Principle of FPNI-PCRThe basic prin

Principle of FPNI-PCR

The basic principle of FPNI-PCR is outlined in Figure ​Figure11 and ​and2.2. The method centers on a series of primers encompassing sequence-specific primers (designed on regions of known DNA sequence), and fusion primers which contain an arbitrary degenerate (AD) section fused to a section of determined sequence (fusion primers). The fusion of a known adaptor of determined sequence to the 5'-end of an AD (or other short site-dependent primer) is the main characteristic of FPNI-PCR (Figure ​(Figure1a),1a), and it is this trait which differentiates FPNI-PCR from TAIL-PCR (Figure ​(Figure1b).1b). The FPNI-PCR protocol contains three key steps. In the first step, a large complex mixture of DNA reactions is prepared using 0.4 μL of a gene-specific primer (SP1) designed to the genomic region of known sequence, and 2.0 μL of a combination of nine fusion arbitrary degenerate primers (eg. FP1-9; Table ​Table1);1); other designed primers for FPNI-PCR are presented in Additional files 1 Tables S1-S5. The details of cycling parameters and PCR conditions used in this study are listed in Table ​Table2.2. This first step consists of 3-6 repeats of two high stringency cycles followed by a low stringency cycle. Theoretically, single stranded PCR products from the gene-specific primer are generated during the high stringency cycles, and double-stranded products utilizing the FP primers (FPs) are developed during the low stringency cycle. After 3-6 repeated cycles of this PCR regime, it is predicted that the intended target products are partially synthesized and are accompanied by other, nonspecific, products (Figure ​(Figure2).2). In the second and third steps, nested PCR is conducted using 1 uL of target-specific primers (SP2/SP3, respectively) and FP-specific primers (FSP1/FSP2, respectively). These steps are high stringency PCR using high annealing temperatures so that target products are selectively amplified. Nonspecific products are not amplified in these steps, in part due to the nested approach with different primers. In addition, the large hairpin structure employed in some nonspecific products also contributes to prevent to further amplification (suppression PCR). Thus, the nonspecific products generated from the first PCR step in FPNI-PCR are not amplified in the second and third steps, and become substantially diluted in the final mix (Figure ​(Figure22).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

หลักการของ fpni-pcr

หลักการพื้นฐานของ fpni-PCR ถูกระบุไว้ใน figure11 รูปและ and2.2 ศูนย์วิธีการในชุดของไพรเมอร์ไพรเมอร์ครอบคลุมลำดับเฉพาะ (การออกแบบบนภูมิภาคของลำดับดีเอ็นเอที่รู้จักกัน) และไพรเมอร์ฟิวชั่นที่มีคนเลวโดยพลการ (โฆษณา) ส่วนผสมกับส่วนของลำดับที่กำหนด (ไพรเมอร์ฟิวชั่น)ฟิวชั่นของอะแดปเตอร์เป็นที่รู้จักกันของลำดับการมุ่งมั่นที่จะ 5'-ตอนท้ายของการโฆษณา (หรือไพรเมอร์ขึ้นอยู่กับสถานที่อื่น ๆ ในระยะสั้น) เป็นลักษณะหลักของ fpni-PCR (รูป (figure1a) 1a) และมันก็เป็นลักษณะนี้ ซึ่งแตกต่าง fpni-PCR จากหาง-PCR (รูป (figure1b) .1 ข) โปรโตคอล fpni-pcr มีสามขั้นตอนสำคัญ ในขั้นตอนแรกส่วนผสมที่ซับซ้อนขนาดใหญ่ของปฏิกิริยา dna เตรียมใช้ 0.4 ไมโครลิตรของไพรเมอร์ยีนที่เฉพาะเจาะจง (SP1) ได้รับการออกแบบในภูมิภาคจีโนมของลำดับที่รู้จักและ 2.0 ไมโครลิตรของการรวมกันของเก้าฟิวชั่นไพรเมอร์คนเลวโดยพลการ (เช่น FP1-9; ตาราง table1); 1) ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบอื่น ๆ สำหรับ fpni-PCR ถูกนำเสนอในแฟ้มเพิ่มเติม 1 ตาราง s1-s5รายละเอียดของพารามิเตอร์การขี่จักรยานและเงื่อนไข pcr ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีการระบุไว้ในตาราง table2.2 ขั้นตอนแรกนี้ประกอบด้วย 3-6 ซ้ำสองรอบเข้มงวดสูงตามวงจรเข้มงวดต่ำ ทฤษฎีผลิตภัณฑ์ pcr ควั่นเดียวจากไพรเมอร์ยีนที่เฉพาะเจาะจงจะถูกสร้างขึ้นในระหว่างรอบการเข้มงวดสูงและผลิตภัณฑ์เกลียวคู่ใช้ไพรเมอร์ FP (fps) ได้รับการพัฒนาขึ้นในช่วงรอบต่ำเข้มงวด หลังจาก 3-6 รอบซ้ำของระบอบการปกครอง pcr นี้เป็นที่คาดการณ์ว่าผลิตภัณฑ์เป้าหมายที่ตั้งใจไว้มีการสังเคราะห์บางส่วนและจะมาพร้อมกับคนอื่น ๆ เชิญชมผลิตภัณฑ์ (ภาพที่ (Figure2) .2) ในขั้นตอนที่สองและที่สามPCR ที่ซ้อนกันจะถูกดำเนินการโดยใช้ 1 ul ของไพรเมอร์เป้าหมายที่เฉพาะเจาะจง (SP2/SP3 ตามลำดับ) และไพรเมอร์ FP-เฉพาะ (fsp1/fsp2 ตามลำดับ) ขั้นตอนเหล่านี้มีความเข้มงวดสูง pcr โดยใช้อุณหภูมิการหลอมสูงเพื่อให้ผลิตภัณฑ์ของเป้าหมายจะขยายการคัดเลือก เชิญชมสินค้าที่ไม่ได้รับการขยายในขั้นตอนเหล่านี้ส่วนหนึ่งเป็นเพราะวิธีการที่ซ้อนกันด้วยไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน ในนอกจากนี้กิ๊บโครงสร้างขนาดใหญ่ที่ใช้ในการเชิญชมสินค้าบางส่วนยังมีส่วนช่วยในการป้องกันที่จะขยายต่อไป (การปราบปราม pcr) จึงเชิญชมผลิตภัณฑ์ที่เกิดจากขั้นตอนแรกใน pcr fpni-PCR ไม่ได้รับการขยายในขั้นตอนที่สองและสามและกลายเป็นปรับลดอย่างมากในการผสมสุดท้าย (รูป (figure22)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

หลักการของ FPNI PCR

หลักการพื้นฐานของ FPNI PCR มีรายละเอียดในรูป Figure11 และ and2.2 Fused ศูนย์วิธีที่เป็นไพรเมอร์ลำดับเฉพาะไพรเมอร์ (การออกแบบในภูมิภาคของลำดับดีเอ็นเอที่รู้จัก), และฟิวชั่นไพรเมอร์ซึ่งประกอบด้วยการกำหนด degenerate (AD) ส่วนที่ครอบคลุมในส่วนของกำหนดลำดับ (ไพรเมอร์ฟิวชั่น) ฟิวชั่นของอะแดปเตอร์รู้จักลำดับกำหนด 5'-ตามโฆษณา (หรือรองพื้นขึ้นอยู่กับเว็บไซต์อื่น ๆ สั้น) เป็นลักษณะหลักของ FPNI-PCR (รูป (Figure1a), 1a), และเป็นนี้ติดที่ระเบียบ FPNI PCR จากหาง PCR (รูป (Figure1b) .1b) โพรโทคอล FPNI PCR ประกอบด้วย 3 ขั้นตอนหลัก ในขั้นตอนแรก เตรียมส่วนผสมขนาดใหญ่ซับซ้อนของปฏิกิริยาดีเอ็นเอโดยใช้ μL 0.4 พื้นเฉพาะยีน (SP1) ที่ออกแบบมาเพื่อภูมิภาค genomic ลำดับชื่อดัง และ μL 2.0 ของชุดไพร 9 ฟิวชั่นอำเภอใจ degenerate เมอร์ (เช่นการ FP1-9 ตาราง Table1); 1); อื่น ๆ ไพรเมอร์ที่ออกแบบมาสำหรับ FPNI PCR จะแสดงแฟ้ม 1 ตาราง S1 S5 รายละเอียดของพารามิเตอร์การขี่จักรยานและเงื่อนไข PCR ที่ใช้ในการศึกษานี้แสดงอยู่ในตาราง Table2.2 ขั้นตอนแรกนี้ประกอบด้วยการทำซ้ำ 3-6 ของรอบสูง stringency สองตามวงจร stringency ต่ำ ตามหลักวิชา สร้างผลิตภัณฑ์ PCR ตกค้างเดียวจากรองพื้นเฉพาะยีนในช่วงรอบสูง stringency และมีพัฒนาผลิตภัณฑ์ double-stranded ใช้ไพรเมอร์ FP (FPs) ในระหว่างรอบต่ำ stringency หลังจาก 3-6 รอบซ้ำของระบอบนี้ PCR มันจะทำนายว่า ผลิตภัณฑ์ตามเป้าหมายบางส่วนสังเคราะห์ และพร้อม ด้วยผลิตภัณฑ์อื่น ๆ เจาะจง (รูป (Figure2) 2) ในขั้นตอนที่สอง และสาม PCR ที่ซ้อนกันจะดำเนินการใช้ uL 1 ของเป้าหมายเฉพาะไพรเมอร์ (SP2/SP3 ตามลำดับ) และ FP เฉพาะไพรเมอร์ (FSP1/FSP2 ตามลำดับ) ตอนนี้มี stringency สูง PCR ที่ใช้หลอมอุณหภูมิสูงดังนั้นผลิตภัณฑ์เป้าหมายที่จะเลือกขยาย ผลิตภัณฑ์เจาะจงจะไม่ขยายในขั้นตอนเหล่านี้ ส่วนหนึ่งเนื่องจากวิธีซ้อนด้วยไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน นอกจากนี้ โครงสร้างใหญ่กิ๊บว่าจ้างในบางผลิตภัณฑ์ที่เจาะจงยังสนับสนุนให้ขยายเพิ่มเติม (ปราบปราม PCR) ผลิตภัณฑ์เจาะจงสร้างขึ้นจาก PCR ขั้นตอนแรกใน FPNI PCR จะไม่ขยายในขั้นตอนที่สอง และสาม และมากยกเว้นในส่วนผสมขั้นสุดท้าย (รูป (Figure22)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

หลักการของหลักการพื้นฐาน fpni - pcr

ของ fpni - pcr มีสรุปไว้ในรูปที่ ​ รูปที่ 11 และ ​ และ 2.2 วิธีการที่ศูนย์ในชุดของ primers โอบล้อม primers ตามลำดับที่กำหนด(การออกแบบในเขตพื้นที่ของดีเอ็นเอที่มีชื่อเสียง)และ primers Fusion ซึ่งมีขึ้นตาม อำเภอ ใจเสื่อมทราม(เฉพาะกิจ)ที่ส่วนที่ผสมผสานเข้ากับส่วนของตามลำดับกำหนด( primers การผสมผสาน)ที่การผสมผสานของที่มีชื่อเสียงในด้านของอะแดปเตอร์กำหนดลำดับที่ 5 ' - สิ้นสุดของที่โฆษณา(หรืออื่นๆเพื่อไปถึงได้ไม่ไกลนักโรงแรม - ขึ้นอยู่กับเชื้อปะทุ)เป็นหลักและมีลักษณะเป็น fpni - pcr (รูปที่ ​ (รูปที่ 1 ), 1 ),และเป็นลายที่จะสร้างความแตกต่างระหว่าง fpni - pcr จากหาง - pcr (รูปที่ ​ (รูปที่ 1 b ) 1 b ) โปรโตคอล fpni - pcr ที่ประกอบด้วยสามขั้นตอนสำคัญ ในขั้นตอนแรกการผสมผสานกันระหว่างคอมเพล็กซ์ขนาดใหญ่ที่เกิดปฏิกิริยาของดีเอ็นเอได้รับการจัดเตรียมโดยใช้ 0.4 μl ยีน - เฉพาะเชื้อปะทุ( SP 1 )ที่ได้รับการออกแบบมาเพื่อไปยังเขตพื้นที่ genomic ของลำดับที่รู้จักและ 2.0 μl การผสมผสานของ primers เก้าแบบผสมผสานตาม อำเภอ ใจเสื่อมทราม(เช่น FP 1-9 โต๊ะ ​ โต๊ะ 1 ) 1 ) primers อื่นๆได้รับการออกแบบสำหรับ fpni - pcr เพิ่มเติมแสดงอยู่ในไฟล์ 1 โต๊ะ S 1 - S 5 ,.รายละเอียดของการขี่จักรยานพารามิเตอร์ pcr เงื่อนไขและใช้ในการศึกษานี้จะถูกแสดงอยู่ในตาราง ​ โต๊ะ 2.2 ก้าวแรกแห่งนี้ประกอบด้วยของ 3-6 3-6 3-6 3-6 :เล่นซ้ำรอบสองระดับสูง(กฎตามด้วยวงจร(กฎต่ำ ในทางทฤษฎี ผลิตภัณฑ์ pcr สายตีเกลียวเพียงชุดเดียวจากยีนเชื้อปะทุ - เฉพาะที่จะถูกสร้างขึ้นในระหว่างรอบ(กฎสูงและ ผลิตภัณฑ์ แบบเตียงนอนเดี่ยวขนาดใหญ่หนึ่งเตียง - สายตีเกลียวด้วยการใช้ประโยชน์จาก primers FP ( fps )ได้รับการพัฒนาขึ้นมาในระหว่างหนึ่งรอบ(กฎต่ำ หลังจาก 3-6 3-6 3-6 3-6 ซ้ำแล้วซ้ำอีกรอบของการปกครองระบอบ pcr นี้คาดว่า ผลิตภัณฑ์ กลุ่มเป้าหมายที่กำหนดไว้เพียงบางส่วนมีสังเคราะห์ความถี่และมีมาพร้อมกับ ผลิตภัณฑ์ nonspecific อื่นๆ(รูปที่ ​ (รูปที่ 2 ) 2 ) ในขั้นตอนที่สองและที่สามpcr แบบซ้อนคือจัดให้บริการการใช้ 1 มาตรฐาน UL ของ primers เป้าหมายเฉพาะ( SP SP 32 /ตามลำดับ)และ FP - เฉพาะ primers ( FSP FSP 21 /ตามลำดับ) ขั้นตอนต่อไปนี้จะมี อุณหภูมิ สูงโดยใช้ pcr annealing (กฎสูงดังนั้นสินค้าเป้าหมายมีแอมพลิฟายรับแรงปะทะ ผลิตภัณฑ์ nonspecific ไม่มีแอมพลิฟายในขั้นตอนเหล่านี้ในส่วนเนื่องจากมีการซ้อนที่แตกต่างกันไปพร้อมด้วย primers ในการเพิ่มโครงสร้างขนาดใหญ่จุฑามณีที่ใช้ใน ผลิตภัณฑ์ nonspecific บางส่วนยังช่วยในการป้องกันไม่ให้มากขึ้นเพื่อการขยายสัญญาณเสียง( pcr การป้องกัน) ดังนั้น ผลิตภัณฑ์ nonspecific ที่สร้างขึ้นจากขั้นตอนที่ pcr ครั้งแรกใน fpni - pcr ไม่ได้แอมพลิฟายในขั้นตอนที่สองและที่สามและกลายเป็นเจือจางอย่างมากในครั้งสุดท้ายผสม(รูปที่ ​ (รูปที่ 22 )