Verification of the miRNA targeting

Verification of the miRNA targeting Cf-9
Tomato genomic DNA was extracted using Plant DNAzol reagents
(Life Science, China) following the procedure recommended
by the manufactory. Pri-miRNA sequence of the predicted miRNA
was amplified from tomato genomic DNA while cDNA sequence of
its potential target gene Cf-9 was amplified from tomato cDNA with
the primers listed at Table 1, which were then cloned into binary
vector pCHF3 with Kpn I/Sal I and BamH I/Sal I, respectively, to
release the recombinant constructs pCHF3::pri-miRNA and
pCHF3::Cf-9. These recombinant plasmids and the empty plasmid
as a control were transformed into Agrobacterium tumefaciens
strain GV3101. Mixtures at 1:1 ratio of Agrobacterium suspensions
carrying pCHF3::Cf-9 and those containing pCHF3::pri-miRNA or
pCHF3 empty vector with a final OD600 of 2.0 for each type of
bacteria were prepared as described [19,20], and were infiltrated
into Nicotiana benthamiana leaves using needleless syringes. For
assays in Cf-9 tomato plants, solely Agrobacterium suspensions
carrying pCHF3::pri-miRNA or pCHF3 empty vector as a control
were infiltrated into tomato leaves. After infiltration, the plants
were grown at 25
C. Expression of the Cf-9 gene in the agroinfiltrated
areas was detected by RT-qPCR at 3 d post infiltration

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การตรวจสอบเที่ยวเป้าหมาย Cf-9ดีเอ็นเอในจีโนมของถูกสกัดโดยใช้สาร DNAzol พืชมะเขือเทศแนะนำขั้นตอนต่อไปนี้ (วิทยาศาสตร์ จีน)โดยโรงงาน ลำดับ Pri เที่ยวเที่ยวทำนายถูกขยายจากดีเอ็นเอการมะเขือเทศในขณะที่ลำดับ cDNA ของยีนเป้าหมายศักยภาพของ Cf-9 ถูกขยายจาก cDNA มะเขือเทศด้วยไพรเมอร์ที่ระบุไว้ในตารางที่ 1 ที่ถูกโคลนนั้นเป็นไบนารีเวกเตอร์ pCHF3 กับ Kpn ฉัน / Sal ผมและ BamH ฉัน / Sal ตามลำดับ เพื่อปล่อยโครงสร้าง recombinant pCHF3::pri-เที่ยว และpCHF3::Cf-9 เหล่านี้ plasmids recombinant และ plasmid ว่างเปล่าเป็นตัวควบคุมได้กลายเป็น tumefaciens อโกรแบคทีเรียมสายพันธุ์ GV3101 ผสมในอัตราส่วน 1:1 ระบบกันสะเทือนอโกรแบคทีเรียมการนำ pCHF3::Cf-9 และผู้ที่ประกอบด้วย pCHF3::pri เที่ยว หรือpCHF3 ว่างเวกเตอร์กับ OD600 สุดท้าย 2.0 สำหรับแต่ละชนิดแบคทีเรียมีเตรียมดังอธิบายไว้ [19,20], และถูกแทรกซึมใน Nicotiana benthamiana ใบโดยใช้เข็มฉีดยา needleless สำหรับassays ในพืชมะเขือเทศ Cf-9 อโกรแบคทีเรียมเท่าระบบกันสะเทือนพกพาเที่ยว pCHF3::pri หรือ pCHF3 ว่างเวกเตอร์เป็นตัวควบคุมได้แทรกซึมเข้าสู่ใบมะเขือเทศ หลังจากแทรกซึม พืชมีปลูกที่ 25 C. นิพจน์ยีน Cf-9 ในการ agroinfiltratedพื้นที่ตรวจพบ โดย RT qPCR ที่แทรกซึมลง 3 d

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การตรวจสอบของการกำหนดเป้าหมาย miRNA CF-9
มะเขือเทศดีเอ็นเอถูกสกัดโดยใช้น้ำยาพืช DNAzol
(วิทยาศาสตร์ชีวภาพ, จีน) ทำตามขั้นตอนที่แนะนำ
โดยโรงงาน ลำดับ Pri-miRNA ของ miRNA คาดการณ์
ถูกขยายจากมะเขือเทศดีเอ็นเอในขณะที่ลำดับ cDNA ของ
ยีนเป้าหมายที่มีศักยภาพ CF-9 ถูกขยายจาก cDNA มะเขือเทศกับ
ไพรเมอร์ที่มีอยู่ในตารางที่ 1 ซึ่งถูกโคลนแล้วเป็นไบนารี
pCHF3 เวกเตอร์กับ Kpn I / sal I และ BamH I / Sal ฉันตามลำดับเพื่อ
ปล่อย recombinant โครงสร้าง pCHF3 :: PRI-miRNA และ
pCHF3 :: CF-9 เหล่านี้พลาสมิด recombinant และพลาสมิดที่ว่างเปล่า
เป็นตัวควบคุมถูกเปลี่ยนเป็น Agrobacterium tumefaciens
GV3101 ความเครียด ผสมในอัตราส่วน 1: 1 ของสารแขวนลอย Agrobacterium
แบก pCHF3 :: CF-9 และผู้ที่มี pCHF3 :: PRI-miRNA หรือ
pCHF3 เวกเตอร์ว่างเปล่ากับสุดท้าย OD600 2.0 สำหรับแต่ละชนิดของ
เชื้อแบคทีเรียได้จัดทำตามที่อธิบายไว้ [19,20] และได้รับการแทรกซึม
เข้าไปใน Nicotiana benthamiana ใบโดยใช้เข็มฉีดยาเข็ม สำหรับ
การตรวจในโรง CF-9 มะเขือเทศ แต่เพียงผู้เดียวแขวนลอย Agrobacterium
แบก pCHF3 :: PRI-miRNA หรือ pCHF3 เวกเตอร์ที่ว่างเปล่าเป็นตัวควบคุม
ถูกแทรกซึมเข้าไปในใบมะเขือเทศ หลังจากที่แทรกซึมพืช
ที่ปลูกอยู่ที่ 25 องศาเซลเซียส การแสดงออกของ CF-9 ยีน agroinfiltrated
พื้นที่ถูกตรวจพบโดย RT-qPCR ที่ 3 D โพสต์แทรกซึม