5.1. Plant materials and growth con

5.1. Plant materials and growth conditions

Tomato seeds (Lycopersicon esculentum Mill. cv. Chibli F1) were sterilized in 10% H2O2 for 20 min. Seeds were then germinated on moistened filter paper at 25 °C in the dark. The seedlings were transferred to continuously aerated high nitrogen (5 mM NO3–) nutrient solutions containing 3 mM KNO3, 1 mM Ca(NO3)2, 2 mM KH2PO4, 0.5 mM MgSO4, 30 μM Fe-K-EDTA, and micronutrients: 30 μM H3BO4, 5 μM MnSO4, 1 μM CuSO4, 1 μM ZnSO4, 1 μM (NH4)6Mo7O24. For low nitrogen (0.1 mM NO3–) nutrient solution, nitrate was replaced by a mixture of potassium and magnesium sulfate and chloride to maintain the same concentration of each cation and the same overall anion concentration. Plants were grown in a growth chamber: 26 °C/70% relative humidity during the day and 20 °C/90% relative humidity during the night; photoperiod:16 h daily with a light irradiance of 150 μmol m−2 s−1 at the canopy level. Plants were grown for 10 days in control medium, and NaCl concentration was increased by 50 mM by day to 100 mM NaCl to avoid osmotic shock. At harvest, plants were sampled every 3 hours during the day/night cycle, and immediately divided into leaves, stems and petioles (stemspetioles), and roots for growth and enzymatic experiments.

5.2. Protein content determination

Soluble protein was determined using a commercially available kit (Coomassie Protein assay reagent, Bio-Rad).

5.3. Chl determination

Chl contents were determined by the method of Arnon [4]. The absorbance of a sample was read at 460, 645 and 663 nm, then contents of Chl a, Chl b and cart were calculated.

5.4. Enzyme assays

5.4.1. NR

NR was extracted from frozen material stored at –80 °C in cold extraction 50 mM MOPS–KOH buffer (pH 7.6) containing
PVP 0.5% (w/v), 5 mM NaF, 1 μM Na2MoO4, 10 μM FAD, 1 μM leupeptin, 2 mM β-mercaptoethanol, 5 mM EDTA. The
homogenate was centrifuged at 15,000 rpm for 5 min at 4 °C. The extract (10 μl) was incubated in a solution containing
50 mM MOPS–KOH buffer (pH 7.6), supplemented with 5 mM NaF, 10 mM KNO3, 155 μM NADH, and either 10 mM MgCl2 or 5 mM EDAT at 30 °C for 30 min. The reaction was stopped by 100 μl of 5.8 mM sulfanilamide and then an equal
volume of 0.8 mM N-naphthyl-ethylene-diamine-dichloride (NNED) was added. The absorbance of the supernatant was
determined at 540 nm after diazotation of nitrites ions with

5.8 mM sulfanilamide and 0.8 mM NNED.

The activation state of NR is given as a percentage ratio between NRA measured in the presence of MgCl2 and NRA measured with EDTA.

5.4.2. NiR

NiR extraction was the same as for NR. Ten microliters of the extract was incubated in a solution containing 40 μl of
50 mM MOPS–KOH buffer (pH 7.6), 15 mM sodium nitrite, 5 mM methyl viologen and 86.15 mM sodium dithionite (DIT)
in 190 mM NaHCO3. The reaction was stopped by a violent agitation on vortex. Nitrite ions remained in the reactions mixture were determined at 540 nm after reaction with 5.8 mM sulfanilamide and 0.8 mM NNED.

5.4.3. GS

GS was extracted with 25 mM Tris–HCl buffer (pH 7.6), 1 mM MgCl2, 1 mM EDTA-Na2, 14 mM β-mercaptoethanol and PVP 1% (w/v). GS activity was measured according to the method of O’Neal and Joy [32]. The homogenate was centrifuged at 15,000 rpm for 20 min at 4 °C. GS activity was determined using hydroxylamine as the substrate, and the formation of γ-glutamylhydroxamate (γ-GHM) was quantified with acidified ferric chloride [29].

5.4.4. Glutamate synthase

Fd-GOGAT and NADH-GOGAT activities were measured as described by Suzuki et al. [43]. Glutamate synthase was
extracted with 25 mM sodium sulfate buffer (pH 7.5), containing 14 mM β-mercaptoethanol and 1 mM DTT. Fd-GOGAT
was determined using methyl viologen as the electron donor. The reaction mixture contained 25 mM sodium sulfate buffer
(pH 7.5), 100 mM glutamine, 100 mM 2-oxoglutarate, 1.4 mM NADH for NADH-GOGAT activity or 3.9 mM methyl viologen
and 190 mM DIT in a 180 mM NaHCO3 for Fd-GOGAT activity. Glutamate produced by GOGAT was determined using HPLC.

5.4.5. GDH

GDH extraction buffer was the same as for GS. NAD(H)-GDH activity was measured as described by Turano et al. [44].
NADH-GDH and NAD-GDH activities were determined by following the absorbance changes at 340 nm [47].

5.5. Western immuno-blotting analysis

Proteins were extracted as for GS or GOGAT. Protein concentrations were determined by the Bio-Rad protein assay. Proteins were separated on an SDS-PAGE acrylamide gel [27]. Equal amounts of protein were loaded in each track. The percentage of acrylamide in the running gel was 10% for GS and 7% for Fd-GOGAT. Denaturated proteins were electrophoreti-cally transferred to nitrocellulose membranes. Polypeptide detection was performed using polyclonal antiserum raised against chloroplastic GS (GS2) of tobacco [8] and Fd-GOGAT [43].

5.6. Statistical analysis

The data presented in this work are the average of at least five replicates per treatment, and mean ± S.E. at P = 0.05 level, are given in the figures and tables. Each experiment was conducted in duplicate. The differences between the means are calculated using the Tukey test at the 0.05 confidence level by Statistica 6.0 software.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

5.1 การปลูกวัสดุและสภาพการเจริญเติบโต เมล็ดพันธุ์มะเขือเทศ (Lycopersicon esculentum Mill. พันธุ์ Chibli F1) ถูก sterilized 10% H2O2 สำหรับเมล็ดประมาณ 20 นาทีได้แล้วเปลือกงอกบน moistened กระดาษกรองที่ 25 ° C ในมืด กล้าไม้ถูกโอนย้ายไปที่โซลูชั่นธาตุอาหารอย่างต่อเนื่องอากาศธาตุไนโตรเจนสูง (5 mM NO3-) ประกอบด้วย 3 มม. KNO3, mM 1 Ca (NO3) 2, 2 mM KH2PO4, 0.5 mM MgSO4, 30 μM Fe-K-EDTA และองค์ประกอบตามโรค: 30 μM H3BO4, 5 μM MnSO4, 1 μM CuSO4, 1 μM ZnSO4, 6Mo7O24 μM (NH4) 1 สำหรับโซลูชันธาตุอาหารไนโตรเจนต่ำ (0.1 mM NO3-) ไนเตรตถูกแทนที่ ด้วยส่วนผสมของโพแทสเซียม และแมกนีเซียมซัลเฟต และคลอไรด์เพื่อรักษาความเข้มข้นเดียวกันของแต่ละ cation และความเข้มข้นของ anion โดยรวมเดียวกัน พืชที่ปลูกในหอเจริญเติบโต: 26 °C/70% ชื้นระหว่างวันและความชื้นสัมพัทธ์ °C/90% 20 ดึก ชั่วโมง: 16 h ที่ irradiance แสงของ s−1 m−2 μmol 150 ระดับฝาครอบ พืชที่ปลูก 10 วันในการควบคุม และ NaCl ความเข้มข้นเพิ่มขึ้นจาก 50 มม.วัน 100 มม. NaCl เพื่อหลีกเลี่ยงการกระแทกออสโมติก ที่เก็บเกี่ยว พืชมีความทุก 3 ชั่วโมงในระหว่างรอบกลางวัน/กลางคืน และทันทีแบ่งใบ ลำต้น และ petioles (stemspetioles), และรากเจริญเติบโตและทดลองเอนไซม์ในระบบ5.2 โปรตีนกำหนดเนื้อหาโปรตีนที่ละลายน้ำได้กำหนดใช้ชุดใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ (Coomassie โปรตีนวิเคราะห์รีเอเจนต์ Bio Rad)5.3. กำหนด ChlChl เนื้อหาถูกกำหนด โดยวิธีการของอานนท์ [4] Absorbance ของตัวอย่างที่อ่านที่ 460, 645 และ 663 nm แล้วเนื้อหาของ Chl Chl a, b และรถเข็นที่คำนวณ5.4. เอนไซม์ assays5.4.1. NRNR ที่สกัดจากวัสดุแช่แข็งเก็บไว้ที่ –80 ° C ในการสกัดเย็น 50 มม. MOPS – เกาะบัฟเฟอร์ (pH 7.6) ประกอบด้วยPVP 0.5% (w/v), 5 mM NaF, 1 μM Na2MoO4, μM บูรณะ leupeptin 1 μM β-mercaptoethanol 2 มม. 10 มม. 5 EDTA ที่homogenate ถูก centrifuged ที่ 15000 rpm สำหรับ 5 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส สารสกัด (10 μl) ถูก incubated ในโซลูชันที่ประกอบด้วย50 มม. MOPS – เกาะบัฟเฟอร์ (pH 7.6), เสริมกับ NaF 5 มม. 10 มม. KNO3, 155 μM NADH และ MgCl2 10 มม. หรือ 5 มม. EDAT ที่ 30 ° C สำหรับ 30 นาที หยุดปฏิกิริยา โดย μl 100 ของซัลฟานิลาไมด์ 5.8 มม. แล้วเสมอมีเพิ่มปริมาณ 0.8 มม. N-naphthyl-เอทิลีน-diamine-dichloride (NNED) Absorbance ของ supernatant ถูกกำหนดที่ 540 nm หลังจาก diazotation ของ nitrites ประจุด้วยซัลฟานิลาไมด์มม. 5.8 และ 0.8 มม. NNED รัฐเปิด NR ได้เป็นเปอร์เซ็นต์อัตราส่วนระหว่าง NRA ที่วัดของ MgCl2 และ NRA ที่วัดกับ EDTA5.4.2 การ NiRแยก NiR ได้เหมือนกับ NR Microliters สิบของสารสกัดถูก incubated ในโซลูชันที่ประกอบด้วย μl 40 ของ50 มม. MOPS – เกาะบัฟเฟอร์ (pH 7.6), mM โซเดียมไนไตรต์ 15, viologen methyl 5 มม. และ dithionite มม. 86.15 โซเดียม (DIT)ใน 190 มม. NaHCO3 หยุดปฏิกิริยา ด้วยอาการกังวลต่อความรุนแรงใน vortex ไนไตรต์ประจุยังคงอยู่ในปฏิกิริยาที่มีกำหนดส่วนผสมที่ 540 nm หลังปฏิกิริยากับซัลฟานิลาไมด์ 5.8 mM 0.8 mM NNED5.4.3 การ GSGS ถูกสกัด ด้วย 25 มม.ตรี – HCl บัฟเฟอร์ (pH 7.6), 1 mM MgCl2, 1 mM EDTA Na2 β-mercaptoethanol 14 มม. และ PVP 1% (w/v) กิจกรรม GS ถูกวัดตามวิธีของ O'Neal และความสุข [32] Homogenate ถูก centrifuged ที่ 15000 rpm สำหรับ 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส กำหนดกิจกรรม GS ใช้ hydroxylamine กับพื้นผิว และการก่อตัวของγ-glutamylhydroxamate (γ-จีเอชเอ็ม) ถูก quantified กับ acidified คคลอไรด์ [29]5.4.4 การ Glutamate synthaseFd GOGAT และ NADH GOGAT ถูกวัดตามที่อธิบายไว้โดย Suzuki et al. [43] Glutamate synthase ถูกสกัด ด้วย 25 มม.โซเดียมซัลเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.5), มีβ-mercaptoethanol 14 มม.และ 1 มม. DTT Fd GOGATได้กำหนดใช้ methyl viologen เป็นผู้บริจาคอิเล็กตรอน บัฟเฟอร์ปฏิกิริยาผสมอยู่ 25 มม.โซเดียมซัลเฟต(pH 7.5), glutamine 100 มม. 100 มม. 2-oxoglutarate, 1.4 มม. NADH ใน NADH GOGAT กิจกรรมหรือ 3.9 มม. methyl viologenและ 190 มม. DIT มม.เป็น 180 NaHCO3 สำหรับกิจกรรม Fd GOGAT ผลิต โดย GOGAT Glutamate ที่ถูกกำหนดโดยใช้ HPLC5.4.5. เฮบัฟเฟอร์การสกัดเฮมีเหมือนกับ GS และ (H) -กิจกรรมเฮถูกวัดตามที่อธิบายไว้โดย Turano et al. [44]กิจกรรม NADH เฮและเฮและถูกกำหนดตามการเปลี่ยนแปลง absorbance ที่ 340 nm [47]5.5. วิเคราะห์ blotting วิธี immuno ตะวันตกโปรตีนที่สกัดสำหรับ GS หรือ GOGAT ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนด โดยวิเคราะห์โปรตีนไบโอ-Rad โปรตีนถูกแยกจากกันในการ SDS-เพอะคริลาไมด์เจล [27] จำนวนเท่าของโปรตีนถูกโหลดในแต่ละแทร็ค เปอร์เซ็นต์ของอะคริลาไมด์ในเจทำได้ 10% สำหรับ GS และ 7% สำหรับ Fd-GOGAT โปรตีน Denaturated ได้ electrophoreti cally โอนไป nitrocellulose เยื่อหุ้ม ตรวจ polypeptide ที่ดำเนินการโดยใช้ polyclonal antiserum ยก chloroplastic GS (GS2) ยาสูบ [8] และ Fd-GOGAT [43]5.6. สถิติวิเคราะห์ข้อมูลที่นำเสนอในงานนี้มีค่าเฉลี่ยของห้าน้อยเหมือนกับต่อการรักษา และหมายถึง ± S.E. ที่ P = 0.05 ระดับ กำหนดในตารางและตัวเลข มีดำเนินการทดลองแต่ละสำเนา ความแตกต่างระหว่างวิธีคำนวณโดยใช้การทดสอบของ Tukey ที่ระดับความเชื่อมั่น 0.05 โดย Statistica 6.0 ซอฟต์แวร์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

5.1 วัสดุอาคารและสภาวะการเจริญเติบโตเมล็ดมะเขือเทศ (Lycopersicon esculentum Mill. พันธุ์. Chibli F1) ได้รับการฆ่าเชื้อใน H2O2 10% เป็นเวลา 20 นาที เมล็ดงอกแล้วบนกระดาษกรองชุบที่ 25 ° C ในที่มืด ต้นกล้าถูกโอนไปยังมวลเบาอย่างต่อเนื่องไนโตรเจนสูง (5 มิลลิ NO3-) โซลูชั่นที่มีสารอาหารที่ 3 มิลลิ KNO3 1 มิลลิ Ca (NO3) 2, 2 มิลลิ KH2PO4, 0.5 มิลลิ MgSO4 30 ไมครอนเฟ-K-EDTA และแร่ธาตุอาหาร: 30 ไมครอน H3BO4 5 ไมครอน MnSO4 1 ไมครอน CuSO 4 1 ไมครอน ZnSO4 1 ไมครอน (NH4) 6Mo7O24 ไนโตรเจนต่ำ (0.1 มิลลิ NO3-) สารละลายไนเตรตถูกแทนที่ด้วยส่วนผสมของโพแทสเซียมและแมกนีเซียมซัลเฟตคลอไรด์ในการรักษาความเข้มข้นเดียวกันของแต่ละไอออนบวกและความเข้มข้นของไอออนโดยรวมเดียวกัน พืชที่ปลูกในห้องการเจริญเติบโต: 26 ° C / 70% ความชื้นสัมพัทธ์ในระหว่างวันและ 20 ° C / 90% ความชื้นสัมพัทธ์ในช่วงเวลากลางคืน; แสง: 16 ชั่วโมงทุกวันด้วยรังสีแสง 150 ไมโครโมลของ m-2 s-1 ในระดับหลังคา พืชที่ปลูกเป็นเวลา 10 วันในการควบคุมสื่อและความเข้มข้นของโซเดียมคลอไรด์เพิ่มขึ้น 50 มิลลิโดยวันถึง 100 มิลลิโซเดียมคลอไรด์เพื่อหลีกเลี่ยงการช็อตออสโมติก ที่เก็บเกี่ยวพืชตัวอย่างทุก 3 ชั่วโมงในระหว่างรอบวัน / คืนและแบ่งออกทันทีในใบลำต้นและก้านใบ (stemspetioles) และรากสำหรับการเจริญเติบโตและการทดลองเอนไซม์. 5.2 การกำหนดปริมาณโปรตีนโปรตีนที่ละลายน้ำได้ถูกกำหนดโดยใช้ชุดใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ (Coomassie น้ำยาทดสอบโปรตีน Bio-Rad.) 5.3 Chl การกำหนดเนื้อหาChl ถูกกำหนดโดยวิธีการของแม่น้ำอารโนน [4] การดูดกลืนแสงของกลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการอ่านที่ 460, 645 และ 663 นาโนเมตรแล้วเนื้อหาของ Chl ที่ Chl ขและรถจะถูกคำนวณ. 5.4 การตรวจเอนไซม์5.4.1 NR NR ถูกสกัดจากวัสดุแช่แข็งเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสในการสกัดเย็น 50 มิลลิบัฟเฟอร์ MOPS-KOH (pH 7.6) ที่มีพีวีพี0.5% (w / v) 5 มิลลิ NaF 1 ไมครอน Na2MoO4 10 ไมครอน FAD 1 ไมครอน leupeptin 2 มิลลิβ-mercaptoethanol 5 มิลลิ EDTA homogenate ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 ° C สารสกัด (10 ไมโครลิตร) ถูกบ่มในการแก้ปัญหาที่มี50 มิลลิบัฟเฟอร์ MOPS-KOH (pH 7.6) เสริมด้วย 5 มิลลิ NaF 10 มิลลิ KNO3 155 ไมครอน NADH และทั้ง 10 มิลลิ MgCl2 หรือ 5 มิลลิ EDAT ที่ 30 ° C เป็นเวลา 30 นาที ปฏิกิริยาหยุด 100 ไมโครลิตร 5.8 มิลลิ sulfanilamide แล้วเท่ากับปริมาณ0.8 มิลลิ N-naphthyl-เอทิลีน diamine-dichloride (NNED) ถูกเพิ่มเข้ามา การดูดกลืนแสงของสารละลายที่ถูกกำหนดที่ 540 นาโนเมตรหลังจาก diazotation ของไอออนไนไตรต์กับ 5.8 มิลลิ sulfanilamide และ 0.8 มิลลิ NNED. รัฐเปิดใช้งานของยางธรรมชาติจะได้รับเป็นอัตราส่วนร้อยละระหว่างชมรมวัดในการปรากฏตัวของ MgCl2 และชมรมวัดที่มี EDTA. 5.4 0.2 NIR NIR สกัดเป็นเช่นเดียวกับยางธรรมชาติ สิบ microliters ของสารสกัดที่ถูกบ่มในการแก้ปัญหาที่มี 40 ไมโครลิตรของ50 มิลลิบัฟเฟอร์ MOPS-KOH (pH 7.6) 15 มิลลิโซเดียมไนไตรท์, 5 มิลลิ viologen เมธิลและ 86.15 มิลลิโซเดียม dithionite (DIT) ใน 190 มิลลิ NaHCO3 ปฏิกิริยาจะถูกหยุดโดยปั่นป่วนรุนแรงกระแสน้ำวน ไอออนไนไตรท์ยังคงอยู่ในส่วนผสมปฏิกิริยาถูกกำหนดที่ 540 นาโนเมตรหลังจากที่ทำปฏิกิริยากับ 5.8 มิลลิ sulfanilamide และ 0.8 มิลลิ NNED. 5.4.3 GS GS ถูกสกัดด้วย 25 มิลลิบัฟเฟอร์ Tris-HCl (pH 7.6) 1 มิลลิ MgCl2 1 มิลลิ EDTA-Na2 14 มิลลิβ-mercaptoethanol และ PVP 1% (w / v) กิจกรรม GS วัดตามวิธีการของโอนีลและความสุข [32] homogenate ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 20 นาทีที่ 4 ° C กิจกรรม GS ถูกกำหนดโดยใช้ไฮดรอกซิเป็นสารตั้งต้นและการก่อตัวของγ-glutamylhydroxamate (γ-GHM) ได้รับการวัดที่มีกรดเฟอริกคลอไรด์ [29]. 5.4.4 กลูตาเมตเทสFD-GOGAT และกิจกรรม NADH-GOGAT วัดตามที่อธิบายไว้โดยซูซูกิ et al, [43] เทสกลูตาเมตที่ถูกสกัดด้วย 25 โซเดียมซัลเฟตมิลลิบัฟเฟอร์ (pH 7.5) ที่มี 14 มิลลิβ-mercaptoethanol และ 1 มิลลิ DTT FD-GOGAT ถูกกำหนดโดยใช้ viologen เมธิลอิเล็กตรอนเป็นผู้บริจาค ผสมปฏิกิริยาที่มีอยู่ 25 มิลลิโซเดียมบัฟเฟอร์ซัลเฟต(pH 7.5), glutamine 100 มิลลิ 100 มิลลิ 2 oxoglutarate 1.4 มิลลิ NADH กิจกรรม NADH-GOGAT หรือ 3.9 มิลลิ viologen เมธิลและ190 มิลลิ DIT ใน 180 มิลลิ NaHCO3 สำหรับ FD-GOGAT กิจกรรม กลูตาเมตที่ผลิตโดย GOGAT ถูกกำหนดโดยใช้วิธี HPLC. 5.4.5 GDH GDH บัฟเฟอร์สกัดเป็นเช่นเดียวกับ GS NAD (H) กิจกรรม -GDH วัดตามที่อธิบาย Turano et al, [44]. NADH-GDH และกิจกรรม NAD-GDH ถูกกำหนดโดยการเปลี่ยนแปลงดังต่อไปนี้การดูดกลืนแสงที่ 340 นาโนเมตร [47]. 5.5 การวิเคราะห์ภูมิคุ้มกัน blotting ตะวันตกโปรตีนสกัดเป็นGS หรือ GOGAT ความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกกำหนดโดยการทดสอบโปรตีน Bio-Rad โปรตีนที่ถูกแยกออกในริลาไมด์ SDS-PAGE เจล [27] ปริมาณที่เท่ากันของโปรตีนที่ถูกโหลดในแต่ละแทร็ค ร้อยละของริลาไมด์เจลในการทำงานเป็น 10% สำหรับ GS และ 7% สำหรับ FD-GOGAT โปรตีน Denaturated ถูก electrophoreti-cally โอนไปยังเยื่อ nitrocellulose การตรวจสอบ Polypeptide ถูกดำเนินการโดยใช้โพลี antiserum ขึ้นกับ chloroplastic GS (GS2) ของยาสูบ [8] และ FD-GOGAT [43]. 5.6 การวิเคราะห์ทางสถิติข้อมูลที่นำเสนอในงานนี้มีค่าเฉลี่ยของเวลาอย่างน้อยห้าซ้ำต่อการรักษาและค่าเฉลี่ย± SE ที่ p = 0.05 ระดับจะได้รับในตัวเลขและตาราง การทดลองแต่ละคนได้ดำเนินการในที่ซ้ำกัน ความแตกต่างระหว่างวิธีที่จะคำนวณโดยใช้การทดสอบ Tukey ที่ระดับความเชื่อมั่น 0.05 โดย Statistica 6.0 ซอฟแวร์