In the first experiments (Table 1,

In the first experiments (Table 1, expt 1) human diploid cells were routinely subcultured in ISO ml
bow bottles in Eagle's BME medium (Gibco-Biocult Ltd, U.K.) containing 10% foetal calf serum
(FCS), 10% tryptose-phosphate broth. This and all other media used contained 100units of
penicillin and 100 /ig streptomycin per ml. The cells were incubated at 37 °C, with their bottle tops
screwed on tightly. For the remaining experiments in Table 1, the cells were subcultured in 25 cm2
flasks (Nunc Ltd, U.K.) and incubated, with loose bottle tops, in a humidified atmosphere of 5 %
CO2. A richer medium was used in later experiments for routine cell growth (Table 1, expts 6-10).
This was F-15 Eagle's MEM (Gibco-Biocult) supplemented with 10% FCS, 2mM-glutamine. Cells
were subcultured when the culture had attained confluence.They were first washed in phosphate-buffered saline (Dulbecco-PBS 'A') before trypsinizing with 0-5 ml of trypsin-versene
(0'125% trypsin, 0-01 % EDTA). The cell suspension was diluted by the addition of 9-5ml
medium before subculture at 1:4 or 1:8 split ratios for younger cultures, or 1:2 split for slower
growing cultures. The growth medium of non-confluent cultures was changed every 3—4 days. The
cumulative number of population doublings (p.d.) was calculated by counting the number of cells
harvested from each confluent bottle with a Coulter Counter (model ZB1, Coulter Electronics Ltd,
Harpenden, U.K.). (To retain equivalence of p.d. with passages, we score a 1:4 split as 2 passages
and a 1: 8 split as 3 passages.) All cells were routinely screened for mycoplasmal contamination by
the method of Chen (1977). They were all found to be negative. Stocks of cells were maintained by
storing them in growth medium containing 10% glycerol in liquid nitrogen.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในการทดลองครั้งแรก (ตารางที่ 1, Expt 1) เซลล์ของมนุษย์ซ้ำถูกเลี้ยงเป็นประจำใน ISO ml
น้อมขวดในสื่อ BME นกอินทรี (Gibco-Biocult จำกัด สหราชอาณาจักร) ที่มี 10% ซีรั่มน่องทารกในครรภ์
(FCS) 10% น้ำซุป tryptose ฟอสเฟต . นี้และสื่ออื่น ๆ ที่มีอยู่ใช้ 100units
ของยาปฏิชีวนะและ100 / ig streptomycin ต่อมิลลิลิตร เซลล์ที่ได้รับการบ่มที่อุณหภูมิ 37
องศาเซลเซียสโดยมีท็อปส์ซูขวดของพวกเขาเมาแน่น สำหรับการทดลองที่เหลืออยู่ในตารางที่ 1 เซลล์ที่ถูกเลี้ยงใน 25 ซม 2
ขวด (Nunc จำกัด สหราชอาณาจักร) และบ่มกับท็อปส์ซูขวดหลวมในบรรยากาศความชื้น 5%
CO2 สื่อที่ดียิ่งขึ้นถูกใช้ในการทดลองต่อมาสำหรับการเจริญเติบโตของเซลล์ประจำ (ตารางที่ 1, expts 6-10).
นี้ถูก F-15 อินทรี MEM (Gibco-Biocult) เสริมด้วย 10% FCS, 2mm-glutamine เซลล์ที่ถูกเลี้ยงวัฒนธรรมเมื่อได้บรรลุ confluence.They ถูกล้างครั้งแรกในน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (Dulbecco-พีบีเอส 'A') ก่อนที่จะมี trypsinizing 0-5 มิลลิลิตร trypsin-versene (trypsin 0'125% EDTA 0-01% ) ระงับเซลล์ถูกเจือจางโดยนอกเหนือจาก 9-5ml กลางก่อนที่วัฒนธรรมที่ 1: 4 หรือ 1: 8 อัตราส่วนแบ่งวัฒนธรรมที่อายุน้อยกว่าหรือ 1: 2 แยกสำหรับช้าวัฒนธรรมการเจริญเติบโต สื่อการเจริญเติบโตของวัฒนธรรมที่ไม่ใช่ไหลมารวมกันก็เปลี่ยนทุก 3-4 วัน จำนวนสะสมของ doublings ประชากร (PD) ที่คำนวณโดยการนับจำนวนของเซลล์ที่เก็บเกี่ยวจากขวดไหลมารวมกันแต่ละคนมีเคาน์เตอร์โคลเตอร์(ZB1 รุ่นโคลเตอร์ Electronics Ltd, บอสต์สหราชอาณาจักร) (เพื่อรักษาสมดุลของ PD ที่มีทางเดินที่เราทำคะแนน 1: 4 แยกเป็น 2 ทางและ1:. 8 แยก 3 ทาง) เซลล์ทั้งหมดได้รับการคัดกรองเป็นประจำการปนเปื้อน mycoplasmal โดยวิธีการของเฉิน(1977) พวกเขากำลังทั้งหมดที่พบจะเป็นเชิงลบ หุ้นของเซลล์ได้รับการดูแลโดยเก็บไว้ในสื่อการเจริญเติบโตที่มีกลีเซอรีน 10% ในไนโตรเจนเหลว