Real-Time PCR AnalysisPrimers and s

Real-Time PCR Analysis
Primers and specific TaqMan probes for the b-actin, rpl8, gapdh, dmrt1,
amh, and vasa genes were designed on the basis of the common regions
of sequences of the P and A genomes (obtained from S. pyrenaicus and
S. alburnoides samples) (Table S3). Reactions were conducted on an iCycler
iQ Real Time PCR equipment (50C for 2 min; 95C for 10 min; 50 cycles at
60C for 1 min), visualized with iCycler iQ Real-Time Detection System Software.
A subsample of muscle, liver, eye, and gonad RNA of individuals of different
sex, genotype, and ploidy were selected for amplification. Total RNA
quantification was performed with a Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer,
and normalization of template RNA quantity was performed before
cDNA synthesis with SUPERSCRIPT III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen),
with oligo dT primers. Relative quantification was performed
against initial quantity of nucleic acid, and reaction efficiency and replicability
was assessed by generation of a standard curve. Triplicates of each sample
were used both for standard curve generation and during experimental
assays. Amplification of the same samples was performed three times, and
reproducibility of results was confirmed. Relative expression ratios were
determined through direct comparison of Ct value averages of triplicates
between diploid controls (AA, PP, and PA) and triploid (PAA) samples,
with the approach described in a study of Z-linked gene expression and
sex-specific dosage compensation in birds [27].

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ไพรเมอร์และ TaqMan เฉพาะ probes สำหรับแอกติ นบี rpl8, gapdh, dmrt1amh ยีน vasa ถูกออกแบบตามภูมิภาคทั่วไปลำดับของ P และมี genomes (รับจาก S. pyrenaicus และตัวอย่าง alburnoides S.) (ตาราง S3) ปฏิกิริยาได้ดำเนินการในการ iCyclerอุปกรณ์ Real Time PCR iQ (C 50 ใน 2 นาที 95 C สำหรับ 10 นาที 50 รอบที่60 C ใน 1 นาที), visualized กับ iCycler iQ ซอฟต์แวร์ระบบตรวจสอบแบบเรียลไทม์Subsample ของกล้ามเนื้อ ตับ ตา และ gonad อาร์เอ็นเอของบุคคลอื่นเพศ ลักษณะทางพันธุกรรม และพล็อยดีถูกเลือกสำหรับการขยาย อาร์เอ็นเอทั้งหมดทำการนับ ด้วยการ Nanodrop ND-1000 เครื่องทดสอบกรดด่างและทำการฟื้นฟูของปริมาณอาร์เอ็นเอแม่แบบก่อนการสังเคราะห์ cDNA กับ cDNA สแตรนด์ 1 III ตัวยกชุดสังเคราะห์ (Invitrogen),ด้วย oligo dT ไพรเมอร์ ทำการนับญาติเทียบกับจำนวนเริ่มต้นของ กรดนิวคลีอิก และปฏิกิริยาประสิทธิภาพ และ replicabilityถูกประเมิน โดยการสร้างเส้นโค้งมาตรฐาน Triplicates ของแต่ละอย่างใช้ สำหรับการสร้างเส้นโค้งมาตรฐาน และใน ระหว่างการทดลองassays ขยายอย่างเดียวทำสามครั้ง และreproducibility ของผลลัพธ์ได้รับการยืนยัน อัตราส่วนของนิพจน์แบบย่อได้กำหนด โดยการเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยค่า Ct ของ triplicates โดยตรงระหว่างควบคุม diploid (AA, PP และ PA) และตัวอย่าง triploid (PAA)วิธีที่อธิบายไว้ในการศึกษาการแสดงออกของยีน Z เชื่อมโยง และค่าตอบแทนเฉพาะเพศขนาดในนก [27]

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Real-Time PCR วิเคราะห์
ไพรและ probes TaqMan ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ B-โปรตีน, rpl8, gapdh, dmrt1,
AMH และยีนแวได้รับการออกแบบบนพื้นฐานของภูมิภาคร่วมกัน
ของลำดับของ P และจีโนม (ที่ได้รับจากเอ pyrenaicus และ
S. ตัวอย่าง alburnoides) (ตารางที่ S3) ปฏิกิริยาถูกดำเนินการในปฏิทินสาธารณะ
iQ อุปกรณ์ Real Time PCR (50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาที? 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที; 50 รอบที่
? 60 C เป็นเวลา 1 นาที). มองเห็นด้วยปฏิทินสาธารณะ iQ Real-Time การตรวจสอบระบบซอฟท์แว
subsample ของกล้ามเนื้อตับตาและอาร์เอ็นเออวัยวะสืบพันธุ์ของบุคคลที่แตกต่างกัน
ทางเพศจีโนไทป์และ ploidy ได้รับเลือกสำหรับการขยาย อาร์เอ็นเอรวม
ปริมาณได้ดำเนินการกับ Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer,
และการฟื้นฟูของแม่ปริมาณ RNA ถูกดำเนินการก่อนที่จะ
สังเคราะห์ cDNA กับยก III 1 Strand ยีนสังเคราะห์ Kit (Invitrogen)
กับ Oligo ไพร dT ปริมาณสัมพัทธ์ที่ได้ดำเนินการ
กับปริมาณเริ่มต้นของกรดนิวคลีอิกและประสิทธิภาพของปฏิกิริยาและ replicability
ได้รับการประเมินโดยการสร้างกราฟมาตรฐาน Triplicates ของแต่ละตัวอย่าง
ถูกนำมาใช้ทั้งสำหรับการสร้างกราฟมาตรฐานและในระหว่างการทดลอง
การตรวจ การขยายตัวอย่างเดียวกันได้ดำเนินการสามครั้งและ
การทำสำเนาของผลการได้รับการยืนยัน อัตราส่วนการแสดงออกญาติได้รับการ
พิจารณาผ่านการเปรียบเทียบโดยตรงของค่าเฉลี่ยค่าซีทีของ triplicates
ระหว่างตัวควบคุมซ้ำ (AA, PP, และ PA) และ triploid (PAA) ตัวอย่าง
ด้วยวิธีการที่อธิบายไว้ในการศึกษาการแสดงออกของยีน Z-เชื่อมโยงและ
ปริมาณเพศที่เฉพาะเจาะจง ชดเชยในนก [27]

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เวลาจริงและการวิเคราะห์ดีเอ็นเอโพรบและ
taqman ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ b-actin rpl8 gapdh dmrt1 , , , ,
AMH และแวยีนถูกออกแบบบนพื้นฐานของภูมิภาคร่วมกัน
ของลำดับของ P และจีโนม ( ที่ได้รับจากสหรัฐอเมริกาและตัวอย่าง pyrenaicus
S . alburnoides ) ( ตารางที่ S3 ) ปฏิกิริยาที่เกิดใน icycler
ไอคิวเวลาจริงอุปกรณ์ PCR ( 50  C 2 นาที ; 95  C 10 นาที ; 50 รอบใน
60  C เป็นเวลา 1 นาที )ภาพกับ icycler ไอคิวเวลาจริงระบบตรวจจับซอฟต์แวร์ การ subsample กล้ามเนื้อ ตับ ไต ตา และท้องน้อย RNA ของบุคคลแตกต่างกัน
เพศ พันธุกรรม และการสุ่มแบบ . ปริมาณ RNA
รวมแสดงด้วย nanodrop nd-1000 Spectrophotometer
การฟื้นฟูปริมาณ RNA และแม่แบบการก่อน
การสังเคราะห์ cDNA ด้วยลวดหนาม 3 เกลียวดีเอ็นเอสังเคราะห์ 1 ชุด ( Invitrogen )
กับโอลิโก DT รองพื้น ปริมาณสัมพันธ์แสดง
กับปริมาณเริ่มต้นของกรดนิวคลีอิกและประสิทธิภาพของปฏิกิริยาและ replicability
ถูกประเมิน โดยการสร้างเส้นโค้งมาตรฐาน ล้อมของแต่ละตัวอย่าง
ใช้ทั้งรุ่นมาตรฐาน และช่วงโค้งหรือทดลอง

แบบตัวอย่างเดียวกันได้ถึง 3 ครั้ง และ
ยักษาก็ยืนยัน การแสดงออกต่อญาติถูกกำหนดผ่านการเปรียบเทียบโดยตรงของ CT

ระหว่างค่าเฉลี่ยของค่าล้อมคุมดิพลอยด์ ( AA , PP , และ PA ) และทริพลอยด์ ( ป้า ) ตัวอย่าง
ด้วยวิธีการที่อธิบายไว้ในการศึกษาการแสดงออกของยีนและ
z-linkedการตรวจหายาในนก [ 27 ]