environmental samples (Roesch et al. 2007; Shi et al. 2009).
NGS techniques have recently been applied for diversity evaluation
and phylogenetic studies in protists and microalgae,
such as diatoms, dinoflagellates, and haptophytes (Amaral-
Zettler et al. 2009; Burki et al. 2010; Shalchian-Tabrizi et al.
2011).
With the rapid progress in NGS technologies in recent
years, various NGS platforms are now available, such as 454
pyrosequencing, HiSeq2000, GAIIx, and SOLiD, PacBio RS
(see Table 4); however, their application to environmental
diversity studies is restricted by sequence length per individual
read. Sequence length of each read is usually less than
150 bp, though NGS tools generate a huge amount of sequence
data with billions of sequencing reactions in a single
run. However, the 454 pyrosequencing easily produces reads
of 500 bp, and recently this technology has been upgraded as
the GS FLX+ system, which enhances the read length up to
1,000 bp in optimum conditions with new reagents (http://
www.my454.com/products/gs-flx-system/index.asp). In
metagenomic diversity studies, individual sequences without
assembly of sequence reads are subjected to phylogenetic
analysis by comparison with well-defined DNA sequences
as taxonomic markers or signatures. NGS-based metagenomics
mostly targets the 18S rRNA molecules, as DNA taxonomic
markers (e.g., Amaral-Zettler et al. 2009; Bråte et al.
2010), because of highly conserved sequences within a species,
but generally different between species (Ki 2011), and
comparably large dataset available in GenBank. Because of
the relatively long reads (up to 1,000 bp) in 454 pyrosequencing,
the Genome Sequencer FLX System is usually employed
in metagenomic diversity studies using PCR amplicons
(Amaral-Zettler et al. 2009; Medinger et al. 2010; Burki et al.
2010; Edgcomb et al. 2011; Mccliment et al. 2011; Shalchian-
Tabrizi et al. 2011; Tai et al. 2011). The NGS system therefore
enables a more comprehensive view into the diversity of
various environmental habitats. Techniques, such as 454 pyrosequencing,
Illumina, and SOLiD, are largely used to identify
and detect malfunctioning cells and microbiota of the human
body (Petrosino et al. 2009; Roesch et al. 2009). There is great
potential for their use in diversity studies on microbes, such as
bacteria, archaea, and microeukaryotes, including microalgae.
In addition, these techniques can be used to count environmental
gene tags, or PCR amplicons, to analyze the relative abundance
of microalgal species under varying environmental
conditions, although the NGS-based quantification is not completely
proven at this stage, because of some possible biases
(e.g., PCR-amplification bias, NGS reads, etc.).
Conclusions and Remarks
Microalgae are major components of the aquatic ecosystem, and
their diversity is strongly modified by rapid and accelerating
environmental changes (Elmqvist et al. 2003). They are
unicellular eukaryotes [excluding blue-green algae (cyanobacteria)]
with distinct features, such as morphology, pigments,
and photosynthetic activity, and can be extremely small in size
(e.g., nano- and pico-size plankton). Hence, it is necessary for
the correct identification, continuousmonitoring, and enumeration
of these microorganisms. Beyond the traditional microscopic
methods, many molecular techniques have been
developed as alternative methods to discriminate microalgal
species. Even molecular methods developed by other molecular
biologists can be used for microalgal studies because the
target biomolecules (DNA, RNA, and protein) are universal.
Each molecular technique has its own particular strengths in
detecting microalgae but may have limitations when applied
to other species. For example, single-cell PCR is considered a
good molecular tool for studying uncultured microalgal cells
from environments but is difficult to apply to pico-size cells;
but by involving flow cytometry, this can also be made possible.
To date, there are several reviews of molecular methods
that consider different aspects, applications, and organisms.
This paper highlights the practical molecular tools available
for species detection, quantification, and diversity analysis of
microalgae.
Despite rapid advances and many examples highlighting
the application of molecular methods to a broad spectrum of
applications, there are very few methodologies for quantification
and diversity studies in microalgae. Molecular technologies
ranging from automated Sanger sequencing to
NGS technologies have opened doors for the easy and rapid
detection and quantification of cells. Among the currently
available methods, qPCR offers the most cost-effective,
sensitive, and rapid analysis for the detection and quantification
of microalgae in both laboratory and field situations.
Isothermal DNA amplification techniques, such as LAMP
and NASBA, are relatively new methods, which, because of
their simplicity, ruggedness, and low cost, could provide
major advantages. These methods therefore have the potential
to be used as large-scale, simple screening assays for the
detection and diversity estimation of microalgae. In addition,
NGS techniques have been applied to various genomic
research studies and have significant potential for future use
in both discrimination and quantification of microalgae
worldwide. At present, the operational cost and data analysis
tools associated with NGS technology support the widerange
use in molecular monitoring and quantification of
environmental microalgae. In the case of 454 pyrosequencing,
costs can be greatly reduced by employing Multiplex
Identifier-containing adaptors, which allow users to have
greater multiplexing capabilities with the GS FLX Titanium
sequencing chemistry. Moreover, the coming third- and
fourth-generation technologies that are using techniques like
single molecule sequencing (Pacific Biosciences Inc.) and
single molecule electrical detection (Genia Technologies
ตัวอย่างจากสิ่งแวดล้อม (Roesch et al, 2007;.. ชิ et al, 2009).
เทคนิค NGS ได้รับเมื่อเร็ว ๆ นี้นำมาใช้สำหรับการประเมินความหลากหลาย
และการศึกษาในสายวิวัฒนาการ protists และสาหร่าย
เช่นไดอะตอม dinoflagellates และ haptophytes (Amaral-
Zettler et al, 2009. . Burki et al, 2010;. Shalchian-Tabrizi, et al
. 2011)
ด้วยความก้าวหน้าอย่างรวดเร็วในเทคโนโลยี NGS ในที่ผ่านมา
ปีที่ผ่านแพลตฟอร์มต่างๆ NGS ที่มีอยู่ในขณะนี้เช่น 454
pyrosequencing, HiSeq2000, GAIIx และของแข็ง PacBio RS
(ดูตารางที่ 4) แต่โปรแกรมของพวกเขาเพื่อสิ่งแวดล้อม
การศึกษาความหลากหลายถูก จำกัด โดยความยาวลำดับต่อบุคคล
อ่าน ระยะเวลาในการอ่านลำดับของแต่ละคนจะมีค่าน้อยกว่า
150 bp แม้ว่าเครื่องมือ NGS สร้างเป็นจำนวนมากของลำดับ
ข้อมูลกับพันล้านของปฏิกิริยาในลำดับเดียว
วิ่ง อย่างไรก็ตาม 454 pyrosequencing ผลิตได้อย่างง่ายดายอ่าน
500 bp และเมื่อเร็ว ๆ นี้เทคโนโลยีนี้ได้รับการอัพเกรดเป็น
ระบบ GS FLX + ซึ่งจะช่วยเพิ่มระยะเวลาในการอ่านได้ถึง
1,000 bp ในสภาวะที่เหมาะสมกับน้ำยาใหม่ (http: //
www.my454.com /products/gs-flx-system/index.asp) ใน
การศึกษาความหลากหลาย Metagenomic ลำดับของแต่ละบุคคลโดยไม่มี
การชุมนุมของคนอ่านลำดับที่อาจจะสายวิวัฒนาการ
การวิเคราะห์โดยการเปรียบเทียบกับทั้งกำหนดลำดับดีเอ็นเอ
เป็นเครื่องหมายการจัดหมวดหมู่หรือลายเซ็น NGS ตาม metagenomics
ส่วนใหญ่เป้าหมาย 18S rRNA โมเลกุลเป็นอนุกรมวิธานดีเอ็นเอ
เครื่องหมาย (เช่นร็-Zettler, et al. 2009;. brate et al,
2010) เนื่องจากการอนุรักษ์ลำดับสูงในสายพันธุ์,
แต่โดยทั่วไปที่แตกต่างกันระหว่างสายพันธุ์ (Ki 2011 ) และ
ชุดข้อมูลขนาดใหญ่ปานที่มีอยู่ใน GenBank เพราะการ
อ่านค่อนข้างยาว (ได้ถึง 1,000 bp) ใน 454 pyrosequencing,
ซีเควนจีโนมของระบบ FLX เป็นลูกจ้างมักจะ
ในการศึกษาความหลากหลาย Metagenomic ใช้ amplicons PCR
(ร็-Zettler, et al. 2009; Medinger et al, 2010;. Burki และคณะ
2010; Edgcomb et al, 2011;. Mccliment et al, 2011;. Shalchian-
. Tabrizi et al, 2011;. ไท et al, 2011) ระบบ NGS จึง
ช่วยให้มุมมองที่ครอบคลุมมากยิ่งขึ้นในความหลากหลายของ
แหล่งที่อยู่อาศัยสิ่งแวดล้อมต่างๆ เทคนิคเช่น 454 pyrosequencing,
Illumina และของแข็งส่วนใหญ่จะใช้ในการระบุ
และการตรวจหาเซลล์ผิดปกติและ microbiota ของมนุษย์
ร่างกาย (Petrosino, et al. 2009; Roesch et al, 2009.) มีดี
ที่มีศักยภาพสำหรับการใช้งานของพวกเขาในการศึกษาความหลากหลายในจุลินทรีย์เช่น
แบคทีเรียเคีและ microeukaryotes รวมทั้งสาหร่าย.
นอกจากนี้เทคนิคเหล่านี้สามารถนำมาใช้ในการนับสิ่งแวดล้อม
แท็กยีนหรือ amplicons PCR ในการวิเคราะห์ความชุกชุม
ของสาหร่าย สายพันธุ์ที่แตกต่างกันภายใต้สิ่งแวดล้อม
เงื่อนไขแม้ว่าปริมาณ NGS ที่ใช้ไม่ได้อย่างสมบูรณ์
การพิสูจน์แล้วในขั้นตอนนี้เพราะของบางอคติที่เป็นไปได้
(เช่นอคติ PCR-ขยาย NGS อ่าน ฯลฯ ).
สรุปและข้อสังเกต
สาหร่ายเป็นส่วนประกอบที่สำคัญของสัตว์น้ำ ระบบนิเวศและ
ความหลากหลายของพวกเขามีการปรับเปลี่ยนอย่างมากโดยอย่างรวดเร็วและเร่ง
การเปลี่ยนแปลงสิ่งแวดล้อม (ผศ et al. 2003) พวกเขาเป็น
ยูคาริโอมีหน่วยเดียว [ไม่รวมสาหร่ายสีน้ำเงินแกมเขียว (ไซยาโนแบคทีเรีย)]
ที่มีคุณสมบัติที่แตกต่างกันเช่นลักษณะทางสัณฐานวิทยา, สี,
และกิจกรรมการสังเคราะห์แสงและจะมีขนาดเล็กมากในขนาด
(เช่นนาโนและแพลงก์ตอนขนาดพิโค) ดังนั้นจึงเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับ
ประชาชนที่ถูกต้อง continuousmonitoring และการแจงนับ
จุลินทรีย์เหล่านี้ นอกเหนือจากกล้องจุลทรรศน์แบบดั้งเดิม
วิธีการเทคนิคโมเลกุลจำนวนมากได้รับ
การพัฒนาเป็นวิธีการทางเลือกในการแยกแยะสาหร่าย
สายพันธุ์ วิธีโมเลกุลได้รับการพัฒนาโดยโมเลกุลอื่น ๆ
นักชีววิทยาสามารถนำมาใช้สำหรับการศึกษาสาหร่ายเพราะ
สารชีวโมเลกุลเป้าหมาย (ดีเอ็นเออาร์เอ็นเอและโปรตีน) เป็นสากล.
แต่ละเทคนิคโมเลกุลมีจุดแข็งของตัวเองโดยเฉพาะอย่างยิ่งใน
การตรวจสอบสาหร่าย แต่อาจมีข้อ จำกัด เมื่อนำมาใช้
กับสายพันธุ์อื่น ๆ ตัวอย่างเช่น PCR เซลล์เดียวถือเป็น
เครื่องมือที่มีโมเลกุลที่ดีสำหรับการศึกษาเซลล์สาหร่ายไม่มีมารยาท
จากสภาพแวดล้อม แต่เป็นเรื่องยากที่จะนำไปใช้กับ pico ขนาดเซลล์;
แต่ที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันไหลนี้ยังสามารถที่จะทำได้.
ในวันที่มีหลาย ความคิดเห็นของวิธีการโมเลกุล
ที่พิจารณาแง่มุมที่แตกต่างกัน, การใช้งานและชีวิต.
กระดาษนี้เน้นเครื่องมือโมเลกุลในทางปฏิบัติที่มีอยู่
สำหรับการตรวจสอบชนิดปริมาณและการวิเคราะห์ความหลากหลายของ
สาหร่าย.
แม้จะมีความก้าวหน้าอย่างรวดเร็วและมีตัวอย่างมากมายที่เน้น
การประยุกต์ใช้วิธีโมเลกุลที่ออกฤทธิ์กว้าง ของ
การใช้งานที่มีวิธีการที่น้อยมากสำหรับปริมาณ
และการศึกษาความหลากหลายในสาหร่าย เทคโนโลยีโมเลกุล
ตั้งแต่ลำดับแซงเจอร์อัตโนมัติเพื่อ
เทคโนโลยี NGS ได้เปิดประตูสำหรับง่ายและรวดเร็ว
การตรวจสอบและการหาปริมาณของเซลล์ ในปัจจุบัน
วิธีการที่ใช้ได้, qPCR มีค่าใช้จ่ายที่มีประสิทธิภาพมากที่สุด
ที่สำคัญและการวิเคราะห์อย่างรวดเร็วสำหรับการตรวจสอบและการหาปริมาณ
ของสาหร่ายทั้งในสถานการณ์ในห้องปฏิบัติการและภาคสนาม.
Isothermal เทคนิคดีเอ็นเอเช่นโคมไฟ
และ NASBA เป็นวิธีการที่ค่อนข้างใหม่ซึ่ง เพราะ
ความเรียบง่าย, ความรุนแรงของพวกเขาและต้นทุนต่ำสามารถให้
ข้อได้เปรียบที่สำคัญ วิธีการเหล่านี้จึงมีศักยภาพ
ที่จะนำมาใช้เป็นขนาดใหญ่, การตรวจคัดกรองอย่างง่ายสำหรับ
การประเมินการตรวจสอบและความหลากหลายของสาหร่าย นอกจากนี้
เทคนิค NGS ได้รับนำไปใช้กับจีโนมต่าง ๆ
การศึกษาวิจัยและมีศักยภาพที่สำคัญสำหรับการใช้งานในอนาคต
ทั้งในการเลือกปฏิบัติและการหาปริมาณของสาหร่าย
ทั่วโลก ปัจจุบันต้นทุนการดำเนินงานและการวิเคราะห์ข้อมูล
ที่เกี่ยวข้องกับเครื่องมือเทคโนโลยี NGS สนับสนุน WideRange
ใช้ในการตรวจสอบโมเลกุลและปริมาณของ
สิ่งแวดล้อมสาหร่าย ในกรณีที่ 454 pyrosequencing,
ค่าใช้จ่ายจะลดลงอย่างมากโดยการ Multiplex
อะแดปเตอร์ที่มีตัวบ่งชี้ซึ่งจะช่วยให้ผู้ใช้ที่มี
ความสามารถมากขึ้นด้วยมัลติ GS FLX ไทเทเนียม
เคมีลำดับ นอกจากนี้มาสามและ
เทคโนโลยีรุ่นที่สี่ที่มีการใช้เทคนิคเช่น
การเรียงลำดับโมเลกุลเดี่ยว (แปซิฟิกชีววิทยาศาสตร์ Inc. ) และ
การตรวจสอบเดียวโมเลกุลไฟฟ้า (Genia เทคโนโลยี
การแปล กรุณารอสักครู่..
