2. Methods and materials2.1. Materi

2. Methods and materials
2.1. Materials
Pep-1 (Ac-KETWWETWWWEWSQPKKKRKV-Cya) was obtained from
Active Motif (Carlsbad, CA). Horseradish peroxidase (HRP, peroxidase
type XII from horseradish) and hexadecane were obtained from SigmaAldrich.
Maleic anhydride, furan, 4-dimethylaminopyridine (DMAP), 1-
(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC),
1,3-di-boc-2-(2-hydroxyethyl)guanidine, N-hydroxysuccinimide,
norbornene acid, 4-chloro-7-nitrobenzofurazan, N-boc-ethylenediamine,
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA), ethyl vinyl ether, trifluoroacetic acid
(TFA), methanol (MeOH), ethyl acetate (EtOAc), pentane, N,Ndimethylformamide
(DMF), hexanes and tetrahydrofuran (THF) were
obtained as reagent grade from Aldrich, Fisher Scientific, Fluka or Acros
and used as received. 3rd generation Grubbs catalyst (dichloro-di(3-
bromopyridino)-N,N′-dimesitylenoimidazolino-Ru = CHPh; G3) was
synthesized as described previously by Grubbs and coworkers. 1
Dichloromethane (CH2Cl2) (HPLC grade, Fisher Scientific) was distilled
from CaH2 under nitrogen. Spectra/Por® Biotech Cellulose Ester (CE)
dialysis membranes with a molecular weight cutoff (MWCO) of
100–500 g/mol were purchased from Spectrum Medical Industries. The
Amplex Red enzymatic substrate for HRP was obtained from Invitrogen.
Low melting point agarose, hydrogen peroxide and HEPES buffer
were obtained from Fisher Scientific. 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-
phosphocholine (DPhPC), 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-
rac-glycerol) (sodium salt) (DPhPG), and egg yolk phosphatidylcholine
(EYPC) lipids were purchased from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)
and 5(6)-carboxyfluorescein (CF) was purchased from Fluka.
2.2. Preparation of DPhPC and DPhPC/DPhPG vesicles
All vesicle solutions were prepared in 10 mM HEPES and 150 mM
NaCl was buffered to pH 7.4 with sodium hydroxide. 2 mM DPhPC vesicle
solution was prepared by air-drying an aliquot of DPhPC in pentane
until the solvent was removed, followed by further drying in a vacuum
desiccator for 30 min. Lipids were resuspended in buffer and extruded
21 times through a polycarbonate filter with 100 nm track-etched
pores (Millipore) using a mini-extruder (Avanti). For negatively
charged vesicles, a 2 mM solution was prepared with a 9:1 M ratio of
DPhPC to DPhPG.
2.3. Preparation of Pep-1 complexes and D9-NBD/HRP mixtures
A 500 μM stock solution of Pep-1 was prepared by dissolution in
18 MΩ water and was then stored as 5 μL aliquots in lo-bind eppendorf
tubes at −20 °C. A 50 μM stock solution of HRP was prepared by dissolution
in 18 MΩ water and was then stored as aliquots at −20 °C.
50 mM Amplex Red was prepared by dissolution in DMSO and stored
at −4 °C. Pep-1/HRP complexes were prepared fresh from the stock solutions
prior to each experiment. First, Pep-1 and HRP were diluted in
water to 40 μM and 2 μM, respectively. Second, equal volumes of these
dilutions were mixed and incubated at room temperature for 30 min.
Finally, a 2 μL aliquot of complex was mixed with 18 μL of vesicle solution
to create the solution used as the source droplet. The final concentrations
of Pep-1 and HRP in the complex containing droplet were 2 μM
and 100 nM, respectively.
2.4. Preparation of D9-NBD/HRP complexes
A 2 mM stock solution of D9-NBD was stored in DMSO as 50 μL aliquots.
A 50 μM stock solution of HRP was prepared by dissolution in
18 MΩ water and stored in aliquots at −20 °C. D9-NBD/HRP complexes
were prepared fresh from the stock solutions prior to each experiment.
First, D9-NBD and HRP were diluted in water. Second, equal volumes of
these dilutions were mixed and incubated at room temperature for
30 min. In experiments where the D9-NBD and HRP were present in opposing
droplets, the D9-NBD and HRP were incubated separately with a

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วิธีการและวัสดุ
2.1 วัสดุห้าวหาญ-1 (Ac-KETWWETWWWEWSQPKKKRKV-Cya) ที่ได้รับจาก Motif ใช้งาน (คาร์ลส, แคลิฟอร์เนีย) มะรุม peroxidase (HRP, peroxidase ประเภทสิบจากพืชชนิดหนึ่ง) และ hexadecane ที่ได้รับจาก SigmaAldrich. แอนไฮได Maleic, furan 4 dimethylaminopyridine (DMAP) 1- (3-dimethylaminopropyl) ไฮโดรคลอไร -3-ethylcarbodiimide (EDC) 1,3- di-BOC-2- (2-hydroxyethyl) guanidine N-hydroxysuccinimide, กรด norbornene 4 chloro-7-nitrobenzofurazan N-BOC-ethylenediamine, N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) เอทิลอีเทอร์ไวนิลกรด TRIFLUOROACETIC ( TFA), เมทานอล (เมธานอล) เอทิลอะซิเตท (EtOAc), เพ็นเทน, N, Ndimethylformamide (DMF) เฮกเซนและ tetrahydrofuran (THF) กำลังได้รับเป็นเกรดสารจากดิช, ฟิชเชอร์วิทยาศาสตร์ Fluka หรือ Acros และใช้เป็นที่ได้รับ ตัวเร่งปฏิกิริยากรับส์รุ่นที่ 3 (dichloro-di (3 bromopyridino) -N, n 'dimesitylenoimidazolino-Ru = CHPh; G3) ถูกสังเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยกรับส์และเพื่อนร่วมงาน 1 Dichloromethane (CH2Cl2) (เกรด HPLC ฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์) ถูกกลั่นจากCaH2 ภายใต้ไนโตรเจน Spectra / Por®เซลลูโลสไบโอเทคเอสเตอร์ (CE) เยื่อฟอกเลือดด้วยการตัดน้ำหนักโมเลกุล (MWCO) ของ100-500 กรัม / โมลที่ซื้อมาจากสเปกตรัมอุตสาหกรรมการแพทย์ ตั้งต้นเอนไซม์แดง Amplex สำหรับ HRP ที่ได้รับจาก Invitrogen. จุดหลอมเหลวต่ำ agarose ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์และบัฟเฟอร์ HEPES ที่ได้รับจากฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ 1,2-Diphytanoyl-SN-glycero-3 phosphocholine (DPhPC), 1,2-diphytanoyl-SN-glycero-3-phospho- (1'- RAC-กลีเซอรอล) (เกลือโซเดียม) (DPhPG) และไข่แดง phosphatidylcholine (EYPC) ไขมันที่ซื้อมาจากขั้วโลก Avanti ไขมัน (เศวตศิลา, AL) และ 5 (6) -carboxyfluorescein (CF) ซื้อมาจาก Fluka. 2.2 การจัดทำและ DPhPC DPhPC / DPhPG ถุงทั้งหมดโซลูชั่นตุ่มได้จัดทำขึ้น10 มิลลิ HEPES และ 150 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ถูกบัฟเฟอร์ค่าpH 7.4 ที่มีโซเดียมไฮดรอกไซ 2 มิลลิ DPhPC ตุ่มวิธีการแก้ปัญหาที่ถูกจัดทำขึ้นโดยเครื่องอบแห้งaliquot ของ DPhPC ในเพ็นเทนจนตัวทำละลายจะถูกลบออกตามด้วยการอบแห้งต่อไปในสูญญากาศเดซิเป็นเวลา30 นาที ไขมันถูก resuspended ในบัฟเฟอร์และอัด21 ครั้งผ่านตัวกรองโพลีคาร์บอเนตที่มี 100 นาโนเมตรสลักติดตามรูขุมขน(ค) โดยใช้เครื่องอัดรีดมินิ (Avanti) สำหรับในเชิงลบถุงคิดค่าบริการเป็นทางออกที่ 2 มิลลิถูกจัดทำขึ้นด้วย 9: 1 M อัตราส่วน. DPhPC เพื่อ DPhPG 2.3 การเตรียมความห้าวหาญ-1 คอมเพล็กซ์และ D9-NBD / HRP ผสม500 ไมครอนแก้ปัญหาสต็อกของความห้าวหาญ-1 ถูกจัดทำขึ้นโดยการสลายตัวใน18 MΩน้ำและถูกเก็บไว้แล้ว 5 ไมโครลิตร aliquots ใน Eppendorf ทองหล่อผูกท่อที่อุณหภูมิ-20 องศาเซลเซียส 50 ไมครอนแก้ปัญหาสต็อกของ HRP ถูกจัดทำขึ้นโดยการสลายตัวใน18 MΩน้ำและถูกเก็บไว้เป็น aliquots ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส. 50 มิลลิ Amplex แดงถูกจัดทำขึ้นโดยการละลายใน DMSO และเก็บไว้ที่-4 ° C คอมเพล็กซ์ห้าวหาญ-1 / HRP ได้จัดทำสดใหม่จากโซลูชั่นหุ้นก่อนที่จะมีการทดสอบในแต่ละ ครั้งแรกที่ห้าวหาญ-1 และ HRP ถูกเจือจางในน้ำถึง40 ไมครอนและ 2 ไมครอนตามลำดับ ประการที่สองปริมาณที่เท่ากันของเหล่านี้เจือจางผสมและบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที. สุดท้ายหาร 2 ไมโครลิตรที่ซับซ้อนผสมกับ 18 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาตุ่มในการสร้างโซลูชั่นที่ใช้เป็นหยดแหล่งที่มา ความเข้มข้นสุดท้ายของห้าวหาญ-1 และ HRP ที่ซับซ้อนที่มีหยด 2 ไมครอนและ100 นาโนเมตรตามลำดับ. 2.4 การเตรียม D9-NBD / HRP คอมเพล็กซ์ทางออกที่2 มิลลิหุ้นของ D9-NBD ถูกเก็บไว้ใน DMSO 50 ไมโครลิตร aliquots. 50 ไมครอนแก้ปัญหาสต็อกของ HRP ถูกจัดทำขึ้นโดยการสลายตัวใน18 MΩน้ำและเก็บไว้ใน aliquots ที่ -20 ° C . D9-NBD / คอมเพล็กซ์ HRP ได้จัดทำสดใหม่จากโซลูชั่นหุ้นก่อนที่จะมีการทดสอบแต่ละ. แรก D9-NBD และ HRP ถูกเจือจางในน้ำ ประการที่สองปริมาณที่เท่ากันของเจือจางผสมเหล่านี้และได้รับการบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา30 นาที ในการทดลองที่ D9-NBD และ HRP มีอยู่ในฝ่ายตรงข้ามหยดที่D9-NBD และ HRP ถูกบ่มแยกต่างหากด้วย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วิธีการและวัสดุ
2.1 . pep-1 วัสดุ
( AC ketwwetwwwewsqpkkkrkv cya ) ได้จาก
ปราดเปรียวแม่ลาย ( Carlsbad , CA ) มะรุม เปอร์ออกซิเดส ( HRP , Peroxidase
ประเภท XII จากพืชชนิดหนึ่ง ) และเฮกซะเดกเคนได้จาก sigmaaldrich .
มาเลอิกแอนไฮไดรด์ 4-dimethylaminopyridine Furan , , ( dmap ) , 1 -
( 3-dimethylaminopropyl ) - 3-ethylcarbodiimide ไฮโดรคลอไรด์ ( EDC )
13-di-boc-2 - ( 2-hydroxyethyl ) กัวนิดีน n-hydroxysuccinimide
, , Norbornene กรด 4-chloro-7-nitrobenzofurazan n-boc-ethylenediamine
, , N , n-diisopropylethylamine ( dipea ) เอทิลไวนิลอีเทอร์ , กรดไตรฟลูออโรอะซิติก
( ระดับ ) , เมทานอล ( เมทิลแอลกอฮอล์ ) , เอทิลอะซิเตท ( etoac ) เพนเทน , N , ndimethylformamide
( DMF ) hexanes และเตตระไฮโดรฟแรน ( เตตระไฮโดรฟูแรน ) ได้แก่
ได้เป็น 3 เกรด Aldrich ฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์fluka หรือ acros
และใช้เป็นรับ รุ่นที่ 3 ของกรับส์ตัวเร่งปฏิกิริยา ( dichloro ตี้ ( 3 -
bromopyridino ) - N , n ’ - dimesitylenoimidazolino รุ = chph ; G3
) ถูกสังเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดย กรับส์ และเพื่อนร่วมงาน 1
ไดคลอโรมีเทน ( ch2cl2 ) ( HPLC Grade , ฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ ) คือกลั่นจาก cah2
ภายใต้ไนโตรเจน สเปกตรัม / ปอ®ชีวภาพเซลลูโลสเอสเตอร์ ( CE )
ล้างเมมเบรนที่มีน้ำหนักโมเลกุล ( ตัด mwco )
100 - 500 กรัม / โมล ซื้อมาจากอุตสาหกรรมการแพทย์สเปกตรัม
amplex แดงเอนไซม์พื้นผิวสำหรับชได้จาก Invitrogen .
( จุดหลอมเหลวต่ำ ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ และฮีเปสบัฟเฟอร์
ได้จากชาวประมงทางวิทยาศาสตร์ 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3 -
phosphocholine ( dphpc ) 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phospho นั้น -
- ( 1กลีเซอรอล ( RAC ) โซเดียม ( เกลือ ) dphpg ) และไข่แดง ฟอสฟาติดิลโคลีน
( eypc ) ไขมัน ซื้อมาจาก AVANTI ขั้วโลกไขมัน ( เศวตศิลา , Al )
5 ( 6 ) - carboxyfluorescein ( CF ) ซื้อมาจาก fluka .
2.2 . การเตรียมและ dphpc dphpc / dphpg เล็ก
โซลูชั่นทั้งหมดเตรียมยื่น 10 ฮีเปสมม. ขนาด 150 มม.
เป็นกันชนให้ pH 7.4 กับโซเดียม ไฮดรอกไซด์ dphpc เวสิเคิล
2 มม.โซลูชั่นที่เตรียมได้จากอากาศแห้งเป็นส่วนลงตัวของ dphpc ในเพนเทน
จนกว่าตัวทำละลายออก ตามด้วยการอบแห้ง เพิ่มเติมในสุญญากาศ
เดซิกเคเตอร์เป็นเวลา 30 นาที ไขมันเป็น resuspended ในบัฟเฟอร์และอัด
21 ครั้งผ่านกรองโพลีคาร์บอเนต 100 nm ติดตามรอย
รูขุมขน ( มิลลิ ) โดยใช้เครื่องอัดรีดขนาดเล็ก ( ลุกขึ้น ) สำหรับลบ
คิดเล็ก , โซลูชั่น 2 มม. พร้อมด้วย 9 :อัตราส่วน 1 M
dphpc เพื่อ dphpg .
2.3 การเตรียมสารประกอบเชิงซ้อน pep-1 และผสม d9-nbd / HRP
500 μ M หุ้นโซลูชั่นของ pep-1 เตรียมจากการละลายใน
18 M Ωน้ำและก็เก็บไว้เป็น 5 μผมเฉยๆใน Lo มัดเพนดอร์ฟ
หลอด 20 องศา μ m − 50 หุ้นโซลูชั่นของ HRP เตรียมจากการละลาย
18 ม. Ωน้ำและก็เก็บไว้เป็น− 20 ° C .
เฉยๆ ที่50 mm amplex สีแดงถูกเตรียมโดยการละลายใน DMSO และเก็บไว้
ที่− 4 องศา pep-1 / HRP เชิงซ้อนเตรียมสดจากหุ้นโซลูชั่น
ก่อนในแต่ละการทดลอง แรก และ pep-1 HRP ถูกเจือจางในน้ำ 40 μ m
2 μเมตร ตามลำดับ ประการที่สอง ปริมาณเท่ากันของวิธีการเหล่านี้
ผสมบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที
ในที่สุด2 μ L ส่วนลงตัวของซับซ้อนผสมกับ 18 μ l
โซลูชั่นประเทศไทยเพื่อสร้างโซลูชันที่ใช้เป็นแหล่งที่มาของอนุภาค สุดท้ายและความเข้มข้นของ pep-1
ชในที่ซับซ้อนที่มีหยด 2 μ M
100 นาโนเมตร
2.4 . การเตรียม d9-nbd / HRP เชิงซ้อน
2 มม. โซลูชั่นหุ้นของ d9-nbd ถูกเก็บไว้ใน DMSO เป็น 50 μ
L เฉยๆ .50 μ M หุ้นโซลูชั่นของ HRP เตรียมจากการละลายใน
18 M Ωน้ำและเก็บไว้เฉยๆที่− 20 องศา d9-nbd / HRP เชิงซ้อน
เตรียมสดจากหุ้นโซลูชั่นก่อนการทดลองแต่ละ .
ครั้งแรก d9-nbd HRP ) และเจือจางในน้ำ ประการที่สอง เท่ากับปริมาตรของ
วิธีการเหล่านี้มาผสมบ่มที่อุณหภูมิห้อง
30 นาทีในการทดลองที่ d9-nbd HRP และอยู่ตรงข้าม
หยด , d9-nbd HRP ) และบ่มแยกกับ