General properties of fluorescent p

General properties of fluorescent proteins

Regardless of the originating species or degree of genetic manipulation, all FPs are ~25 kD in size, which is large compared with organic fluorophores (such as fluorescein or Texas Red) with average sizes of around 1 kD. Despite their rather large size, FPs are beneficial for many applications, in particular for live-cell and whole-animal imaging. FPs are genetic labels and thus can be ‘built in’ using transgenic approaches. As labels are created within the cell, there is no need for labeling with exogenous agents, or the fixation and permeabilization procedures that are required for immunofluorescence. FPs can also be fused to their protein targets, so that they are expressed in a 1:1 ratio with the target molecule, a fact that, of course, is ideal for quantitative imaging (Patterson et al., 1997).

One of the most important points regarding FPs is that the entire protein structure is essential to the development and maintenance of its fluorescence (Remington, 2006). The FP structure consists of an extremely rigid β-barrel-fold comprising 11 β-sheets that surround a central α-helix (Ormo et al., 1996). In all of the jellyfish and coral FPs studied thus far, the principle chromophore is derived from only a few crucial amino acids that are located near the center of the β-barrel (see ‘β-barrel motif’ in the poster). However, unlike the amino acids of most soluble proteins, many of the interior amino acids in FPs are charged or polar. They bind numerous water molecules and lock them into rigid conformations inside the protein. Within the context of this specific environment, a reaction occurs between key FP amino acids to form an imidazole ring with extended conjugation (Tsien, 1998). The fluorescence of these proteins is highly dependent on the unique chemical environment surrounding the chromophore, as evidenced by the fact that synthetic chromophore analogs are devoid of fluorescence (Follenius-Wund et al., 2003). Changes to the local chromophore environment also produce dramatic variations in spectral characteristics, photostability, acid resistance and a variety of other physical properties.

The mechanism of chromophore formation is thought to be similar for every FP, regardless of the source (Remington, 2006). Examination of the amino acid sequences of over 100 naturally occurring chromophore variants from many species revealed that only four residues are absolutely conserved (Remington, 2006). The first residue is G67, which is crucial for cyclization of the chromophore through nucleophilic attack; consequently, any mutation of this amino acid completely obliterates chromophore formation. The second conserved residue is Y66, which is also involved in chromophore formation. However, mutagenesis studies show that any aromatic residue can replace Y66 (Heim et al., 1994), and it is therefore puzzling why this amino acid is so highly conserved in nature. The last two conserved amino acid residues are R96 and E222, both of which are catalytic residues that are positioned near the chromophore and essential to the maturation process. Several other residues near the chromophore, such as G20, G33, Gl91 and F130, are also conserved among FPs and are also thought to be involved in chromophore formation. As most of the other residues are not conserved, FPs can accommodate a high degree of modification to create proteins with different physical properties (Day and Davidson, 2009; Shaner et al., 2007).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

คุณสมบัติทั่วไปของโปรตีนเรืองแสง

โดยไม่คำนึงถึงสายพันธุ์ที่มีต้นกำเนิดหรือระดับของการจัดการทางพันธุกรรมเฟรมต่อวินาทีทั้งหมดที่มี ~ 25 KD ในขนาดที่มีขนาดใหญ่เมื่อเทียบกับ fluorophores อินทรีย์ (เช่น fluorescein หรือเท็กซัสสีแดง) ที่มีขนาดเฉลี่ยประมาณ 1 KD แม้จะมีขนาดค่อนข้างใหญ่ของพวกเขาเฟรมต่อวินาทีเป็นประโยชน์สำหรับการใช้งานจำนวนมากโดยเฉพาะอย่างยิ่งเพื่อชีวิตเซลล์และทั้งการถ่ายภาพสัตว์เฟรมต่อวินาทีเป็นป้ายทางพันธุกรรมและจึงสามารถ 'สร้าง' ใช้วิธีการดัดแปรพันธุกรรม เป็นป้ายชื่อจะถูกสร้างขึ้นภายในเซลล์มีความจำเป็นสำหรับการติดฉลากกับตัวแทนจากภายนอกหรือการตรึงและการผ่านขั้นตอนที่จำเป็นสำหรับการ immunofluorescence ไม่มี เฟรมต่อวินาทีนอกจากนี้ยังสามารถผสมกับโปรตีนเป้าหมายของพวกเขาเพื่อที่พวกเขาจะแสดงใน 1:1 ด้วยโมเลกุลเป้าหมายที่ความเป็นจริงว่าของหลักสูตรเป็นที่เหมาะสำหรับการถ่ายภาพเชิงปริมาณ (แพตอัล., 1997).

หนึ่งในจุดที่สำคัญที่สุดเกี่ยวกับเฟรมต่อวินาทีคือโปรตีนโครงสร้างทั้งหมดเป็นสิ่งจำเป็นต่อการพัฒนาและการบำรุงรักษาของการเรืองแสงของ (เรมิงตัน 2006) โครงสร้าง FP ประกอบด้วยเข้มงวดมากβ-บาร์เรลเท่าประกอบด้วย 11 แผ่นβที่ล้อมรอบกลางα-เกลียว (ormo et al,., 1996)ในทั้งหมดของแมงกะพรุนและเฟรมต่อวินาทีปะการังศึกษาป่านนี้ chromophore หลักการที่ได้มาจากเพียงไม่กี่ที่สำคัญกรดอะมิโนที่อยู่ใกล้ศูนย์กลางของβ-บาร์เรล (ดู 'β-บาร์เรลเด่นในโปสเตอร์) แต่แตกต่างจากกรดอะมิโนของโปรตีนที่ละลายน้ำได้มากที่สุดจำนวนมากของกรดอะมิโนในการตกแต่งภายในเฟรมต่อวินาทีจะเรียกเก็บหรือขั้วโลกพวกเขาผูกโมเลกุลของน้ำจำนวนมากและล็อคไว้ใน conformations แข็งภายในโปรตีน ในบริบทของสภาพแวดล้อมที่เฉพาะเจาะจงนี้ปฏิกิริยาเกิดขึ้นระหว่างกรดอะมิโน FP กุญแจสำคัญในการสร้างแหวน imidazole ด้วยผันขยาย (Tsien, 1998) การเรืองแสงของโปรตีนเหล่านี้จะสูงขึ้นอยู่กับสภาพแวดล้อมทางเคมีที่ไม่ซ้ำกันโดยรอบ chromophore,เป็นหลักฐานโดยความจริงที่ว่า analogs chromophore สังเคราะห์จะไร้แสง (follenius wund-et al,., 2003) การเปลี่ยนแปลงของสภาพแวดล้อม chromophore ท้องถิ่นยังผลิตรูปแบบที่น่าทึ่งในลักษณะสเปกตรัม photostability ต้านทานกรดและความหลากหลายของคุณสมบัติทางกายภาพอื่น ๆ .

กลไกของการสร้าง chromophore เป็นความคิดที่จะคล้ายกันสำหรับทุก FP,โดยไม่คำนึงถึงแหล่งที่มา (เรมิงตัน 2006) การตรวจสอบของลำดับกรดอะมิโนกว่า 100 สายพันธุ์ที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติ chromophore จากหลายชนิดพบว่ามีเพียงสี่ตกค้างป่าสงวนอย่าง (เรมิงตัน 2006) สารตกค้างแรกคือ G67 ซึ่งเป็นสิ่งสำคัญสำหรับ cyclization ของ chromophore ผ่านโจมตี nucleophilic; ดังนั้นการกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนนี้อย่างสมบูรณ์ obliterates สร้าง chromophore สารตกค้างป่าสงวนที่สองคือ y66 ซึ่งยังมีส่วนเกี่ยวข้องในการสร้าง chromophore แต่การศึกษาแสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ที่เหลือมีกลิ่นหอมใด ๆ สามารถแทนที่ y66 (เฮย์มเอตอัล. 1994) และมันจึงทำให้งงว่าทำไมกรดอะมิโนนี้เป็นป่าสงวนเพื่อให้สูงในธรรมชาติช่วงสองป่าสงวนกรดอะมิโนที่เป็น r96 และ e222 ซึ่งทั้งสองอย่างนี้เป็นปัจจัยที่ตกค้างอยู่ในตำแหน่งที่ใกล้ chromophore และมีความจำเป็นที่จะดำเนินการเต็มที่ อื่น ๆ อีกหลายตกค้างใกล้ chromophore เช่น G20, G33 gl91 และ F130, ป่าสงวนยังอยู่ในหมู่เฟรมต่อวินาทีและยังมีความคิดที่จะมีส่วนร่วมในการสร้าง chromophore เป็นส่วนใหญ่ของสารตกค้างอื่น ๆ จะไม่อนุรักษ์เฟรมต่อวินาทีสามารถรองรับระดับสูงของการปรับเปลี่ยนในการสร้างโปรตีนที่มีคุณสมบัติทางกายภาพที่แตกต่างกัน (วันและเดวิดสัน, 2009;. Shaner et al, 2007)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

คุณสมบัติทั่วไปของโปรตีนเรืองแสง

ชนิดหรือระดับของการจัดการทางพันธุกรรมเริ่มต้น FPs ทั้งหมด ~ 25 kD ใน มีขนาดใหญ่เมื่อเทียบกับ fluorophores อินทรีย์ (เช่น fluorescein หรือเท็กซัสแดง) มีขนาดโดยเฉลี่ยประมาณ 1 kD แม้ มีขนาดค่อนข้างใหญ่ FPs ได้เป็นประโยชน์สำหรับการใช้งานมาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับภาพ เซลล์สด และ สัตว์ทั้งหมด FPs เป็นป้ายทางพันธุกรรม และจึง สามารถ 'สร้าง' ใช้วิธีถั่วเหลือง เป็นป้ายชื่อจะถูกสร้างขึ้นภายในเซลล์ มีไม่จำเป็นต้องติดฉลากด้วยบ่อยตัวแทน หรือขั้นตอนปฏิกิริยาการตรึงและ permeabilization ที่จำเป็นสำหรับ immunofluorescence FPs สามารถยังสามารถ fused เพื่อเป้าหมายของโปรตีน เพื่อว่าพวกเขาจะแสดงในอัตรา 1:1 กับโมเลกุลเป้าหมาย ความจริง ที่ แน่นอน เป็นภาพเชิงปริมาณ (Patterson และ al., 1997)

จุดสำคัญเกี่ยวกับ FPs อย่างใดอย่างหนึ่งได้ว่าโครงสร้างทั้งหมดโปรตีนจำเป็นต่อการพัฒนาและบำรุงรักษาของ fluorescence (เรมิงตัน 2006) FP โครงสร้างประกอบด้วยมีมากแข็งβ-บาร์เรลพับประกอบแผ่นβที่มีเซ็นทรัลα-เกลียว (Ormo et al., 1996) 11 ในแมงกะพรุนและ FPs ปะการังศึกษาฉะนี้ chromophore หลักมาเพียงกี่กรดอะมิโนสำคัญที่อยู่ใกล้ศูนย์กลางของกระบอกβ (ดู 'สาระสำคัญβบาร์เรล' ในโปสเตอร์ที่) อย่างไรก็ตาม ซึ่งแตกต่างจากกรดอะมิโนของโปรตีนที่ละลายน้ำได้มากที่สุด กรดอะมิโนภายใน FPs มากมายได้คิดค่าธรรมเนียม หรือขั้วโลก พวกเขาผูกกับโมเลกุลของน้ำจำนวนมาก และล็อคพวกเขาเป็น conformations แข็งภายในโปรตีน ภายในบริบทของสภาพแวดล้อมนี้เฉพาะ ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นระหว่างกรดอะมิโน FP คีย์แบบมีแหวนอิมิดาโซลกับขยาย conjugation (Tsien, 1998) Fluorescence ของโปรตีนเหล่านี้จะสูงขึ้นอยู่กับระบบเคมีเฉพาะรอบ chromophore เป็นหลักฐานความจริงที่สังเคราะห์ chromophore analogs จะปราศจาก fluorescence (Follenius-Wund และ al., 2003) การเปลี่ยนแปลงสภาพแวดล้อมท้องถิ่น chromophore ยังผลิตรูปแบบละครในลักษณะสเปกตรัม photostability ความต้านทานต่อกรด และความหลากหลายของอื่น ๆ ทางกายภาพคุณสมบัติ

กลไกของ chromophore ก่อตัวเป็นความคิดที่จะเหมือนกันสำหรับทุก FP ไม่ว่าแหล่ง(เรมิงตัน 2006) ตรวจกรดอะมิโนลำดับ 100 กว่าตัวแปร chromophore ธรรมชาติที่เกิดขึ้นจากหลายชนิดเปิดเผยเฉพาะสี่ตกแน่นอนอาศัย(เรมิงตัน 2006) สารตกค้างแรกคือ G67 ซึ่งเป็นสิ่งสำคัญสำหรับ cyclization chromophore ผ่านโจมตี nucleophilic ดังนั้น การกลายพันธุ์ใด ๆ ของกรดอะมิโนนี้ obliterates chromophore ก่อทั้งหมด สารตกค้างที่นำสอง Y66 ซึ่งใน chromophore ก่อได้ อย่างไรก็ตาม การศึกษา mutagenesis แสดงว่า สารตกค้างใด ๆ หอมสามารถแทน Y66 (Heim et al., 1994), และจึงทำให้งงทำไมนี้กรดอะมิโนมีอยู่สูงดังนั้นในธรรมชาติ ตกนำกรดอะมิโน 2 ล่าสุดมี R96 และ E222 ซึ่งทั้งสองจะตกตัวเร่งปฏิกิริยาที่ต้องการพ่อแม่ และเอนใกล้ chromophore ตกค้างหลายใกล้ chromophore, G20, G33, Gl91 และ F130 ยังได้อยู่ระหว่างเฟรมต่อวินาที และยังมีคิดจะเกี่ยวข้องกับการก่อตัวของ chromophore เป็นของตกค้างอื่น ๆ ไม่มีอยู่ FPs สามารถรองรับระดับสูงของการปรับเปลี่ยนเพื่อสร้างโปรตีนที่ มีคุณสมบัติทางกายภาพแตกต่างกัน (วันและ Davidson, 2009 Shaner et al., 2007)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

คุณสมบัติทั่วไปของโปรตีนเรือง แสง

โดยไม่คำนึงถึงระดับหรือสายพันธุ์การเริ่มต้นของการจัดการทางพันธุกรรมที่ FPS ทั้งหมดมี~ 25 , kd ในขนาดใหญ่ซึ่งมีขนาดใหญ่เมื่อเทียบกับประกอบรัฐธรรมนูญว่าด้วย fluorophores (เช่นรักษาตัวหินหรือ Texas สีแดง)มีขนาดโดยเฉลี่ยประมาณ 1 kd. แม้ว่าจะมีขนาดค่อนข้างใหญ่ของพวกเขา fps ,เป็นประโยชน์ต่อสำหรับแอพพลิเคชันจำนวนมากเพื่อการถ่าย ภาพ ในแบบสดเซลล์และทั้งสัตว์fps ,มีฉลากทางพันธุกรรมและดังนั้นจึงสามารถ'สร้างขึ้นใน'การใช้แนวทางเรื่อง เป็นป้ายจะถูกสร้างขึ้น ภายใน เซลล์ที่ไม่มีความจำเป็นสำหรับการติดฉลากพร้อมด้วยตัวแทน exogenous หรือขั้นตอน permeabilization และที่ยึดที่จำเป็นสำหรับ immunofluorescence FPS สามารถผสมผสานเข้าไปยังเป้าหมายโปรตีนของพวกเขาเพื่อว่าพวกเขาได้ถูกแสดงออกมาใน 1 : 1 อัตราที่มีโมเลกุลเป้าหมายที่ความจริงหรือที่ว่ายังแน่นอนว่าเหมาะสำหรับปริมาณการถ่าย ภาพ (แพตเตอร์สัน et al . 1997 )

ที่มีความสำคัญที่สุดจุดหนึ่งเกี่ยวกับ FPS คือโครงสร้างโปรตีนทั้งหมดที่มีความสำคัญต่อการบำรุงรักษาและการพัฒนาของคุณสมบัติฟลูเรซ - เซ็นซ( Remington 2006 ) โครงสร้าง FP ที่ประกอบไปด้วยของแข็งเป็นอย่างมากเฉพาะ - บาร์เรลพับประกอบด้วย 11 เฉพาะแผ่นที่ระบบเสียงรอบทิศทางกลางกล้อง - Helix ( ormo et al . 1996 )ในแนวปะการังและแมงกะพรุนทั้งหมด FPS ศึกษาว่า chromophore หลักการที่จะได้รับจากเฉพาะที่เป็นกรดอะมิโนสำคัญเพียงไม่กี่ที่ตั้งอยู่ใกล้กับศูนย์กลางของเฉพาะแกนม้วนผม(ดูที่"ลักษณะของความโดดเด่นเฉพาะ - บาร์เรลในโปสเตอร์) แต่ถึงอย่างไรก็ตามไม่เหมือนกับเป็นกรดอะมิโนของโปรตีนละลายน้ำได้จำนวนมากของกรดอะมิโนชนิด ภายใน ห้องโดยสารใน FPS ,ได้รับการชาร์จหรือแผน ภาพ รูปแบบทิศทางสัญญาณเสียงมัดโมเลกุลของน้ำจำนวนมากและกุญแจล็อคเข้ากับ conformations แข็ง ภายใน โปรตีน ในบริบทของ สภาพแวดล้อม เฉพาะนี้ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นระหว่าง FP ปุ่มเป็นกรดอะมิโนในรูปแบบที่เรียกเข้า imidazole ผัน(คำกริยา)พร้อมด้วย Extended ( tsien 1998 ) คุณสมบัติฟลูเรซ - เซ็นซของโปรตีนเหล่านี้เป็นที่แนะนำอย่างสูงขึ้นอยู่กับ สภาพแวดล้อม ทางเคมีที่โดดเด่นโดยรอบ chromophore ได้ตามหลักฐานข้อเท็จจริงที่ว่า analogs chromophore ใยสังเคราะห์เป็นโชคของคุณสมบัติฟลูเรซ - เซ็นซ( follenius-wund et al . 2003 ) การเปลี่ยนแปลง สภาพแวดล้อม chromophore ท้องถิ่นที่ยังสร้างความแตกต่างของความยาวคลื่นที่งดงามในลักษณะของการต่อต้านกรด photostability และความหลากหลายของคุณสมบัติทาง กายภาพ อื่น.

กลไกของการจัดตั้งการจัดตั้ง chromophore นั้นคิดว่าเป็นความเหมือนสำหรับ FP ทุกครั้งโดยไม่คำนึงถึงแหล่งสัญญาณ( Remington 2006 ) การตรวจสอบลำดับกรดอะมิโนที่มีมากกว่า 100 รุ่นยาว chromophore อย่างเป็นธรรมชาติเกิดจากสายพันธุ์ต่างๆจำนวนมากพบว่ามีเพียงสี่สารตกค้างมีพื้นที่อย่างแท้จริง( Remington 2006 ) เป็นครั้งแรกที่มีคราบ G 67 ซึ่งเป็นสิ่งสำคัญมากสำหรับ cyclization ของ chromophore ที่ผ่านการโจมตี nucleophilic ดังนั้นจึงมีผลทำให้ผลคือมันมีกรดอะมิโนมันจนหมดสิ้นไปอย่างสมบรูณ์แบบนี้การจัดตั้ง chromophore ทิ้งคราบไว้รักษาไว้ซึ่งที่สองคือ Y 66 ซึ่งมีส่วนร่วมในการจัดตั้ง chromophore ยัง แต่ถึงอย่างไรก็ตามการศึกษาผลผลิตแสดงให้เห็นว่าเหลือกลิ่นหอมที่สามารถเปลี่ยน Y 66 (จำพวก et al . 1994 )และเป็นปัญหาดังนั้นทำไมกรดอะมิโนแห่งนี้คือพื้นที่ในธรรมชาติดังนั้นจึงเป็นอย่างสูงสองตกค้างอยู่ให้หมดไปกรดอะมิโนรักษาไว้ซึ่งที่ผ่านมาจะมี R 96 และ E 222 ซึ่งทั้งสองมีสารตกค้างมีเครื่องฟอกไอเสียที่อยู่ในตำแหน่งใกล้กับกระบวนการ chromophore และเป็นสิ่งจำเป็นอย่างยิ่งในการฝึกตนให้ได้ สารตกค้างอื่นๆที่หลากหลายอยู่ใกล้กับ chromophore เช่น G 20 G 33 GL 91 และ F 130 โมดูลมีพื้นที่ใน FPS และความคิดในการมีส่วนร่วมในการสร้าง chromophore ยัง เป็นสิ่งตกค้างอื่นๆให้มากที่สุดไม่ได้สงวนไว้fps ,สามารถรองรับผู้ใช้บริการระดับสูงที่มีการปรับเปลี่ยนในการสร้างโปรตีนมีคุณสมบัติทาง กายภาพ แตกต่างกัน(วันและเดวิดสัน 2009 shaner et al . 2007 )