Real-time PCR amplification for enu

Real-time PCR amplification for enumeration of methanogenic archaeal 16S rRNA gene was performed using total bacterial 16S rRNA gene as reference gene according to Guo et al. (2008). Amplifications were performed in triplicate using a MJ Research PTC- 200™ Chromo4 thermocycler (MJ Research) in a 25-ml mixture containing 2 SsoAdvanced Universal SYBR®Green Supermix (Bio- Rad), 400 nmol L 1 of each primer (Table 2) and 5 ng of template DNA. The amplification conditions involved denaturation at 95 C for 3 min, followed by 40 cycles of 95 C for 15 s and 60 C for for 30 s and fluorescence data were collected at the end of the hybridization step. Optimization of assay conditions were performed for both primers and template DNA concentration and a linear regression of the threshold cycle (CT) for different DNA dilution vs the log dilution of pooled DNA was used to estimate PCR efficiency (E ¼ 10 1/slope) for each primer pair (Pfaffl, 2001) where “5” is the fold dilution. Negative DNA standards were included in each qPCR run to prove specificity of the primer pairs. Amplicon specificity was tested with a dissociation curve analysis by increasing the temperature of 0.5 C every 30 s from 65 to 95 C. Data output released by Opticon Monitor software (version 2.03 MJ Research). The relative abundance of methanogenic archaeal community was calculated using the 2 DDCT method (Pfaffl, 2001) because efficiencies of the amplification curves of the bacterial and archaeal 16S genes were equal (E ¼ 1.96). For each sample, a DCT value was calculated subtracting the bacterial 16S CT (reference gene) from the archaeal 16S CT (target gene). DCT values from PF-2 soil samples were averaged and used as calibrator (Pfaffl, 2001) in the equation: DDCT ¼ DCT(given sample) DCT(calibrator). Soils with a 2 DDCT value below 1 have lower than PF-2 methanogenic archaeal abundance, while soils with a 2 DDCT value above 1 have higher than PF-2 methanogenic archaeal abundance.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขยาย PCR แบบเรียลไทม์สำหรับการแจงนับของยีน methanogenic archaeal 16S rRNA ที่ดำเนินการโดยใช้รวมแบคทีเรีย 16S rRNA ยีนเป็นยีนอ้างอิงตามกู et al. (2008) Amplifications ได้ดำเนินการใน triplicate ใช้ thermocycler Chromo4 ™ MJ วิจัย PTC - 200 (MJ วิจัย) ในการผสมผสานระหว่าง 25 ml ประกอบด้วย 2 SsoAdvanced สากล SYBR ®กรี Supermix (ไบ - Rad), nmol 400 L 1 ของแต่ละสีรองพื้น (ตารางที่ 2) และ 5 ng ของแม่แบบดีเอ็นเอ การ denaturation เกี่ยวข้องเงื่อนไขขยายที่ C 95 ใน 3 นาที ตาม ด้วยรอบ 40 ของ 95 C สำหรับ 15 s และ C 60 สำหรับ 30 s และ fluorescence ข้อมูลถูกเก็บรวบรวมเมื่อสิ้นสุดขั้นตอนการ hybridization เพิ่มประสิทธิภาพของการทดสอบเงื่อนไขดำเนินไพรเมอร์ และความเข้มข้นของดีเอ็นเอแม่แบบ และการถดถอยเชิงเส้นของวงจรจำกัด (CT) สำหรับ vs เจือจางดีเอ็นเอต่าง ๆ เจือจางล็อกรวมเอ็นถูกใช้เพื่อประเมินประสิทธิภาพของ PCR (E ¼ 1 10 ลาด) สำหรับแต่ละคู่รองพื้น (Pfaffl, 2001) ที่ "5" จะเจือจางพับ ลบดีเอ็นเอมาตรฐานถูกรวมในแต่ละ qPCR รันเพื่อพิสูจน์ specificity คู่รองพื้น Amplicon specificity ถูกทดสอบ ด้วยการวิเคราะห์โค้ง dissociation โดยการเพิ่มอุณหภูมิของ 0.5 C ทุก ๆ 30 s จาก 65 เพื่อผลลัพธ์ข้อมูล 95 C. ออก โดยซอฟต์แวร์ตรวจสอบ Opticon (เวอร์ชัน 2.03 MJ วิจัย) มาย methanogenic archaeal ชุมชนสัมพันธ์มีคำนวณโดยใช้วิธี DDCT 2 (Pfaffl, 2001) เนื่องจากมีประสิทธิภาพขยายเส้นโค้งของยีน 16S แบคทีเรียและ archaeal ได้เท่า (E ¼ 1.96) สำหรับแต่ละตัวอย่าง ค่า DCT คำนวณลบแบคทีเรีย 16S CT (ยีนอ้างอิง) จาก archaeal 16S CT (ยีนเป้าหมาย) DCT ค่าจากตัวอย่างดิน PF 2 averaged และใช้เป็นเครื่องสอบเทียบ (Pfaffl, 2001) ในสมการ: DDCT ¼ DCT(given sample) DCT(calibrator) ดินเนื้อปูน มีค่า DDCT 2 ด้านล่าง 1 ได้มากกว่า PF 2 methanogenic archaeal อุดมสมบูรณ์ ในขณะที่มีดินเนื้อปูน มีค่า DDCT 2 ข้าง 1 มากกว่า PF 2 methanogenic archaeal มากมาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ขยาย PCR แบบ Real-time สำหรับแจงนับของมีเทน archaeal ยีน 16S rRNA ได้รับการดำเนินการโดยใช้ยีน 16S rRNA แบคทีเรียรวมเป็นยีนอ้างอิงตาม Guo et al, (2008) เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่าโดยใช้ MJ วิจัย PTC- 200 ™ Chromo4 thermocycler (MJ) การวิจัยในส่วนผสม 25 มล. มี 2 SsoAdvanced สากลSYBR®Green SU​​PERMIX (Bio- ราด) 400 nmol L 1 ของแต่ละไพรเมอร์ (ตารางที่ 2) และ 5 นาโนดีเอ็นเอแม่แบบ เงื่อนไขที่เกี่ยวข้องกับการขยาย denaturation ที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาทีตามด้วย 40 รอบจาก 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 วินาทีและ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและข้อมูลที่ถูกเก็บรวบรวมเรืองแสงในตอนท้ายของขั้นตอนการผสมข้ามพันธุ์ที่ การเพิ่มประสิทธิภาพของเงื่อนไขการทดสอบได้รับการดำเนินการสำหรับไพรเมอร์และแม่แบบของความเข้มข้นของดีเอ็นเอและการถดถอยเชิงเส้นของวงจรเกณฑ์ (CT) สำหรับการเจือจางดีเอ็นเอที่แตกต่างกันเทียบกับการลดสัดส่วนการเข้าสู่ระบบของดีเอ็นเอ pooled ถูกใช้ในการประเมินประสิทธิภาพ PCR (E ¼ 10 1 / ลาด) สำหรับ แต่ละคู่ไพรเมอร์ (Pfaffl, 2001) ที่ "5" คือการลดสัดส่วนเท่า มาตรฐานดีเอ็นเอเชิงลบรวมอยู่ในการทำงานแต่ละ qPCR ที่จะพิสูจน์ความจำเพาะของคู่ไพรเมอร์ จำเพาะ Amplicon ได้รับการทดสอบด้วยการวิเคราะห์โค้งแยกออกจากกันโดยการเพิ่มอุณหภูมิ 0.5 C ทุก 30 วินาที 65-95 ซีเอาท์พุทข้อมูลที่ออกโดยซอฟต์แวร์ Opticon การตรวจสอบ (เวอร์ชั่น 2.03 MJ วิจัย) ความอุดมสมบูรณ์ของญาติของชุมชนมีเทน archaeal ที่คำนวณโดยใช้วิธีการ DDCT 2 (Pfaffl, 2001) เนื่องจากประสิทธิภาพของเส้นโค้งการขยายของเชื้อแบคทีเรียและ archaeal ยีน 16S เท่ากับ (E ¼ 1.96) สำหรับแต่ละตัวอย่างค่า DCT ที่คำนวณได้ลบแบคทีเรีย 16S CT (อ้างอิงยีน) จาก archaeal 16S CT (ยีนเป้าหมาย) ค่า DCT จาก PF-2 ตัวอย่างดินเฉลี่ยและใช้เป็นสอบเทียบ (Pfaffl, 2001) ในสมการ DDCT ¼ DCT (ตัวอย่างที่กำหนด) DCT (สอบเทียบ) ดินที่มี 2 คุ้มค่า DDCT ต่ำกว่า 1 มีต่ำกว่า PF-2 มีเทนอุดมสมบูรณ์ archaeal ขณะดินที่มีค่า DDCT 2 ข้างต้นมี 1 สูงกว่า PF-2 มีเทน archaeal ความอุดมสมบูรณ์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เวลาจริงสำหรับการขยายเชื้อจุลินทรีย์ archaeal 16S rRNA ยีนโดยใช้แบคทีเรียรวมเบส 16S rRNA ยีนเป็นยีนอ้างอิงตามก๊วย et al . ( 2008 ) amplifications มีการปฏิบัติทั้งสามใบโดยใช้แบบวิจัย PTC - 200 ™ chromo4 เทอร์มอไซเคล ์ ( วิจัย MJ ) ใน 25 มล. ผสมที่มี 2 ssoadvanced สากล®สีเขียว SYBR supermix ( Bio - Rad )400 ? L 1 ของแต่ละหลัก ( ตารางที่ 2 ) และ 5 ของดีเอ็นเอแม่แบบ เงื่อนไขที่เกี่ยวข้องกับการขยาย ( 95 องศาเซลเซียสนาน 3 นาที แล้วตามด้วย 40 รอบ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 วินาทีและ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและการรวบรวมข้อมูลที่ปลายทำขั้นตอนการหาสภาวะที่เหมาะสมต่อผู้ป่วยทั้งชนิดและความเข้มข้นของดีเอ็นเอแม่แบบและการถดถอยเชิงเส้นของวัฏจักรธรณี ( CT ) เพื่อเจือจางดีเอ็นเอแตกต่างกัน ปะทะ ล็อก ( Pooled DNA PCR ใช้ประเมินประสิทธิภาพ ( E ¼ 10 1 / ลาด ) สำหรับแต่ละคู่ไพรเมอร์ ( pfaffl , 2001 ) ว่า " 5 " เป็น พับเจือจางดีเอ็นเอมาตรฐานลบที่รวมอยู่ในแต่ละ qpcr วิ่งเพื่อพิสูจน์ของไพรเมอร์คู่ specificity และความจำเพาะ คือ ทดสอบด้วยการเพิ่มเส้นโค้งการวิเคราะห์อุณหภูมิ 0.5 C ทุก 30 วินาที จาก 65 ถึง 95 องศาเซลเซียส ส่งออกข้อมูลที่ออกโดยซอฟต์แวร์ตรวจสอบ opticon ( เวอร์ชั่น 2.03 MJ วิจัย )ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของชุมชน archaeal มีเทน คือ คำนวณโดยใช้วิธี 2 ddct ( pfaffl , 2001 ) เนื่องจากการเพิ่มประสิทธิภาพของเส้นโค้งของเชื้อแบคทีเรียและ archaeal ยีน 16S ( E ¼เท่ากับ 1.96 ) สำหรับแต่ละตัวอย่าง , ข้อมูลค่าคำนวณหัก CT ใช้แบคทีเรีย ( ยีนอ้างอิงจาก CT ( archaeal ( ยีนเป้าหมาย )ข้อมูลจากการเก็บตัวอย่างดินจาก pf-2 ถูกเฉลี่ยค่าใช้คาลิเบรเตอร์ ( pfaffl , 2001 ) ในสมการ : ddct ¼ DCT ( ตัวอย่าง ) DCT ( คาลิเบรเตอร์ ) ดินมี 2 ddct ด้านล่าง 1 มีมูลค่ากว่า 8 pf-2 archaeal ความอุดมสมบูรณ์ ในขณะที่ดินมีมูลค่า 2 ddct ข้างบน 1 มีสูงกว่า pf-2 จุลินทรีย์ archaeal ความอุดมสมบูรณ์