The aim of this work was to develop

The aim of this work was to develop and optimize a direct ELISA assay and to define balanced screening conditions for the routine screening of MAPK inhibitors. This method adapted the protocol developed earlier by Peifer et al. [7]. This assay used so far is an indirect ELISA assay using a primary polyclonal anti-phospho ATF-2 antibody to detect the substrate phosphorylation and a secondary polyclonal antibody conjugated with an alkaline phosphatase. To increase the specificity of the assay and eliminate cross reactivities of secondary antibodies, a labeled monoclonal antibody was used to detect the substrate phosphorylation directly, which recognizes a single epitope also contribute to the assay stability. The assay parameters optimized to achieve stable screening conditions included the coating of the ATF-2 substrate to the plate as well as the buffer used for the antibody dilution that guarantees the highest activity of the conjugated peroxidase and thus results in an increase of the signal–noise ratio of the antibody. Also, the amount of JNK3, ATF-2 and the monoclonal anti-phospho ATF-2 (Thr69/71) peroxidase antibody in the assay, as well as the incubation time and the ATP concentrations were optimized. Each assay was carried out as described in the protocol by varying the parameter to be determined. The reaction volume added in each well and each step of the assay was 50 μl. The amount of ATF-2 was determined using a fixed, non-limiting ATP concentration (150 μM) keeping the kinase at 10 ng/50 μl reaction volume. The substrate concentrations were tested from 1.25 to 40 μg/ml. The monoclonal anti-phospho ATF-2 (Thr69/71) peroxidase antibody was titrated (1:500 to 1:64,000), keeping the other reaction parameters constant. The Km ATP was measured at a saturating concentration of substrate ATF-2 (20 μg/ml) keeping the kinase concentration constant at 200 ng/ml and varying the ATP concentration from 0.01 μM to 1000 μM. The enzyme concentration was determined by varying the concentrations from 6.25 to 1600 ng/ml, otherwise keeping the optimized assay conditions. Last but not least, the assay was run varying the incubation time and keeping the optimized assay parameters (10 μg/ml ATF-2, 200 ng/ml JNK3, 10 μM ATP and anti-phospho ATF-2 Thr69/71 – 1:5000). To achieve the desired intensity of color from the peroxidase reaction, the pH of blocking buffer (BB) was adjusted with 1 M HCl for the antibody dilution. Three buffer solutions were prepared with pH values of 7.5, 7.0 and 6.5. To determine the best incubation time for immobilize the substrate ATF-2 onto the wells, plates were incubated overnight at 4 °C or for 1.5 h at 37 °C.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

จุดมุ่งหมายของงานนี้คือเพื่อ พัฒนา และเพิ่มประสิทธิภาพการทดสอบ ELISA โดยตรง และเพื่อกำหนดความสมดุลตรวจเงื่อนไขสำหรับการคัดกรองเป็นประจำของ MAPK inhibitors วิธีการนี้ดัดแปลงโพรโทคอลพัฒนาก่อนหน้านี้โดย Peifer et al. [7] ทดสอบนี้ใช้เพื่อให้ห่างไกลเป็นการทดสอบ ELISA อ้อมใช้แอนติบอดี ATF 2 แบบ polyclonal หลัก phospho ป้องกันการ phosphorylation พื้นผิวและแอนติบอดี polyclonal รองกลวง ด้วยฟอสฟาเตสเป็นด่าง เพิ่ม specificity ของการวิเคราะห์ และกำจัด reactivities ไขว้ของแอนตี้รอง แอนติบอดี monoclonal ป้ายถูกใช้เพื่อตรวจสอบพื้นผิวการ phosphorylation โดยตรง ซึ่งรู้จัก epitope เดียวร่วมทดสอบความมั่นคง วิเคราะห์พารามิเตอร์ที่ปรับให้มีสภาพมั่นคงตรวจรวมเคลือบของ ATF 2 พื้นผิวแผ่นเป็นบัฟเฟอร์ที่ใช้สำหรับเจือจางแอนติบอดี ที่รับประกันสูงสุดกิจกรรมของ peroxidase กลวงดังนั้น ผลในการเพิ่มขึ้นของอัตราส่วนสัญญาณ – เสียงของแอนติบอดีที่ ยัง จำนวน JNK3, ATF 2 และแอนติบอดี peroxidase ATF-2 (Thr69/71) ต่อต้าน phospho โมโนใน วิเคราะห์ และที่ความเข้มข้นของ ATP เป็นเวลาบ่มได้เหมาะ ทดสอบแต่ละที่ดำเนินตามที่อธิบายไว้ในโพรโทคอล โดยพารามิเตอร์การกำหนดแตกต่างกัน 50 μl ปริมาณปฏิกิริยาที่เพิ่มในแต่ละดีและแต่ละขั้นตอนของการวิเคราะห์ได้ จำนวน ATF 2 ได้กำหนดใช้ถาวร ไม่จำกัด ATP เข้มข้น (150 μM) รักษา kinase ที่ 10 ng/50 μl ปฏิกิริยาปริมาตร ความเข้มข้นขั้นทดสอบจาก 1.25 ไป μg 40 ml โมโนต่อต้าน-phospho ATF-2 (Thr69/71) peroxidase แอนติบอดีถูก titrated (1: 500 เพื่อ 1:64, 000) , รักษาปฏิกิริยาพารามิเตอร์คง ATP กิโลเมตรเป็นวัดที่ความเข้มข้น saturating ของพื้นผิว ATF-2 (20 μg/ml) ให้คงความเข้มข้น kinase ที่ 200 ng/ml และแตกต่างกันที่ความเข้มข้น ATP จาก 0.01 μM เพื่อ 1000 μM ความเข้มข้นเอนไซม์ที่ถูกกำหนด โดยความเข้มข้นจาก 6.25 1600 ng/ml หรือ รักษาสภาพวิเคราะห์ให้เหมาะเพื่อการแตกต่างกัน สุดท้าย แต่ไม่น้อย ทดสอบการรันเวลาฟักตัวแตกต่างกัน และการรักษาให้เหมาะวิเคราะห์พารามิเตอร์ (10 ml μg ATF-2, 200 ng/ml JNK3, 10 μM ATP และป้องกัน phospho ATF-2 Thr69/71 – 1:5000) เพื่อระบุความเข้มของสีจากปฏิกิริยา peroxidase, pH ของบัฟเฟอร์บล็อก (BB) ถูกปรับปรุง ด้วย 1 M HCl สำหรับเจือจางแอนติบอดี โซลูชั่นบัฟเฟอร์สามขึ้นพร้อมค่า pH 7.5, 7.0 และ 6.5 กำหนด เวลาคณะทันตแพทยศาสตร์ดีที่สุดสำหรับ immobilize พื้นผิวที่มี incubated 2 ATF ลงบ่อ แผ่นค้างคืน ที่ 4 ° C หรือ 1.5 h ที่ 37 องศาเซลเซียส

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

จุดมุ่งหมายของงานนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาและเพิ่มประสิทธิภาพการทดสอบ ELISA โดยตรงและการกำหนดเงื่อนไขการคัดกรองความสมดุลสำหรับการตรวจคัดกรองตามปกติของสารยับยั้ง MAPK วิธีการนี​​้จะปรับตัวโปรโตคอลที่พัฒนาโดยก่อนหน้านี้ Peifer และคณะ [7] การทดสอบนี้จะใช้เพื่อให้ห่างไกลการทดสอบ ELISA ทางอ้อมโดยใช้หลักโพลีต่อต้าน PHOSPHO แอนติบอดี ATF-2 เพื่อตรวจหาสารตั้งต้น phosphorylation และแอนติบอดีโพลีรองผันกับด่าง phosphatase เพื่อเพิ่มความจำเพาะของการทดสอบและขจัดปฏิกิริยาข้ามของแอนติบอดีรองแอนติบอดีที่ติดฉลากถูกใช้ในการตรวจสอบ phosphorylation พื้นผิวโดยตรงซึ่งตระหนัก epitope เดียวยังนำไปสู่​​ความมั่นคงทดสอบ พารามิเตอร์การทดสอบที่ดีที่สุดเพื่อให้บรรลุเงื่อนไขการตรวจคัดกรองที่มีเสถียรภาพรวมถึงการเคลือบพื้นผิวของ ATF-2 แผ่นและความเป็นบัฟเฟอร์ที่ใช้สำหรับการเจือจางแอนติบอดีที่รับประกันกิจกรรมสูงสุดของ peroxidase ผันและผลดังนั้นในการเพิ่มขึ้นของ Signal- เสียงอัตราส่วนของแอนติบอดี นอกจากนี้ปริมาณของ JNK3, ATF-2 และโมโนโคลนอลต่อต้าน PHOSPHO ATF-2 (Thr69 / 71) แอนติบอดี peroxidase ในการทดสอบเช่นเดียวกับเวลาฟักตัวและความเข้มข้นของเอทีพีได้รับการปรับให้เหมาะสม การทดสอบแต่ละคนได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ในโปรโตคอลที่แตกต่างกันโดยพารามิเตอร์ที่จะได้รับการพิจารณา ปริมาณการเกิดปฏิกิริยาเพิ่มเข้ามาในแต่ละดีและขั้นตอนของการทดสอบแต่ละ 50 ไมโครลิตร ปริมาณของ ATF-2 ถูกกำหนดโดยใช้คงที่ไม่ จำกัด เอทีพีเข้มข้น (150 ไมครอน) การรักษาไคเนสที่ 10 ng / 50 ไมโครลิตรปริมาณการเกิดปฏิกิริยา ความเข้มข้นของสารตั้งต้นที่ถูกทดสอบ 1.25-40 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร โมโนโคลนอลต่อต้าน PHOSPHO ATF-2 (Thr69 / 71) แอนติบอดี peroxidase ถูกปรับขนาด (1: 500 ถึง 1: 64,000), การรักษาพารามิเตอร์ปฏิกิริยาอื่น ๆ อย่างต่อเนื่อง Km เอทีพีได้รับการวัดที่มีความเข้มข้นอิ่มตัวของพื้นผิว ATF-2 (20 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร) การรักษาความเข้มข้นของไคเนสคงที่ที่ 200 ng / มิลลิลิตรและแตกต่างกันความเข้มข้นเอทีพีจาก 0.01 ไมครอนถึง 1000 ไมครอน ความเข้มข้นของเอนไซม์ที่ถูกกำหนดโดยความเข้มข้นแตกต่างกัน 6.25-1600 ng / มลมิฉะนั้นการรักษาสภาพการทดสอบที่ดีที่สุด สุดท้าย แต่ไม่น้อย, การทดสอบที่ดำเนินการที่แตกต่างกันเวลาบ่มและการเก็บรักษาพารามิเตอร์การทดสอบที่ดีที่สุด (10 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร ATF-2, 200 ng / มล JNK3, 10 ไมครอนเอทีพีและ anti-PHOSPHO ATF-2 Thr69 / 71-1: 5000) เพื่อให้บรรลุความเข้มที่ต้องการของสีจากปฏิกิริยา peroxidase ค่า pH ของการปิดกั้นกันชน (BB) ได้รับการปรับปรุงด้วย 1 M HCl เจือจางสำหรับแอนติบอดี สามสารละลายบัฟเฟอร์ได้จัดทำขึ้นโดยมีค่าพีเอช 7.5, 7.0 และ 6.5 การตรวจสอบเวลาการบ่มที่ดีที่สุดสำหรับลื่อสารตั้งต้น ATF-2 บนหลุม, จานถูกบ่มค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียสหรือ 1.5 ชั่​​วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

งานวิจัยนี้มีจุดมุ่งหมายเพื่อพัฒนาและเพิ่มประสิทธิภาพโดยตรงต่อการกำหนดวิธีและเงื่อนไขการตรวจคัดกรองที่สมดุลสำหรับขั้นตอนของ mapk ตัวยับยั้ง วิธีนี้ใช้โปรโตคอลที่พัฒนาก่อนหน้านี้ โดย peifer et al . [ 7 ]วิธีนี้ใช้เพื่อให้ห่างไกลเป็นวิธี indirect ELISA ) โดยใช้หลักใช้แอนติบอดีต่อต้าน phospho atf-2 ตรวจสอบสารฟอสโฟริเลชันและมัธยมศึกษาใช้แอนติบอดี conjugated alkaline phosphatase ด้วย . เพื่อเพิ่มความจำเพาะของแบคทีเรียและขจัดข้ามคุณสมบัติชนิดทุติยภูมิเป็นป้ายโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ใช้ตรวจสอบสารฟอสโฟริเลชันโดยตรงซึ่งรู้จักไวรัสเดียวยังนำไปสู่การทดสอบเสถียรภาพวิเคราะห์พารามิเตอร์ที่ดีที่สุดเพื่อให้บรรลุเงื่อนไขการมั่นคงรวมเคลือบพื้นผิว atf-2 ไปยังจานเป็นบัฟเฟอร์สำหรับการใช้แอนติบอดีที่รับประกันกิจกรรมสูงสุดของ conjugated peroxidase และดังนั้นผลในการเพิ่มขึ้นของสัญญาณและสัญญาณรบกวนของแอนติบอดี นอกจากนี้ ปริมาณของ jnk3 ,atf-2 และโมโนโคลนอลแอน phospho atf-2 ( thr69 / 71 ) peroxidase แอนติบอดีในการทดสอบ รวมทั้งระยะเวลาและปริมาณ ATP ที่ปรับให้เหมาะสม ในแต่ละการทดสอบได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ในพิธีสาร โดยการแปรพารามิเตอร์ที่จะกำหนด ปฏิกิริยาปริมาณเพิ่มในแต่ละและทุกขั้นตอน ( 50 μ L . จำนวน atf-2 ตั้งใจใช้ถาวรไม่จํากัดปริมาณ ATP ( 150 μ M ) ทำให้ไคเนสที่ 10 ng / 50 μชั้นปฏิกิริยา ปริมาณ พื้นผิวโดยมีการทดสอบจาก 1.25 μ 40 g / ml และโมโนโคลนอลแอน phospho atf-2 ( thr69 / 71 ) peroxidase แอนติบอดีอยู่ตลอดเวลา ( 1 : 500 เพื่อ 1:64000 ) การเก็บรักษาค่าปฏิกิริยาอื่น ๆคงที่กิโลเมตร เอทีพี คือวัดที่ความเข้มข้นสูง ( atf-2 ( 20 μ g / ml ) ทำให้ไคเนสความเข้มข้นคงที่ 200 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตรและค่าความเข้มข้น 0.01 M จากμ ATP 1000 μเมตร ความเข้มข้นของเอนไซม์ถูกกำหนดโดยการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นจาก 6.25 1600 ng / ml มิฉะนั้นการรักษาที่ดีที่สุด การทดสอบ เงื่อนไข สุดท้ายแต่ไม่ท้ายสุด( ใช้ระยะเวลาที่แตกต่างกันและการรักษาที่เหมาะสมการทดสอบพารามิเตอร์ ( 10 μ g / ml atf-2 200 ng / ml jnk3 , 10 M μ ATP และต่อต้าน phospho atf-2 thr69 / 71 – 1:5000 ) เพื่อให้บรรลุผลที่ต้องการความเข้มของสีจากเอนไซม์ปฏิกิริยา ของบล็อกบัฟเฟอร์ ( BB ) คือปรับ 1 M HCl ในการเจือจาง 3 สารละลายบัพเฟอร์เตรียมที่มีค่า pH 7.5 , 70 และ 6.5 . เพื่อตรวจสอบที่ดีที่สุดระยะเวลาเพื่อประคองแผ่น atf-2 ลงบ่อ แผ่นถูกบ่มค้างคืนที่ 4 ° C หรือ 1.5 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศา