2. Materials and Methods2.1. Partic

2. Materials and Methods
2.1. Participant Recruitment and Serologic Screening for HIV Infection
Self-completed questionnaires and blood samples were collected
from anonymous participants at commercial male homosexual venues
of Taipei andNewTaipei City onweekends. The questionnaires included
measures of demographics, HIV testing history and sexual risk behavior
(Supplementary Table 1). A total of 1200 study participants received
pre-test counseling, were informed about the purpose of this study
and gavewritten informed consent. HIV diagnosiswasmade using a recombinant
HIV enzyme immunoassay (Murex Diagnostics Limited,
Dartford, UK). Positive test results were confirmed by HIV western
blot 2.2 (Genelab Technologies, Inc., Singapore). In addition, positive
blood samples were tested for HIV-1 subtype. Based on the regular
blood sampling every 3 months, 89 participants were infected with
HIV-1. Of the subjects who were identified to be seroconverted within
prior 6 months, 20 of themwere recruited to join thisMRJ-L evaluation
study. Another 30 uninfected subjects were randomly recruited as controls.
This studywas conductedwith the approval of the institutional review
board of the Mackay Memorial Hospital, Taipei, Taiwan.
2.2. Cell Lines and Cell Preparations
After obtaining informed consent, CD4+T lymphocytes and CD14+
monocytes were isolated from PBMCs from healthy donors and HIVinfected
patients by Ficoll-Paque gradient (GE Healthcare Life Sciences,
Pittsburgh, PA, USA) using CD4+/CD14+ magnetic microbeads
(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Laboratory personnel
were blind to the identity and HIV-1 infection status of blood donors.
To induce macrophage differentiation, monocytes isolated from donors
were maintained in RPMI1640 supplemented with 10% human AB
serum, 5% fetal bovine serum (FBS), and 50 ng/mL M-CSF (PeproTech,
Rocky Hill, NJ, USA) for seven days. Jurkat cells were cultured in
RPMI1640 supplemented with 10% FBS. In addition, phytohaemagglutinin
(PHA) was added to stimulate Jurkat cells. THP-1 (a monocyte cell line)
and U937 cells were cultured in RPMI1640 (Life Technologies, Grand
Island, NY, USA) supplemented with 10% FBS and 2 mM DMSO. 293
T cells were cultured in DMEM (Life Technologies) supplemented with
10% FBS. To induce differentiation of U937 cells into macrophage-like
cells, 200 μM phorbol myristate acetate (PMA) mitogen was added to
the culture medium, and the cells were harvested after 48 h.
2.3. Plasmids
The plasmid pEGFP–Vpr was constructed by inserting the Vpr gene
amplified from the HIV-1 pNL4-3 clone into the appropriate vectors.
The HA-MRJ-L and HA-MRJ-S plasmids were constructed in the pcDNA
vector. The lentiviral expression vector of MRJ-L was constructed in
the pLKO_AS3w.puro vector. The MRJ-L 3′UTR shRNA (shJ8_5′-GCGC
AGATGGCTAACTGAGTA) was designed using InvivoGen siRNA Wizard
v3.1 software, andwas constructed in the pLKO.1-puro vector (obtained
fromthe National RNAi Core Facility, Academia Sinica, Taiwan). All construct
identities were confirmed by sequencing the entire insert.
2.4. HIV-1 Virus Production and Viral Infection
293 T cells (2 × 106) were transfected with 2 μg of p125 (M-tropic,
ADA strain) plasmids using Lipofectamine 2000, and the supernatants
were harvested at 48 h post-transfection. Viruses were pretreated
with 2 U/mL DNase I (Life Technologies) at 37 °C for 30 min before infection,
and the viral titer was quantified using the p24 ELISA assay
(PerkinElmer, Waltham, MA,USA). Cellswith over-expressed or reduced
levels of MRJ-L were titrated to adjust for equal cell numbers, and 1 × 106
cells were infected with M-tropic strain of HIV-1 (equivalent to 25 ng of
p24 antigen) at 37 °C for 2 h. After washing three times with PBS, cells
were maintained in RPMI1640/2% FBS and half of the medium was replaced
every three days. Culture supernatants were collected every
three days for quantification of p24 antigen by HIV-1 p24 ELISA
(PerkinElmer).
2.5. Statistical Analysis
The significance level was set at 0.05, and all p values were twotailed.
Risk factors for HIV-1 infectionwere analyzed using simple logistic
regression, followed by Bayesianmultiple logistic regression because
of sparse data. The simple logistic regression was performed using
the software Stata (version 13, StataCorp, College Station, Texas) or
WinBUGS (version 1.4.3; MRC Biostatistics Unit, Cambridge, England)
when there were sparse data. Bayesian multiple regression analysis
was undertaken using the software packageWinBUGS.
2.6. Ethical Research Conduct
This study conformed to the provisions of the 1975 Helsinki Declaration
andwas approved by the institutional reviewboard of the National
Taiwan University Hospital (NTUH-201102003RC) and MackayMemorial
Hospital (13MMHIS039). All patients gave written consents before
they participated in this study.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. ผู้เข้าร่วมสรรหาและการคัดกรอง Serologic สำหรับเชื้อเอชไอวีเก็บแบบสอบถามที่เสร็จสมบูรณ์ด้วยตนเองและตัวอย่างเลือดไม่ระบุชื่อผู้เข้าร่วมที่ร้านเกย์เพศพาณิชย์ของเมืองไทเป andNewTaipei onweekends สอบถามที่รวมวัดข้อมูลประชากร เอชไอวีประวัติและพฤติกรรมเสี่ยงทางเพศ(เสริมตาราง 1) จำนวนผู้เข้าร่วมศึกษา 1200 รับทดสอบก่อนการให้คำปรึกษา ได้รับแจ้งเกี่ยวกับวัตถุประสงค์ของการศึกษานี้และ gavewritten แจ้งความยินยอม Diagnosiswasmade เอชไอวีใช้วททชเป็นเอชไอวีเอนไซม์ immunoassay (มูเร็กซ์วินิจฉัยจำกัด(มหาชน)ดราฟท์ฟอร์ด UK) ผลการทดสอบเป็นบวกถูกยืนยันจากเอชไอวีตะวันตกทำลาย 2.2 (Genelab เทคโนโลยี อิงค์ สิงคโปร์) นอกจากนี้ บวกเลือดตัวอย่างที่ทดสอบสำหรับชนิดย่อยของเชื้อเอชไอวี-1 ตามปกติติดเชื้อเลือดทุก 3 เดือน 89 คนการสุ่มตัวอย่างได้เอชไอวี-1 เรื่องที่ระบุจะเป็น seroconverted ภายในก่อน 6 เดือน 20 themwere พิจารณาให้เข้าร่วมการประเมิน thisMRJ-Lศึกษา อีกเรื่องเชื้อ 30 ถูกสุ่มคัดเป็นตัวควบคุมConductedwith studywas นี้การอนุมัติตรวจสอบสถาบันคณะแมคเคย์เมโมเรียล ไทเป ไต้หวัน2.2. บรรทัดเซลล์ และเซลล์เตรียมหลังจากได้รับแจ้งความยินยอม CD4 + T lymphocytes และ CD14 +monocytes ถูกแยกต่างหากจาก PBMCs จากผู้บริจาคมีสุขภาพดีและ HIVinfectedผู้ป่วย โดย Ficoll Paque ไล่ระดับสี (GE สุขภาพวิทยาศาสตร์สุขภาพพิตส์เบิร์ก PA สหรัฐอเมริกา) ใช้ CD4 + /mts CD14 + แม่เหล็ก microbeads(Miltenyi ไบโอเทค Bergisch Gladbach เยอรมนี) บุคลากรห้องปฏิบัติการมีคนตาบอดกับตัวตนและสถานะการติดเชื้อเอชไอวี-1 ของผู้บริจาคเลือดเพื่อก่อให้เกิดการสร้างความแตกต่าง macrophage, monocytes แยกต่างหากจากผู้บริจาคถูกจัดเก็บอยู่ใน RPMI1640 เสริม ด้วย 10% มนุษย์ ABเซรั่ม serum ตัวผู้ 5% และทารกในครรภ์ (FBS), และ 50 ng/mL M-CSF (PeproTechเขาหิน NJ สหรัฐอเมริกา) เจ็ดวัน Jurkat เซลล์มีอ่างในRPMI1640 เสริม ด้วย 10% FBS นอกจากนี้ phytohaemagglutinin(ผา) ถูกเพิ่มเข้าไปกระตุ้นเซลล์ Jurkat THP-1 (โมโนไซต์เซลล์บรรทัด)และเซลล์ U937 ได้อ่างใน RPMI1640 (เทคโนโลยีชีวิต แกรนด์เกาะ NY, USA) เสริม ด้วย 10% FBS และ DMSO 2 มม. 293T เซลล์มีอ่างใน DMEM (ชีวิตเทคโนโลยี) เสริมด้วย10% FBS ชวนดันเซลล์ U937 เช่น macrophageเซลล์ myristate 200 μM phorbol acetate (PMA) mitogen ถูกเพิ่มเข้าไปสื่อวัฒนธรรม และเซลล์เก็บเกี่ยวผลผลิตหลังจาก 48 h2.3 plasmidsPEGFP – Vpr plasmid ถูกสร้างขึ้น โดยการใส่ยีน Vprขยายจากโคลน pNL4 3 เอชไอวี-1 ที่เป็นเวกเตอร์ที่เหมาะสมฮา MRJ L และ S ฮา MRJ plasmids ถูกสร้างใน pcDNAเวกเตอร์ เวกเตอร์นิพจน์ lentiviral ของ MRJ L ถูกสร้างขึ้นในเวกเตอร์ pLKO_AS3w.puro แบบ MRJ L 3′UTR shRNA (shJ8_5′-GCGCAGATGGCTAACTGAGTA) ถูกออกแบบโดยใช้ InvivoGen siRNA ช่วยv3.1 ซอฟต์แวร์ andwas สร้างเวกเตอร์ใช้ pLKO.1 (ได้รับจากการหลัก RNAi ชาติสินเชื่อ Academia Sinica ไต้หวัน) สร้างทั้งหมดรหัสประจำตัวถูกยืนยัน โดยลำดับเบสแทรกทั้งหมด2.4 การผลิตไวรัสเอชไอวี-1 และติดเชื้อไวรัส293 T เซลล์ (2 × 106) มี transfected กับ μg 2 ของ p125 (M-ทรอปิกใช้ Lipofectamine 2000 และ supernatants plasmids ต้องใช้ ADA)มีการเก็บเกี่ยวที่ transfection หลัง 48 h ไวรัสถูก pretreatedกับ 2 U/mL DNase ฉัน (ชีวิตเทคโนโลยี) ที่ 37 ° C สำหรับ 30 นาทีก่อนที่จะติดเชื้อและ titer ไวรัสถูก quantified ใช้ p24 การทดสอบ ELISA(PerkinElmer, Waltham, MA สหรัฐอเมริกา) Cellswith แสดงมากเกินไป หรือลดลงระดับ MRJ L ที่ titrated ปรับตัวเลขเซลล์เท่า และ 1 × 106เซลล์ติดเชื้อต้องใช้ M-ทรอปิกของเอชไอวี-1 (เทียบเท่ากับ 25 ng ของการตรวจหา p24) ที่ 37 ° C สำหรับ 2 h หลังจากซักสามครั้งด้วย PBS เซลล์ถูกจัดเก็บอยู่ใน RPMI1640/2% FBS และครึ่งหนึ่งของสื่อถูกแทนทุก ๆ สามวัน Supernatants วัฒนธรรมได้รวบรวมทุกสามวันนับของการตรวจหา p24 p24 เอชไอวี-1 โดย ELISA(PerkinElmer)2.5. สถิติวิเคราะห์มีการตั้งค่าระดับนัยสำคัญที่ 0.05 และค่า p ทั้งหมดมี twotailedวิเคราะห์ปัจจัยเสี่ยงสำหรับ infectionwere เอชไอวี-1 โดยใช้โลจิสติกที่เรียบง่ายถดถอย ตาม ด้วยการถดถอยโลจิสติก Bayesianmultiple เนื่องจากข้อมูลบ่อ ถดถอยโลจิสติกอย่างที่ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Stata (รุ่น 13, StataCorp วิทยาลัยสถานี เท็กซัส) หรือWinBUGS (ฉบับปรุง 1.4.3 MRC ชีวสถิติหน่วย เคมบริดจ์ อังกฤษ)เมื่อมีข้อมูลบ่อ ทฤษฎีวิเคราะห์การถดถอยหลายได้ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ packageWinBUGS2.6. จริยธรรมวิจัยปฏิบัติการศึกษานี้ตามบทบัญญัติของปฏิญญาเฮลซิงกิ 1975andwas อนุมัติ โดย reviewboard สถาบันของชาติโรงพยาบาลมหาวิทยาลัยไต้หวัน (NTUH 201102003RC) และ MackayMemorialโรงพยาบาล (13MMHIS039) ผู้ป่วยทั้งหมดให้ consents เขียนก่อนพวกเขาเข้าร่วมในการศึกษานี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 การสรรหาผู้เข้าร่วมการศึกษาเรื่องเซรุ่มและการคัดกรองการติดเชื้อเอชไอวีสำหรับ
แบบสอบถามเสร็จตนเองและการเก็บตัวอย่างเลือด
จากผู้เข้าร่วมที่ไม่ระบุชื่อในสถานที่มีพฤติกรรมรักร่วมเพศในเชิงพาณิชย์ชาย
ไทเป andNewTaipei เมือง onweekends แบบสอบถามรวม
มาตรการของกลุ่มผู้เข้าชมประวัติศาสตร์การทดสอบเอชไอวีและพฤติกรรมเสี่ยงทางเพศ
(เสริมตารางที่ 1) รวม 1200 เข้าร่วมการศึกษาที่ได้รับ
การให้คำปรึกษาก่อนการทดสอบได้รับแจ้งเกี่ยวกับวัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้
และ gavewritten ยินยอม เอชไอวี diagnosiswasmade ใช้ recombinant
enzyme immunoassay ใช้เอชไอวี (สังข์วินิจฉัย จำกัด
เบอรี, สหราชอาณาจักร) ผลการทดสอบในเชิงบวกได้รับการยืนยันจากเอชไอวีตะวันตก
blot 2.2 (Genelab Technologies, Inc, สิงคโปร์) นอกจากนี้บวก
ตัวอย่างเลือดได้รับการตรวจ HIV-1 subtype ขึ้นอยู่กับการปกติ
สุ่มตัวอย่างเลือดทุก 3 เดือน 89 ผู้เข้าร่วมมีการติดเชื้อ
เอชไอวี-1 ของอาสาสมัครที่ได้รับการระบุที่จะ seroconverted ภายใน
ก่อน 6 เดือน, 20 ของ themwere ได้รับคัดเลือกให้เข้าร่วมการประเมินผล thisMRJ-L
การศึกษา อีก 30 วิชาที่ไม่ติดเชื้อได้รับคัดเลือกเป็นตัวควบคุมแบบสุ่ม.
นี้ studywas conductedwith รับการอนุมัติจากสถาบันตรวจสอบ
คณะกรรมการของโรงพยาบาลแมคเคย์, ไทเป, ไต้หวัน.
2.2 เซลล์และการเตรียมเซลล์
หลังจากได้รับความยินยอม, CD4 + T lymphocytes และ CD14 +
monocytes ถูกแยกจาก PBMCs จากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีและ HIVinfected
ผู้ป่วยโดยการไล่ระดับสี Ficoll-Paque (GE Healthcare วิทยาศาสตร์เพื่อชีวิต,
พิตส์เบิร์ก, PA, USA) โดยใช้ CD4 + / CD14 + Microbeads แม่เหล็ก
(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, เยอรมนี) ห้องปฏิบัติการบุคลากร
ตาบอดกับตัวตนและสถานะการติดเชื้อเอชไอวี 1 จากผู้บริจาคโลหิต.
ที่จะทำให้เกิดความแตกต่าง macrophage, monocytes แยกได้จากผู้บริจาค
ได้รับการเก็บรักษาไว้ใน RPMI1640 เสริมด้วย AB มนุษย์ 10%
ซีรั่ม, 5% ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS) และ 50 เส้นทาง / mL M-CSF (PeproTech,
ร็อคกี้ฮิลล์, นิวเจอร์ซีย์สหรัฐอเมริกา) เป็นเวลาเจ็ดวัน เซลล์ Jurkat มาเพาะเลี้ยงใน
RPMI1640 เสริมด้วย 10% FBS นอกจากนี้ phytohaemagglutinin
(PHA) ถูกเพิ่มเข้ามาในการกระตุ้นเซลล์ Jurkat THP-1 (เซลล์ monocyte)
และเซลล์ U937 มาเพาะเลี้ยงใน RPMI1640 (ไลฟ์เทคโนโลยีส์, แกรนด์
ไอส์แลนด์, NY, USA) เสริมด้วย FBS 10% และ 2 มิลลิ DMSO 293
T เซลล์ที่ถูกเลี้ยงใน DMEM (ไลฟ์เทคโนโลยีส์) เสริมด้วย
10% FBS เพื่อก่อให้เกิดความแตกต่างของเซลล์ macrophage U937 เป็นเหมือน
เซลล์ 200 ไมครอน phorbol myristate acetate (PMA) mitogen ถูกบันทึกอยู่ใน
อาหารเลี้ยงเชื้อและเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 48 ชั่วโมง.
2.3 พลาสมิด
พลาสมิด pEGFP-Vpr ถูกสร้างขึ้นโดยการใส่ยีน Vpr
ขยายจากโคลน pNL4-3 HIV-1 เป็นพาหะที่เหมาะสม.
HA-MRJ-L และพลาสมิด HA-MRJ-S ถูกสร้างขึ้นใน pcDNA
เวกเตอร์ เวกเตอร์ lentiviral การแสดงออกของ MRJ-L ถูกสร้างขึ้นใน
เวกเตอร์ pLKO_AS3w.puro MRJ-L 3'UTR shRNA (shJ8_5'-GCGC
AGATGGCTAACTGAGTA) ได้รับการออกแบบโดยใช้ InvivoGen siRNA ตัวช่วยสร้าง
ซอฟต์แวร์ v3.1, andwas สร้างเวกเตอร์ pLKO.1-บริสุทธิ์ (ที่ได้รับ
fromthe แห่งชาติ RNAi หลักสิ่งอำนวยความสะดวก, Academia Sinica ไต้หวัน) ทั้งหมดสร้าง
ตัวตนได้รับการยืนยันโดยลำดับแทรกทั้งหมด.
2.4 เอชไอวี 1 การผลิตไวรัสและการติดเชื้อไวรัส
293 T เซลล์ (2 × 106) ถูก transfected มี 2 ไมโครกรัมของ P125 (M-เขตร้อน,
สายพันธุ์ ADA) พลาสมิดใช้ Lipofectamine 2000 และ supernatants
ถูกเก็บเกี่ยวใน 48 ชั่วโมงหลังการ transfection ไวรัสที่ถูกปรับสภาพ
มี 2 U / มิลลิลิตร DNase ฉัน (ไลฟ์เทคโนโลยีส์) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีก่อนที่จะติดเชื้อ
ไวรัสและ titer ถูกวัดโดยใช้การทดสอบ ELISA p24
(PerkinElmer, เคมบริดจ์, ประเทศสหรัฐอเมริกา) Cellswith การแสดงออกหรือลด
ระดับของ MRJ-L ถูกปรับขนาดเพื่อปรับหมายเลขโทรศัพท์มือเท่ากันและ 1 × 106
เซลล์มีการติดเชื้อความเครียด M-เขตร้อนของเชื้อ HIV-1 (เทียบเท่ากับ 25 เส้นทางของ
แอนติเจน p24) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากล้างสามครั้งกับพีบีเอสเซลล์
ได้รับการเก็บรักษาไว้ใน RPMI1640 / 2% FBS และครึ่งหนึ่งของกลางถูกแทนที่
ทุกสามวัน supernatants วัฒนธรรมถูกเก็บรวบรวมทุก
สามวันสำหรับปริมาณของแอนติเจน p24 โดยเอชไอวี 1 p24 วิธี ELISA
(PerkinElmer).
2.5 การวิเคราะห์ทางสถิติ
ที่ได้รับการตั้งค่าระดับความสำคัญที่ระดับ 0.05 และค่า P ถูก twotailed.
ปัจจัยเสี่ยงต่อการติดเชื้อ HIV infectionwere-1 วิเคราะห์โดยใช้โลจิสติกง่าย
ถดถอยตามมาด้วยการถดถอยโลจิสติ Bayesianmultiple เพราะ
ข้อมูลที่เบาบาง ถดถอยโลจิสติง่ายได้รับการดำเนินการโดยใช้
ซอฟแวร์ Stata (รุ่น 13 StataCorp, คอลเลจสเตชัน) หรือ
WinBUGS (เวอร์ชัน 1.4.3; MRC ชีวสถิติหน่วยเคมบริดจ์ประเทศอังกฤษ)
เมื่อมีข้อมูลที่เบาบาง การวิเคราะห์การถดถอยพหุคูณแบบเบย์
ได้ดำเนินการโดยใช้ซอฟแวร์ packageWinBUGS.
2.6 จริยธรรมการวิจัยการดำเนินการ
ศึกษาครั้งนี้เป็นไปตามบทบัญญัติของปฏิญญาเฮลซิงกิ 1975
andwas รับการอนุมัติจาก reviewboard สถาบันแห่งชาติ
ไต้หวันโรงพยาบาลมหาวิทยาลัย (NTUH-201102003RC) และ MackayMemorial
โรงพยาบาล (13MMHIS039) ผู้ป่วยทุกรายให้ความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรก่อนที่
พวกเขามีส่วนร่วมในการศึกษาครั้งนี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . ผู้เข้าร่วมการสรรหาและการคัดกรองเอชไอวีการติดเชื้อ
test แต่ต้นทุนตนเองเสร็จแบบสอบถาม และการเก็บตัวอย่างเลือดจากผู้ที่ชายนิรนาม

ของไทเปพาณิชย์สถานที่ร่วมเพศ andnewtaipei เมือง onweekends . แบบสอบถามรวม
มาตรการของประชากร , เอชไอวีการทดสอบประวัติและพฤติกรรมเสี่ยงทางเพศ
( ตารางประกอบ 1 ) A total of 1200 study participants received
pre-test counseling, were informed about the purpose of this study
and gavewritten informed consent. HIV diagnosiswasmade using a recombinant
HIV enzyme immunoassay (Murex Diagnostics Limited,
Dartford, UK). Positive test results were confirmed by HIV western
blot 2.2 (Genelab Technologies, Inc., Singapore). In addition, positive
ตัวอย่างเลือดถูกทดสอบในกลุ่ม . ตามปกติ
เลือดทุก 3 เดือน จำนวน 89 ผู้ติดเชื้อ HIV-1
. ของกลุ่มตัวอย่างระบุเป็น seroconverted ภายใน
ก่อน 6 เดือน 20 ของอำนาจคัดเลือกเพื่อเข้าร่วมการศึกษาการประเมิน
thismrj-l . อีก 30 คน สุ่มเลือกมาก่อนเป็นการควบคุม .
This studywas conductedwith the approval of the institutional review
board of the Mackay Memorial Hospital, Taipei, Taiwan.
2.2. Cell Lines and Cell Preparations
After obtaining informed consent, CD4 T lymphocytes and CD14
monocytes were isolated from PBMCs from healthy donors and HIVinfected
patients by Ficoll-Paque gradient (GE Healthcare Life Sciences,
Pittsburgh, PA,สหรัฐอเมริกา ) ใช้ซีดี / cd14 แม่เหล็กไมโครบีดส์
( miltenyi ชีวภาพโรงเรียนดาราวิทยาลัย , เยอรมัน ) บุคลากรทางห้องปฏิบัติการ
ตาบอดกับตัวตนและสถานภาพการติดเชื้อของผู้บริจาคเลือด
ชวนแมโครเฟจโมโนไซทการแยกจากผู้บริจาค
ถูกเก็บรักษาไว้ใน rpmi1640 เสริม 10% เซรั่ม AB
มนุษย์ 5% ของวัว เซรั่ม ( FBS ) , และ 50 นาโนกรัม / มิลลิลิตร m-csf ( peprotech
ร็อคกี้ฮิลล์ , นิวเจอร์ซีย์ ,สหรัฐอเมริกา ) เจ็ดวัน jurkat เซลล์เพาะเลี้ยงในอาหารสูตร
rpmi1640 10% FBS นอกจากนี้ phytohaemagglutinin
( PHA ) ถูกเพิ่มเพื่อกระตุ้น jurkat เซลล์ thp-1 ( monocyte เซลล์เส้น )
u937 และเซลล์เพาะเลี้ยงใน rpmi1640 ( เทคโนโลยี ชีวิต
Island , NY , USA ) เสริมด้วย FBS 10% และ DMSO 2 มิลลิเมตร 293
T เซลล์เพาะเลี้ยงใน dmem ( เทคโนโลยี ) เสริมด้วย
10% FBS To induce differentiation of U937 cells into macrophage-like
cells, 200 μM phorbol myristate acetate (PMA) mitogen was added to
the culture medium, and the cells were harvested after 48 h.
2.3. Plasmids
The plasmid pEGFP–Vpr was constructed by inserting the Vpr gene
amplified from the HIV-1 pNL4-3 clone into the appropriate vectors.
การ ha-mrj-l ha-mrj-s ) และถูกสร้างขึ้นในช่วง pcdna
เวกเตอร์ การ lentiviral การแสดงออกของเวกเตอร์ mrj-l สร้างขึ้น
plko_as3w.puro เวกเตอร์ ที่ได้รับ mrj-l 3 UTR shrna ( shj8_5 ’ - gcgc
agatggctaactgagta ) ถูกออกแบบโดยบริษัท invivogen
v3.1 ตัวซอฟต์แวร์ดำเนินการก่อสร้างใน plko.1-puro เวกเตอร์ ( ที่ได้จากหลักแห่งชาติ
หาศูนย์วิชาการซินิกา ไต้หวัน ) All construct
identities were confirmed by sequencing the entire insert.
2.4. HIV-1 Virus Production and Viral Infection
293 T cells (2 × 106) were transfected with 2 μg of p125 (M-tropic,
ADA strain) plasmids using Lipofectamine 2000, and the supernatants
were harvested at 48 h post-transfection. Viruses were pretreated
with 2 U/mL DNase I (Life Technologies) at 37 °C for 30 min before infection,
and the viral titer was quantified using the p24 ELISA assay
(PerkinElmer, Waltham, MA,USA). Cellswith over-expressed or reduced
levels of MRJ-L were titrated to adjust for equal cell numbers, and 1 × 106
cells were infected with M-tropic strain of HIV-1 (equivalent to 25 ng of
p24 antigen) at 37 °C for 2 h.หลังจากล้างสามครั้งกับ PBS , เซลล์
ถูกเก็บรักษาไว้ใน rpmi1640 / 2% FBS และครึ่งหนึ่งของอาหารแทน
ทุกๆ 3 วัน supernatants วัฒนธรรมได้รวบรวมทุก
3 วันสำหรับปริมาณของ p24 แอนติเจนโดยวิธีต่างๆ p24

( Perkinelmer ) 2.5 การวิเคราะห์ทางสถิติ
ระดับนัยสำคัญทางสถิติที่ 0.05 และค่า P (
twotailed .Risk factors for HIV-1 infectionwere analyzed using simple logistic
regression, followed by Bayesianmultiple logistic regression because
of sparse data. The simple logistic regression was performed using
the software Stata (version 13, StataCorp, College Station, Texas) or
WinBUGS (version 1.4.3; MRC Biostatistics Unit, Cambridge, England)
when there were sparse data.การวิเคราะห์ถดถอยพหุคูณ การวิเคราะห์แบบเบส์
มีปัญหาการใช้ซอฟต์แวร์ packagewinbugs .
2.6 จริยธรรมวิจัย
การศึกษานี้สอดคล้องกับบทบัญญัติของปฏิญญาเฮลซิงกิ 1975
ดำเนินการอนุมัติจาก reviewboard สถาบันของโรงพยาบาลมหาวิทยาลัยแห่งชาติไต้หวัน ( ntuh-201102003rc
) และโรงพยาบาล mackaymemorial
( 13mmhis039 ) ผู้ป่วยทั้งหมดให้เขียนยินยอมก่อน
they participated in this study.