไน Mahmoud et al. (2004) วิเคราะห์microbiota ที่ทำให้เกิดการเน่าเสียในผิว gills และลำไส้ ของพวกเขาวิเคราะห์ขึ้นอยู่กับส่วนใหญ่ดั้งเดิมวิธีทางจุลชีววิทยานับได้จาน แยก และรหัสชีวเคมีอย่างไรก็ตาม วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้คือการ กำหนดลักษณะ และตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงในชุมชนจุลินทรีย์ของ AP และ VPแล่ปลาคาร์ฟทั่วไปเก็บไว้ที่ C 4 โดยใช้ชุดของ culturebasedและวิธีการวิเคราะห์ยีนของ rRNA 16S นอกจากนี้เรายังหวังว่าจะได้รับความรู้เพิ่มเติมในจุลินทรีย์หลักที่สายพันธุ์ระดับเพื่อให้เราสามารถพัฒนาวิธีการควบคุมที่เหมาะสม2. วัสดุและวิธีการ2.1. การสุ่มตัวอย่าง และบรรจุภัณฑ์ปลาไนยี่สิบ (±น้ำหนัก 1150 กรัม 180 ±ยาว 43 1 cm)ได้รับมาจากตลาดผลิตภัณฑ์สัตว์น้ำในกรุงปักกิ่ง จีนและถูกขนส่งไปห้องปฏิบัติการมีชีวิตอยู่ในปี 2014 เดือนกันยายนในเวลาต่อมา ปลาคาร์ฟได้ตะลึง deheaded ปรับ gutted, filletedและหินกับใส่น้ำเย็นทันที แล่ได้แล้วระบายออกที่ 4 C ใน 3 นาที และเตรียมไว้สำหรับบรรจุภัณฑ์ ที่แล่ (±น้ำหนัก 220 กรัม ประมาณ 12 10 2 cm3) ได้สุ่มแบ่งออกเป็นสองส่วน จากนั้น จะถูกบรรจุในอากาศ (n ¼ 18)ในถุงปิดผนึกแห่งโพลิไวนิลคลอไรด์ (เกี่ยวกับ 250ⅹ200 mm) และภายใต้สุญญากาศ (n ¼ 21) ในถุงฟิล์มพลาสติก/ใยสังเคราะห์(ประมาณ 250 200 มม. มี permeability เป็นออกซิเจนของ40e50 cm3/ m2 ต่อ h 24 ตู้ที่ความชื้นสัมพัทธ์ 85%, 23 C),ตามลำดับ กระเป๋าทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่ 4 ± 1 C. ตัวอย่างสีขาวกล้ามเนื้อ dorsal จากสามแล่ที่ถ่ายแบบสุ่มสำหรับวิเคราะห์คะแนนทางประสาทสัมผัส ค่า pH ระเหยพื้นฐานไนโตรเจน (TVB-N),แจงนับทางจุลชีววิทยา และ biogenic amines ทุก 2 วันอย่างไรก็ตาม ระบุชุมชนจุลินทรีย์ในวันที่ 0, 4 และ8 ตัวอย่าง AP และเวลา 6 และ 12 สำหรับตัวอย่างของ VP2.2 การวิเคราะห์รับความรู้สึกมีลักษณะทางประสาทสัมผัสของแต่ละเนื้อ (สด และปรุงสุก)ประเมินโดยใช้วิธีของ Hong et al. (2012) ปลาสะนากสุกแล่ได้เตรียม โดยการนึ่งใน 10 นาทีที่ 100 C. เจ็ดสมาชิกมีการฝึกอบรมการประเมินสี กลิ่น ความ ยืดหยุ่น และสัณฐานวิทยาของกล้าม เนื้อปลาดิบ ตลอดจนรส กลิ่น และซุปความขุ่นของปลาคาร์ฟสุกแล่ ให้คะแนนแต่ละรายการในสเกลจาก 1 ถึง 5คะแนน คะแนนรวมคะแนน 35.0 ถือเป็นสด ในขณะที่ 15.0ไม่ถือว่าเป็นวงเงินยอมรับต่ำสุด2.3 การกำหนด TVB N และ pHค่า TVB N ถูกวัด โดยการกลั่นไอน้ำขนาดเล็กกึ่งวิธี (Hong et al., 2012) ค่า pH ตรวจพบโดยใช้การเครื่องวัดค่า pH (Mettler Toledo FE20/EL20 เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน)2.4 การกำหนดของ biogenic aminesสกัดและ derivatization ของ biogenic amines (BAs)ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยชิ et al. (2012) ในเวลาต่อมา BAs ถูกกำหนด และ quantified โดยใช้ HPLC (Shimadzu LC-10AShimadzu เกียวโต ญี่ปุ่น) พร้อมเป็น COSMOSIL 5 C 18-PAQคอลัมน์ (4.6 250 mm) และเครื่องตรวจจับการ SPD-10A (V) แอมโมเนียใช้เป็น acetate (0.1 M; A ตัวทำละลาย) และ acetonitrile (ตัวทำละลาย B)ระยะเคลื่อน โปรแกรม elution ไล่ระดับมีดังนี้: 0 min50% B 25 นาที 90% B 35 นาที 90% B 45 นาที 50% เกิด ตัวอย่างพบที่ 254 nm ด้วยอัตราการไหล 0.8 มิลลิลิตร/นาทีและปริมาณการฉีดของ 50 mL ซี 30 อุณหภูมิคอลัมน์2.5 การแจงนับของชุมชนจุลินทรีย์จานเจือจางวิธีไล่โทนสีได้ดำเนินการในตัวอย่างที่ชุมชนจุลินทรีย์โดยใช้วิธีการแจงนับวัง et al. (2014) การแจงนับจุลินทรีย์ทั้งหมด ตัวอย่างชุดdilutions (100 mL) ได้แพร่กระจายไปบนพื้นผิวของสื่อแห้ง ผลรวมตรวจนับได้ (TVC) ถูกกำหนดใน agar จำนวนแผ่น (PCA) และพวกเขาได้ incubated ที่ 30 ± 1 C สำหรับแบคทีเรียกรดแลกติก 72 h. (LAB)ระบุในเท overlaid แผ่นของ MRS agar และ incubatedที่ 30 C สำหรับ 48 h. Pseudomonas sp.ที่กำหนดในลี CFC Selective Agar (CFC) ที่ 20 C สำหรับ 48 h. ไข่เน่าผลิตแบคทีเรียถูกประเมินบนเหล็กกลาง agar (IA); สีดำอาณานิคมผลิต IA ที่ระบุหลังจาก incubating ที่ 20 Cวัน 4 หน่วยขึ้นรูปอาณานิคมทั้งหมดถูกบันทึกเป็นระบบ CFU/กรัม ทั้งหมดสื่อวัฒนธรรมได้จัดทำ โดยเทคโนโลยีชีวภาพบ่อไหCo., Ltd. (ชิงเต่า จีน)2.6 การแยกและระบุของจุลินทรีย์2.6.1 การแยกและทำให้บริสุทธิ์ดีเอ็นเอจากแบคทีเรียแยกต่างหาก และบริสุทธิ์สอดคล้องกับการวิธีของวัง et al. (2014) หลังจากการแจงนับ TVC แบคทีเรียได้แยกต่างหากบน PCA สำหรับรหัส microbiota หลักจากแล่ปลาทับทิมสด (แยก 53), AP แล่เก็บในวันที่ 4 และ 8 (46และ แยก 55 ตามลำดับ), และ จาก VP แล่ตามวัน 612 (40 และ 48 แยก ตามลำดับ), โดยมีเป้าหมายทำให้บริสุทธิ์สายพันธุ์เหล่านี้ ทั้งหมดของอาณานิคมถูกเลือกจากสูงสุดแผ่นที่มักประกอบด้วย 30e100 ล แพร่กระจายเจือจาง PCAใช้การวน inoculation และอ่างย่อยที่ 30 ± 1 C สำหรับh ใน 5 mL ของซุปถั่วเหลือง tryptic (TSB) (Aoboxing Universeen 24e48Bio-Tech Co., Ltd. ปักกิ่ง จีน) หลังจากถูกอ่าง โดยซ้ำแผ่น streaking ย้อมสีกรัม และ microscopy แยกจากแต่ละอย่างที่บริสุทธิ์สำหรับการระบุ โดยยีน 16S rRNAการวิเคราะห์ลำดับ โคโลนี่บริสุทธิ์เดียวถูกย่อยอ่างใน5 mL ของ TSB ที่ 30 ± 1 C สำหรับ 24e48 h2.6.2 การสกัดและรหัสของดีเอ็นเอ โดยยีน 16S rRNAวิเคราะห์ตัวอย่าง 2 mL ของ TSB มีการโอนย้าย แต่ละที่ประกอบด้วยเดียวบริสุทธิ์โคโล ให้เครื่องหมุนเหวี่ยงหลอด ที่มีเซลล์รวบรวม โดย centrifugation ดีเอ็นเอที่สกัดจากแรงเหวี่ยงที่ตะกอนโดยใช้แบคทีเรียดีเอ็นเอแยกชุด (Bomad ชีวภาพเทคโนโลยี Co., Ltd. ปักกิ่ง จีน) ตามของผู้ผลิตคำแนะนำ 1.0% agarose เจ electrophoresis ถูกใช้กำหนดคุณภาพของสารสกัดดีเอ็นเอเหล่านี้ เหล่านี้แยก ซึ่งพบบันไดสว่าง ชัดเจนใน agarose เจ ได้รับเลือกเป็นแม่แบบดีเอ็นเอสำหรับ PCR (TC-512, Techne สหราชอาณาจักร)แบคทีเรีย 16S rRNA ที่ขยาย โดย PCR โดยใช้มาตรฐานสากลรองพื้นไปข้างหน้าจากแบคทีเรีย 27f (50-GAGATTTGATCCTGGCTCAG-30)และพื้นกลับ 1495r (50-CTACGGCTACCTTGTTACGA-30)(Wang et al., 2014) ทั้งหมดที่ oligonucleotide PCR ไพรเมอร์ใช้ในนี้การศึกษาได้รับจาก Bomad เทคโนโลยีชีวภาพ Co., ltd(ปักกิ่ง จีน BBT) ระบบ PCR ได้ตั้งแต่ 12.5 mL2 Taq PCR หลักผสม (ประกอบด้วย thermostable ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสMgCl2, dNTPs บัฟเฟอร์), 1 mL ของแม่แบบดีเอ็นเอ 10.5 mL คู่กลั่นน้ำ และ 0.5 mL ของแต่ละพื้นที่ความเข้มข้นของ 10 มม.ด้วยการปริมาตรรวมปฏิกิริยาของ 25 mL ขยายได้ดำเนินการภายใต้198

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ภายใต้แช่เย็นเงื่อนไขการจัดเก็บแอโรบิกหลายแกรมลบจำพวก Pseudomonas โดยเฉพาะอย่างยิ่งเชื้อ Aeromonas, Shewanella, Enterobacteriaceae, ครองจุลินทรีย์เน่าเสียของน้ำจืดและปลาทะเล (Noseda et al, 2012;.. วัง et al, 2014). แต่สูญญากาศ บรรจุภัณฑ์ที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของแอโรบิกแบคทีเรียทั่วไปอยู่ในปลาที่มีผลในการเพิ่มขึ้นของแบคทีเรียแกรมบวกที่สามารถหายใจได้ดีกว่าแกรมลบแบคทีเรียในรูปแบบของบรรจุภัณฑ์นี้(Lyhs, et al., 2002;. คทา, et al, 2012 ; Noseda et al, 2012).. เกี่ยวกับปลาคาร์พทั่วไปมาห์มูดอัลเอต (2004) การวิเคราะห์microbiota เน่าเสียที่ก่อให้เกิดในผิวหนังเหงือกและลำไส้ พวกเขาวิเคราะห์ขึ้นอยู่ส่วนใหญ่ในวิธีทางจุลชีววิทยาแบบดั้งเดิมเช่นการนับที่ทำงานได้แผ่นแยกและบัตรประจำตัวชีวเคมี. อย่างไรก็ตามวัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้มีลักษณะและตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงในชุมชนจุลินทรีย์ของ AP และรองประธานฝ่ายเนื้อปลาคาร์พร่วมกันเก็บไว้ที่4? C โดยใช้การรวมกันของ culturebased และ 16S rRNA วิธีการวิเคราะห์ยีน นอกจากนี้เรายังหวังว่าจะได้รับความรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับจุลินทรีย์ที่โดดเด่นที่สายพันธุ์ระดับเพื่อให้เราสามารถพัฒนาวิธีการควบคุมที่เหมาะสม. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 การเก็บตัวอย่างและบรรจุภัณฑ์ยี่สิบปลาคาร์พทั่วไป (น้ำหนัก 1,150 ± 180 กรัมความยาว 43 ± 1 ซม.) ที่ได้รับจากตลาดผลิตภัณฑ์สัตว์น้ำในกรุงปักกิ่งประเทศจีนและถูกส่งไปยังห้องปฏิบัติการที่มีชีวิตอยู่ในเดือนกันยายน 2014 ต่อมาเป็นปลาคาร์พตะลึง deheaded ปรับขนาด เสียใจมาก, เสา, และล้างทันทีด้วยน้ำหมันเย็น เนื้อได้รับการระบายน้ำจากนั้นวันที่ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาทีและเตรียมความพร้อมสำหรับบรรจุภัณฑ์ เนื้อ (น้ำหนัก 220 ± 35 กรัมประมาณ 12 10 2 cm3) ได้รับการสุ่มแบ่งออกเป็นสองส่วน จากนั้นพวกเขาจะถูกบรรจุอยู่ในอากาศ (n ¼ 18) ในการปิดผนึกอย่างดีถุงพีวีซี (ประมาณ250ⅹ200มิลลิเมตร) และภายใต้สูญญากาศ(n ¼ 21) ในถุงพลาสติกฟิล์ม / ใยสังเคราะห์(ประมาณ 250 200 มมมีการซึมผ่านของออกซิเจนของ40e50 cm3 / m2 ต่อ 24 ชั่วโมง / ตู้เอทีเอ็มที่ 85% ความชื้นสัมพัทธ์ 23? C), ตามลำดับ กระเป๋าทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่ 4 ± 1 องศาเซลเซียส ตัวอย่างสีขาวกล้ามเนื้อหลังจากสามเนื้อถูกนำมาสุ่มสำหรับการวิเคราะห์คะแนนทางประสาทสัมผัส, ค่าพีเอชไนโตรเจนพื้นฐานรวมระเหย (TVB-N) นับจุลชีววิทยาและเอมีนไบโอจีทุก 2 วัน. แต่กลุ่มจุลินทรีย์ที่ถูกระบุในวันที่ 0, 4 และ8 สำหรับตัวอย่าง AP และในวันที่ 6 และ 12 สำหรับตัวอย่าง VP. 2.2 ประสาทสัมผัสการวิเคราะห์ลักษณะทางประสาทสัมผัสของแต่ละเนื้อ (สดและสุก) ได้รับการประเมินโดยใช้วิธีการของฮ่องกงและอัล (2012) ปลาคาร์พปรุงเนื้อได้จัดทำขึ้นโดยการนึ่งเป็นเวลา 10 นาทีที่ 100 องศาเซลเซียส เซเว่นสมาชิกได้รับการฝึกฝนในการประเมินสีกลิ่นความยืดหยุ่นและสัณฐานวิทยาของกล้ามเนื้อปลาดิบเช่นเดียวกับรสชาติกลิ่นและน้ำซุปขุ่นของเนื้อปลาคาร์พสุกคะแนนในแต่ละระดับ1-5 จุด คะแนนรวมของ 35.0 จุดได้รับการพิจารณาสดในขณะที่ 15.0 ได้รับการยกย่องว่าเป็นวงเงินที่ต่ำสุดที่ยอมรับได้. 2.3 ความมุ่งมั่นของ TVB-N และค่า pH ค่า TVB-N วัดโดยการกลั่นไอน้ำกึ่งไมโครวิธี(Hong et al., 2012) ค่าพีเอชที่ได้รับการตรวจพบโดยใช้เครื่องวัดค่า pH แบบดิจิตอล (Mettler Toledo FE20 / EL20, เซี่ยงไฮ้, จีน). 2.4 ความมุ่งมั่นของเอมีนไบโอจีสกัดและอนุพันธ์ของเอมีนไบโอจี (BAs) ได้รับการดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยชิเอตอัล (2012) ต่อมา BAs ถูกกำหนดและวัดโดยใช้วิธีHPLC (Shimadzu LC-10A; Shimadzu เกียวโตญี่ปุ่น) พร้อมกับ COSMOSIL 5C18-PAQ (4.6 250 มิลลิเมตร) และคอลัมน์ SPD-10A (V) เครื่องตรวจจับ แอมโมเนียมอะซิเตท (0.1 M; ตัวทำละลาย A) และ acetonitrile (ตัวทำละลาย B) ถูกนำมาใช้เป็นขั้นตอนที่มือถือ โปรแกรมชะลาดเป็นดังนี้: 0 นาที50% B; 25 นาที, 90% B; 35 นาที, 90% B; 45 นาที, 50% บีกลุ่มตัวอย่างที่ตรวจพบที่254 นาโนเมตรที่มีอัตราการไหล 0.8 มิลลิลิตร / นาทีและปริมาณการฉีด50 มล อุณหภูมิคอลัมน์เป็น 30 องศาเซลเซียส. 2.5 การแจงนับของชุมชนจุลินทรีย์จานวิธีการไล่ระดับสีเจือจางได้ดำเนินการกับตัวอย่างที่จะระบุกลุ่มจุลินทรีย์ที่แตกต่างกันโดยใช้วิธีการของวังet al, (2014) สำหรับการแจงนับจุลินทรีย์ทั้งหมดตัวอย่างอนุกรมเจือจาง (100 มิลลิลิตร) กระจายอยู่บนพื้นผิวของสื่อแห้ง รวมนับทำงาน (TVC) ได้รับการพิจารณาในการนับจานเลี้ยงเชื้อ (PCA) และพวกเขาได้รับการบ่มที่30 ± 1 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 72 ชั่วโมง แบคทีเรียกรดแลคติก (LAB) ที่ถูกระบุในแผ่นที่วางซ้อนเทของ MRS agar และบ่มที่อุณหภูมิ30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง SP Pseudomonas ได้รับการพิจารณาในPseudomonas CFC เลือกวุ้น (CFC) ที่ 20 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง H2S ผลิตแบคทีเรียที่ได้รับการประเมินในสื่อวุ้นเหล็ก(IA); สีดำอาณานิคมผลิตในไอโอวาถูกแจกแจงหลังจากบ่มที่ 20 องศาเซลเซียสเป็นเวลา4 วัน อาณานิคมทั้งหมดสร้างหน่วยที่ถูกบันทึกไว้ตาม log CFU / g ทั้งหมดของสื่อวัฒนธรรมที่ถูกจัดทำโดยไห่บ่อเทคโนโลยีชีวภาพจำกัด (ชิงเต่า, จีน). 2.6 การแยกและจำแนกจุลินทรีย์2.6.1 การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ดีเอ็นเอแบคทีเรียถูกโดดเดี่ยวและบริสุทธิ์ให้สอดคล้องกับวิธีการของวังet al, (2014) หลังจากนับ TVC แบคทีเรียถูกแยกบนPCA เพื่อระบุตัวตนของ microbiota ที่โดดเด่นจากเนื้อปลาคาร์พสด(53 แยก) เนื้อ AP เก็บไว้ในวันที่ 4 และ 8 (46 และ 55 สายพันธุ์ตามลำดับ) และจากเนื้อ VP เก็บไว้ในวันที่ 6 และ 12 (40 และ 48 สายพันธุ์ตามลำดับ) โดยมีเป้าหมายของบริสุทธิ์สายพันธุ์เหล่านี้ ทั้งหมดของอาณานิคมได้รับการคัดเลือกจากที่สูงที่สุดลดสัดส่วนจานแพร่กระจาย PCA ซึ่งมักจะมี 30e100 ไอโซเลท, ใช้ห่วงการฉีดวัคซีนและย่อยเลี้ยงวันที่ 30 ± 1 องศาเซลเซียสสำหรับ24e48 ชั่วโมงใน 5 มิลลิลิตรของน้ำซุปถั่วเหลือง tryptic (TSB) (Aoboxing Universeen ไบโอเทค จำกัด , ปักกิ่ง, จีน) หลังจากที่ถูกเลี้ยงด้วยซ้ำแผ่นลายเส้น, การย้อมสีแกรมและกล้องจุลทรรศน์ที่ไอโซเลทจากตัวอย่างแต่ละบริสุทธิ์เพื่อระบุตัวตน16S rRNA ยีนวิเคราะห์ลำดับ อาณานิคมบริสุทธิ์เดียวเป็นย่อยที่เลี้ยงใน5 มิลลิลิตร TSB วันที่ 30 ± 1 องศาเซลเซียสสำหรับ 24e48 ชม. 2.6.2 การสกัดและการตรวจสอบดีเอ็นเอของยีน 16S rRNA วิเคราะห์2 มิลลิลิตรตัวอย่างของวัฒนธรรม TSB ถูกย้ายแต่ละที่มีอาณานิคมบริสุทธิ์เดียวหลอดหมุนเหวี่ยงที่เซลล์ถูกเก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยง ถูกสกัดดีเอ็นเอจากแรงเหวี่ยงตะกอนโดยใช้ชุดการสกัดดีเอ็นเอของเชื้อแบคทีเรีย (Bomad ชีวภาพเทคโนโลยีจำกัด , ปักกิ่ง, จีน) ตามของผู้ผลิตคำแนะนำ 1.0% ข่าวคราว agarose ถูกใช้ในการตรวจสอบคุณภาพของเหล่านี้สารสกัดดีเอ็นเอ สารสกัดเหล่านี้ซึ่งแสดงให้เห็นชัดเจนบันไดสดใสในเจล agarose ถูกเลือกเป็นดีเอ็นเอแม่แบบสำหรับPCR (TC-512, Techne สหราชอาณาจักร). แบคทีเรีย 16S rRNA ถูกขยายโดยวิธี PCR โดยใช้สากลไพรเมอร์ไปข้างหน้าแบคทีเรีย27 (50 - GAGATTTGATCCTGGCTCAG-30) และไพรเมอร์กลับ 1495r (50 -CTACGGCTACCTTGTTACGA-30) (Wang et al., 2014) ทั้งหมด oligonucleotide PCR ไพรเมอร์ที่ใช้ในการนี้การศึกษาที่ได้รับจากBomad เทคโนโลยีชีวภาพ จำกัด(กรุงปักกิ่งประเทศจีน; BBT) ระบบ PCR แบ่งเป็น 12.5 มิลลิลิตร2 Taq PCR โทผสม (ที่มีดีเอ็นเอโพลิเมอร์ร้อน, MgCl2, dNTPs บัฟเฟอร์) 1 มิลลิลิตรของดีเอ็นเอแม่แบบ 10.5 มิลลิลิตรกลั่นคู่น้ำและ0.5 มิลลิลิตรของแต่ละไพรเมอร์ที่มีความเข้มข้น 10 มม ที่มีปริมาณการเกิดปฏิกิริยาทั้งหมด25 มิลลิลิตร ขยายได้รับการดำเนินการภายใต้198

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ภายใต้สภาพการเก็บแช่เย็น แอโรบิกหลายกรัมลบ
สกุล โดยเฉพาะเชื้อ Pseudomonas , shewanella ผิดเพี้ยน
, , , มีการเน่าเสียของน้ำจืดและจุลินทรีย์
ปลาทะเล ( noseda et al . , 2012 ; Wang et al . , 2010 ) .
แต่บรรจุภัณฑ์สูญญากาศสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียแอโรบิก
ทั่วไปปัจจุบัน ปลา ผลเพิ่มขึ้นใน
กรัมบวกแบคทีเรียที่สามารถหายใจได้ดีกว่าแบคทีเรียแกรมลบ
ในบรรจุภัณฑ์ชนิดนี้ ( lyhs et al . , 2002 ; เมส et al . ,
2012 ; noseda et al . , 2012 ) .
เกี่ยวกับปลาไนมาห์ , et al . ( 2004 ) วิเคราะห์
ที่ก่อให้เกิดการเน่าเสียในไมโครไบโ ้าผิวหนัง เหงือก และลำไส้ การวิเคราะห์ของพวกเขา
ขึ้นอยู่กับส่วนใหญ่ในวิธีทางจุลชีววิทยาดั้งเดิม
เช่นแผ่นได้นับ , การแยกและลักษณะทางชีวเคมี
อย่างไรก็ตาม วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้คือ เพื่ออธิบายลักษณะและ
ตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงในชุมชนจุลินทรีย์ของ AP และ VP
ปลาปลาคาร์พที่พบเก็บไว้ที่ 4
C โดยใช้การรวมกันของ 16S rRNA ยีนและ culturebased
การวิเคราะห์วิธีการ เราก็หวังที่จะได้รับความรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับจุลินทรีย์

เด่นในชนิดระดับเพื่อให้เราสามารถพัฒนาวิธีการควบคุมที่เหมาะสม .
2 วัสดุและวิธีการ
2.1 . การสุ่มตัวอย่างและบรรจุภัณฑ์
ยี่สิบปลาคาร์พสามัญ ( 1150 ±น้ำหนัก 180 กรัม ความยาว 43 ± 1 ซม. )
ที่ได้รับจากตลาดสินค้าสัตว์น้ำในปักกิ่ง , จีน
และส่งไปปฏิบัติการทั้งเป็นกันยายน 2014
ต่อมาปลาคาร์พได้ตะลึง deheaded , ปรับขนาด , gutted ถลก
, ,และ ล้างทันทีด้วยน้ำไม่เย็น เนื้อเป็นเนื้อที่ 4

แล้วเป็นเวลา 3 นาที และเตรียมพร้อมสำหรับการบรรจุภัณฑ์
เนื้อ ( น้ำหนัก 220 ± 35 กรัม ประมาณ 12 10 2 cm3 สุ่ม

) แบ่งออกเป็นสองส่วน แล้วพวกเขาก็ถูกบรรจุอยู่ในอากาศ ( N ¼ 18 )
ในถุงปิดผนึกโพลีไวนิลคลอไรด์ ( ประมาณ 250 ⅹ 200 มม. ) และ
ภายใต้สุญญากาศ ( N ¼ 21 ) ในถุงโพลี /
ด้วยฟิล์ม( ประมาณ 250 200 มิลลิเมตร มีออกซิเจนซึมผ่านได้ของ 40e50 cm3

/ m2 / / ตู้ 24 H ที่ 85 % ความชื้น , 23
C )
) ทั้งหมดกระเป๋าเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส จำนวน 1
±สีขาว
หลังกล้ามเนื้อจากสามเนื้อ นำมาสุ่มเพื่อวิเคราะห์
คะแนนค่า พีเอช ประสาทสัมผัสทั้งหมดระเหยพื้นฐานไนโตรเจน ( tvb-n )
แจงทางจุลชีววิทยาและเอมีนทุก 2 วัน
อย่างไรก็ตามชุมชนจุลินทรีย์ที่ถูกระบุในวันที่ 0 , 4 และ
8 ตัวอย่าง AP และในวันที่ 6 และ 12 อย่าง VP .
2.2 . การวิเคราะห์ลักษณะทางประสาทสัมผัสของแต่ละชิ้น

( สดและสุก ) ถูกประเมินโดยใช้วิธีฮง et al . ( 2012 ) ปลาคาร์พปลาสุก
เตรียมนึ่ง 10 นาทีที่ 100
C . 7
สมาชิกถูกฝึกให้ใช้ สี กลิ่น มีความยืดหยุ่นและ
ลักษณะของกล้ามเนื้อปลาดิบ รวมทั้ง กลิ่น รส และความขุ่นของน้ำซุป
ปลาคาร์พปลาสุก , คะแนนที่แต่ละจากระดับ 1 ถึง 5
จุด คะแนนรวมของ 35.0 จุดถือว่าสด ในขณะที่กิจ
ถือเป็นขีดจำกัดที่ยอมรับได้ถูกที่สุด
2.3 การกำหนด tvb-n และ pH
tvb-n ค่าถูกวัดโดยวิธีไมโครกลั่นไอน้ำกึ่ง
( ฮง et al . , 2012 )ค่า pH ที่ถูกตรวจพบโดยใช้
เครื่องวัดค่าพีเอช ( เมทเลอร์ โทเลโด fe20 / el20 , เซี่ยงไฮ้ , จีน ) .
2.4 . การสกัดและการหาเอมีน
ลงกับของเอมีน ( BAS )
ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยซือ et al . ( 2012 ) ต่อมามีการกำหนดเป็น
และเชิงปริมาณ โดยใช้เทคนิค ( Shimadzu lc-10a ;
Shimadzu , เกียวโต , ญี่ปุ่น ) พร้อมกับ cosmosil 5c18-paq
( 46 250 มม. ) คอลัมน์และ spd-10a ( V ) เครื่องตรวจจับ แอมโมเนียมอะซิเตท ( 0.1 M
; ตัวทำละลาย ) และไน ( ตัวทำละลาย B ) ซึ่งใช้
เฟสเคลื่อนที่ โปรแกรมไล่สีได้มาดังนี้ 0 นาที
50 % B ; 25 นาที 90 % B ; 35 นาที 90 % B ; 45 นาที , 50 % B .
ตรวจพบตัวอย่างที่ 254 nm ด้วยอัตรา 0.8 มิลลิลิตรต่อนาทีและ
ฉีดปริมาณ 50 มล. คอลัมน์ อุณหภูมิ 30
C .
2.5การเจือจางจุลินทรีย์ชุมชน
จานสีวิธีการทดลองกับตัวอย่างประชากรจุลินทรีย์
แจกแจงแตกต่างกันโดยใช้วิธีการ
Wang et al . ( 2014 ) สำหรับจุลินทรีย์ใช้ ตัวอย่างของอนุกรม
เจือจาง ( 100 ml ) ได้แพร่กระจายบนพื้นผิวของสื่อที่แห้ง รวม ( TVC )
ได้นับถูกกำหนดใน Planetmath reference ( PCA ) และ
พวกเขาถูกบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 72 ชั่วโมง ± 1
) แบคทีเรียแลกติก
ถูกระบุในจานของนางวุ้นหุ้มเทบ่ม
ที่ 30
เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ดังนั้น Pseudomonas sp . พบว่าในส่วนของ CFC
เลือก ( CFC ) ที่ 20
เป็นเวลา 48 ชั่วโมง h2s ผลิต
แบคทีเรียได้แก่ บนอาหารวุ้นเหล็กกลาง ( IA ) ; อาณานิคมสีดำ
ผลิตใน IA คือระบุหลังจากการแช่ที่ 20
C
เป็นเวลา 4 วันรูปทั้งหมดถูกบันทึกไว้ในฐานะอาณานิคมหน่วย log CFU / g .
ของทุกวัฒนธรรมสื่อจัดโดย ไฮโบชีวภาพเทคโนโลยี
จำกัด ( ชิงเต่า , จีน ) .
2.6 การแยกและจำแนกเชื้อจุลินทรีย์
ดูแล . การแยกและการแยกและทำให้บริสุทธิ์ดีเอ็นเอ
แบคทีเรียตาม
วิธี Wang et al . ( 2014 ) หลังจากการใช้ แบคทีเรียถูก
แยกบน PCA สำหรับการจำแนกของไมโครไบโ ้าเด่นจาก
ปลาปลาคาร์พสด ( 53 ไอโซเลท ) , AP เนื้อเก็บไว้ในวันที่ 4 และ 8 ( 46
55 ไอโซเลต ตามลำดับ ) และจาก VP เนื้อเก็บไว้ในวัน 6
12 ( 40 และ 48 สายพันธุ์ ตามลำดับ ) ด้วยเป้าหมาย
สายพันธุ์บริสุทธิ์ เหล่านี้ ทั้งหมดของอาณานิคมได้ถูกเลือกจากสูงสุด
ซึ่งมักจะมีการกระจายระบบจาน 30e100 สายพันธุ์
ใช้ใส่ห่วง และย่อยเลี้ยงที่ 30 ± 1
C
24e48 H 5 ml ของน้ำซุปถั่วเหลืองอาหาร ( TSB ) ( aoboxing universeen
ไบโอเทค จำกัด , ปักกิ่ง , จีน ) หลังจากการเพาะเลี้ยงโดยซ้ำ
จาน streaking แกรม staining และกล้องจุลทรรศน์ , ไอโซเลตจาก
แต่ละจำนวนบริสุทธิ์เพื่อกำหนดโดยยีน 16S rRNA
การวิเคราะห์ลำดับ โสดบริสุทธิ์อาณานิคมถูกย่อยในการเพาะเลี้ยง
5 ml ของ TSB ที่ 30 ± 1
C 24e48 H .
ดาวน์โหลด . การสกัดและจำแนกการวิเคราะห์ดีเอ็นเอด้วยเบส 16S rRNA ยีน

2 มล ตัวอย่างของวัฒนธรรม TSB โอนแต่ละที่มี
โสดบริสุทธิ์อาณานิคม การ centrifuge หลอดที่เซลล์มี
รวบรวมโดยการปั่นเหวี่ยง ดีเอ็นเอจากแรงเหวี่ยง
ตะกอนโดยใช้แบคทีเรียชุดสกัดดีเอ็นเอ ( bomad ชีวภาพ
เทคโนโลยี จำกัด , ปักกิ่ง , จีน ) ตามคำแนะนำของ
ผู้ผลิต 1.0% ( gel electrophoresis ใช้
ตรวจสอบคุณภาพ สกัด DNA เหล่านี้ สารสกัดเหล่านี้ซึ่ง
แสดงชัดเจน สดใส บันไดในเจล ถูกเลือกให้เป็น
ดีเอ็นเอแม่แบบสำหรับ PCR ( tc-512 techne ,
, UK )แบคทีเรียที่ถูกขยายโดยวิธี PCR โดยใช้ 16S rRNA สากล
แบคทีเรียส่งต่อรองพื้น 27f ( 50 gagatttgatcctggctcag-30
-
)
และย้อนกลับ ไพรเมอร์ 1495r ( 50 ctacggctaccttgttacga-30
-
)
( Wang et al . , 2010 ) ทั้งหมด ซึ่ง PCR ไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษา
ได้รับจาก bomad ชีววิทยา Technology Co . , Ltd .
( ปักกิ่ง , จีน ; ฯ ) ระบบซึ่งประกอบด้วย 12 ml
2 ) อาจารย์ผสมได้ดี ( ที่มีใน DNA polymerase
ชุด dntps , บัฟเฟอร์ ) 1 ml ของดีเอ็นเอแม่แบบซ้อนกลั่น
น้ำ 10.5 มิลลิลิตร และ 0.5 ml ของแต่ละ primer ความเข้มข้น 10 มม. มีปริมาณทั้งสิ้น 25 มิลลิลิตรปฏิกิริยา

198 ( แสดงภายใต้