. The blot-dried explants were plac

. The blot-dried explants were placed on co-cultivation medium containing; 4.3 g/l MS medium, 60.0 g/l sucrose, 10.0 g/l glucose, 2.5 mg/l BA, 1.0 mg/l IAA, 3.0 g/l gel right and 100 μM acetosyringone, and incubated in dark for 2 days at 25 ± 2 °C. After co-cultivation, explants were washed off from bacterial overgrowth using sterilized distilled water containing 500 mg/l cefotaxime. The washing process was repeated three times and then blotted to sterilized Whatman paper. The cotyledonary leaf discs were transferred (placed upside-down) on selection medium fortified with 4.3 g/l MS salts, 2.5 mg/l BA, 1.0 mg/l IAA and 15 mg/l hygromycin B and 300 mg/l cefotaxime. Proliferated shoots (2 cm high) were excised from the mother explants and transferred to rooting medium supplemented with 0.5 mg/l of IAA and 15 mg/l of hygromycin B. Tissue culture-derived tomato plantlets with good developed roots (about 11–14 cm in height) were acclimatized to ex vitro conditions.

2.2. Histochemical GUS assay

Putative transformants were examined for stable GUS expression using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide (X-Gluc), as described by Jefferson [7].

2.3. PCR analysis

DNA was isolated from GUS positive plants using CTAB method [15]. PCR screening of putative transformants was performed using specific primers for Cry 2Ab gene. The plasmid was used as a positive control. The sequences of forward and reverse primers were 5′CATTCAGCTTCCAGCACAAGAGCC3′; and 5′TGGGTGCCAGAGTTCAGGGTCACG3′, respectively. The PCR mixture were performed in a total volume of 25 μl (1.0 μl of 10 mM dNTPs, 5.0 μl 10× buffer, containing MgCl2, 2.0 μl of 50-ng/μl template DNA, 0.4 μl of Taq polymerase, 1.0 μl of 70 pmol from each primer and 14.6 μl sterile distilled water). Amplification is accomplished through a Thermal Cycler (Biometra, Germany), using first one incubation at 94 °C for 5 min and the step cycle program set to denaturant at 94 °C for 30 s, to anneal at 56 °C for 50 s and then extended at 72 °C for 75 s for a total of 30 cycles; after that, an extra step of extension at 72 °C for 10 min was performed.

2.4. Bioassay

Laboratory cultures of three lepidopterous insect species; S. littoralis, H. armigera and P. operculella were established. Laboratory scale bioassays for the transformed tomato plants were carried out. Plant material to be analyzed was washed with autoclaved distilled water. The toxicity of introduced insecticidal genes was observed by feeding the larvae of target insects on transgenic tomato leaves. Fifteen larvae representing different instars of each insect species were used for each replicate (clone). Three to four pieces of leaves of transgenic plants of different clones were fed to the larvae and the mortality was observed after 1–7 days. The experiments were repeated three times.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

. Explants บล็อทแห้งใส่ในร่วมปลูกกลางที่ประกอบด้วย กลาง 4.3 บัญชี MS, 60.0 บัญชีซูโครส กลูโคส 10.0 g/l, 2.5 mg/l BA, 1.0 mg/l IAA, 3.0 แยกเจขวา และ 100 μ m acetosyringone และมืดได้รับการกกใน 2 วันที่ 25 ± 2 องศาเซลเซียส หลังจากปลูกร่วม explants ถูกซัดออกจากแบคทีเรียห้องแถวใช้น้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อที่ประกอบด้วยเซฟโฟแทกซิม 500 mg/l กระบวนการล้างซ้ำครั้งที่สามแล้ว blotted กระดาษ Whatman ผ่านการฆ่าเชื้อ แผ่นใบ cotyledonary ถูกโอน (วางคว่ำลง) บนตัวเลือกมี 4.3 บัญชี MS เกลือ BA 2.5 mg/l, 1.0 mg/l hygromycin IAA และ 15 mg/l B และเซฟโฟแทกซิม 300 mg/l Proliferated หน่อ (สูง 2 cm) สรรพสามิตจาก explants แม่ และโอนย้ายไปทำลายสื่อเสริม ด้วย 0.5 mg/l ของ IAA และ 15 mg/l plantlets มะเขือเทศที่ได้มาเยื่อ hygromycin B. มีรากพัฒนาดี (ประมาณ 11 – 14 ซม.สูง) ถูก acclimatized ให้เช่นหลอดทดลองสภาพ2.2. histochemical GUS ทดสอบอ้างว่าฝา transformants ถูกตรวจสอบสำหรับเสถียรภาพ GUS นิพจน์โดยใช้ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide (X-Gluc), ตามที่อธิบายไว้ โดย Jefferson [7]2.3. PCR วิเคราะห์ดีเอ็นเอที่ถูกแยกจาก GUS บวกพืชโดยใช้วิธี CTAB [15] ตรวจ PCR ของ transformants อ้างว่าฝาถูกดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์เฉพาะสำหรับยีน 2Ab ร้องไห้ Plasmid ถูกใช้เป็นตัวบวก ลำดับของไพรเมอร์ไปข้างหน้า และย้อนหลังได้ 5′CATTCAGCTTCCAGCACAAGAGCC3′ และ 5′TGGGTGCCAGAGTTCAGGGTCACG3′ ตามลำดับ ดำเนินการส่วนผสม PCR ในปริมาณรวมของ 25 μl (μl 1.0 ของ dNTPs 10 มม. 5.0 μl 10 ×บัฟเฟอร์ ประกอบด้วย MgCl2, μl 2.0 ของ 50-ฉบับ/μl แม่ดีเอ็นเอ μl 0.4 ของพอลิเมอเรส Taq, μl 1.0 ของ pmol 70 จากรองพื้นแต่ละและ 14.6 μl หมันน้ำกลั่น) ขยายได้ผ่าน Cycler ความร้อน (Biometra เยอรมนี), ใช้หนึ่งก่อนบ่มที่ 94 ° C สำหรับ 5 นาที และโปรแกรมวงจรขั้นตอนตั้งค่า denaturant ไปที่ 94 ° C 30 s การหลอมที่ 56 ° C สำหรับ 50 s และจากนั้น ขยาย 72 ° c สำหรับ 75 s จำนวน 30 รอบ หลังจากนั้น มีดำเนินการขั้นตอนเพิ่มเติมของส่วนขยายที่ 72 ° C เป็นเวลา 10 นาที2.4. bioassayห้องปฏิบัติการวัฒนธรรมสามของ lepidopterous แมลงสายพันธุ์ ก่อตั้ง S. littoralis, H. armigera และ P. operculella ห้องปฏิบัติการทดลองทางชีววิทยากล้าหาญขนาดสำหรับพืชมะเขือเทศรับการเปลี่ยนแปลงที่ดำเนินการ พืชวัสดุจะวิเคราะห์ถูกล้าง ด้วยน้ำกลั่นที่นึ่ง ความเป็นพิษของยีน insecticidal นำถูกตรวจสอบ โดยการกินตัวอ่อนของแมลงเป้าหมายใบมะเขือเทศจำลอง ตัวอ่อนห้าที่แสดง instars ต่าง ๆ ของแมลงแต่ละชนิดที่ใช้สำหรับจำลองแต่ละแบบ (โคลน) ใบของพืชจำลองของโคลนที่แตกต่างกันสามถึงสี่ชิ้นถูกป้อนตัวอ่อน และตายที่ถูกตรวจสอบหลังจากวันที่ 1-7 การทดลองซ้ำกัน 3 ครั้ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

. ชิ้น blot แห้งถูกวางไว้บนกลางร่วมการเพาะปลูกที่มี; 4.3 g / l MS กลาง 60.0 กรัม / ลิตรน้ำตาลซูโครส 10.0 g / l กลูโคส 2.5 mg / l ปริญญาตรี 1.0 mg / l IAA 3.0 g / l เจลที่เหมาะสมและ 100 ไมครอน acetosyringone และบ่มในที่มืดเป็นเวลา 2 วันที่ 25 ± 2 ° C หลังจากร่วมปลูกชิ้นถูกล้างออกจากห้องแถวแบคทีเรียใช้น้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อที่มี 500 มิลลิกรัม / ลิตร cefotaxime กระบวนการล้างซ้ำสามครั้งและเปื้อนกระดาษ Whatman ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว แผ่นใบ cotyledonary ถูกโอน (วางคว่ำลง) ในสื่อเลือกเสริมด้วย 4.3 g / l เกลือ MS 2.5 mg / l ปริญญาตรี 1.0 mg / l IAA และ 15 mg / l hygromycin B และ 300 มิลลิกรัม / ลิตร cefotaxime หน่อธุ์ (2 ซม. สูง) ถูกตัดจากชิ้นส่วนแม่และย้ายไปที่การขจัดเสริมขนาดกลางที่มี 0.5 mg / l ของ IAA และ 15 mg / l ของ hygromycin บีเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่ได้มาจากต้นมะเขือเทศที่มีรากที่พัฒนาดี (ประมาณ 11-14 ซม. ความสูง) ได้รับการปรับสภาพให้เข้ากับสภาพหลอดทดลอง EX. 2.2 ฮีสโตเคมี GUS ทดสอบtransformants สมมุติมีการตรวจสอบสำหรับการแสดงออก GUS มั่นคงโดยใช้ 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide (X-Gluc) ตามที่อธิบาย [7] เจฟเฟอร์สัน. 2.3 PCR วิเคราะห์ดีเอ็นเอที่แยกได้จากพืชในเชิงบวกกัสโดยใช้วิธี CTAB [15] การตรวจคัดกรอง PCR ของ transformants สมมุติถูกดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ Cry 2AB ยีน พลาสมิดถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมในเชิงบวก ลำดับของการเดินหน้าและถอยหลังไพรเมอร์เป็น 5'CATTCAGCTTCCAGCACAAGAGCC3 '; และ 5'TGGGTGCCAGAGTTCAGGGTCACG3 'ตามลำดับ ส่วนผสม PCR ได้ดำเนินการในปริมาณรวมทั้งสิ้น 25 ไมโครลิตร (1.0 ไมโครลิตร 10 มิลลิเมตร dNTPs 5.0 ไมโครลิตร 10 ×บัฟเฟอร์ที่มี MgCl2 2.0 ไมโครลิตร 50 ng / ไมโครลิตรดีเอ็นเอแม่แบบ 0.4 ไมโครลิตรของ Taq โพลิเมอร์ 1.0 ไมโครลิตร 70 pmol จากแต่ละไพรเมอร์และ 14.6 ไมโครลิตรน้ำกลั่นหมัน) ขยายทำได้ผ่าน Cycler ความร้อน (Biometra, เยอรมนี) โดยใช้คนแรกบ่มที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีและโปรแกรมรอบขั้นตอนที่กำหนดให้ denaturant ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีเพื่อหลอมที่ 56 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 50 วินาทีและ แล้วยื่นที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 75 วินาทีจำนวน 30 รอบ; หลังจากนั้นเป็นขั้นตอนที่เพิ่มขึ้นของส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีได้ดำเนินการ. 2.4 bioassay ห้องปฏิบัติการวัฒนธรรมสามชนิดของแมลง Lepidoptera หรือหนอนผีเสื้อ; เอส littoralis เอช armigera พี operculella ถูกจัดตั้งขึ้น bioassays ระดับห้องปฏิบัติการสำหรับมะเขือเทศเปลี่ยนได้ดำเนินการ วัสดุจากพืชที่จะวิเคราะห์ถูกล้างด้วยน้ำกลั่นมวล ความเป็นพิษของยีนฆ่าแมลงที่นำมาเป็นข้อสังเกตโดยการให้อาหารตัวอ่อนของแมลงเป้าหมายบนใบมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรม สิบห้าตัวอ่อนที่เป็นตัวแทนของวัยที่แตกต่างกันของแมลงแต่ละชนิดถูกนำมาใช้สำหรับแต่ละซ้ำ (โคลน) สามถึงสี่ชิ้นจากใบของพืชดัดแปรพันธุกรรมของโคลนที่แตกต่างกันไปเลี้ยงตัวอ่อนและการเสียชีวิตได้สังเกตหลังจาก 1-7 วัน การทดลองซ้ำสามครั้ง