Aerosol Challenge with M. bovisTwo

Aerosol Challenge with M. bovis
Two strains ofM. boviswere used for challenge: 95-1315 (Schmittet al., 1997) and 10-7428 (Francisco
et al., 2014). Low passage (#3) cultures of both strains
were prepared using standard techniques (Larsen
et al., 2007) in Middlebrook 7H9 liquid media (Becton
Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA) supplemented with 10% oleic acidealbuminedextrose
complex (OADC) plus 0.05% Tween 80. These two
strains have been shown to be of equal virulence
and induce lesions of similar severity (Waterset al.,
2014). As such, for analysis all calves were considered
as a single group ofM. bovisinfected animals. Holstein
calves (6-month-old neutered males) were obtained
from a tuberculosis free herd and housed in a biosafety
level (BSL)-3 facility at the National Animal Disease
Center, Ames, Iowa, according to Institutional
Biosafety and Animal Care and Use Committee
guidelines. Three months after acquisition of the
calves,M. bovischallenge inoculum was delivered by
nebulization into a mask (Equine AeroMask


; Trudell Medical International, London, Ontario, Canada) covering the nostrils and mouth. Calves
received either 10
4
colony forming units (cfu) ofM. bovis95-1315 (n¼8) or 10
4
cfuM. bovis10-7428 (n¼8)
by aerosol as described (Palmeret al., 2002). The inoculum was inhaled through a one-way valve into the
mask and directly into the lungs via the nostrils.
The process continued until the inoculum, a 1 ml
phosphate buffered saline (PBS) wash of the inoculum
tube and an additional 2 ml of PBS were delivered, a
process taking approximately 10 min. Strict biosafety
protocols were followed to protect personnel from
exposure to M. bovisthroughout the study. The
BSL-3 animal housing had negative air pressure as
compared with the outside. Airflow within the animal
rooms was such that air was extracted from individual
rooms, preventing air exchange between rooms.
Airflow was adjusted to produce 11.4 air changes
per hour.
Mycobacterial Isolation and Staging of Lesions
All calves were killed 150 days after challenge by
intravenous administration of sodium pentobarbital.
Tissues were examined for gross lesions and processed
for microscopical analysis and isolation ofM. bovisby
bacteriological culture. The findings for all tissues
examined are reported in detail elsewhere (Waters
et al., 2014). The in-situ cytokine and chemokine
gene expression reported herein was limited to samples from the lung. Samples of lung containing representative gross lesions were collected for
microscopical evaluation, ISH using the
RNAScope


system (Advanced Cell Diagnostics
Inc., Hayward, California, USA) and morphometric
analyses. Samples were fixed in 10% neutral buffered
formalin, processed routinely and embedded in
paraffin wax. Sections (5mm) were stained with haematoxylin and eosin (HE). Adjacent sections from
samples containing caseonecrotic granulomas suggestive of tuberculosis were stained by the
ZiehleNeelsen technique for visualization of acidfast bacteria (AFB). Adjacent unstained sections
were also prepared for ISH.
One to three slides with tuberculoid granulomas
were analyzed from each animal. For each slide, all
granulomas were staged (IeIV) according to criteria
adapted from those described previously (Rhoades
et al., 1997; Wangoo et al., 2005; Palmer et al.,
2007). For each cytokine or chemokine investigated
a minimum of 35 granulomas were analyzed. For
negative controls 120 (15 for each cytokine or
chemokine) regions (12  10
6
mm
2
each) of
microscopically normal, non-lesional lung were
analyzed. Stage I (initial) granulomas were characterized by accumulations of epithelioid macrophages
admixed with low numbers of lymphocytes and neutrophils. Multinucleated giant cells were sometimes
present, but necrosis was absent. When present,
AFB were seen within macrophages or multinucleated giant cells. Stage II (solid) granulomas were
characterized by accumulations of epithelioid macrophages surrounded by a thin, incomplete connective
tissue capsule. Infiltrates of neutrophils, lymphocytes
and multinucleated giant cells were sometimes present. Necrosis was centrally located and minimal to
mild. When present, AFB were seen within macrophages or multinucleated giant cells. Stage III
(necrotic) granulomas were characterized by necrotic
cores, some with small foci of dystrophic mineralization, surrounded by a zone of epithelioid macrophages admixed with multinucleated giant cells and
lymphocytes. As distance from the necrotic core
increased, the relative number of lymphocytes also
increased and the number of epithelioid macrophages
and multinucleated giant cells decreased. The entire
granuloma was surrounded by a thin to moderate
fibrous capsule. When present, AFB were seen within
the necrotic core and, to a lesser extent, within macrophages or multinucleated giant cells. Stage IV
(necrotic and mineralized) granulomas were characterized by a variably thick fibrous capsule surrounding irregular multicentric granulomas with multiple
necrotic cores, often with foci of dystrophic mineralization. Epithelioid macrophages and multinucleated
giant cells surrounded necrotic areas; these cellular
infiltrates were bordered by a zone of large numbers
152 M.V. Palmeret al.
of lymphocytes. AFB were most often present within
the necrotic core.
RNA Chromogenic In-situ Hybridization
Visualization of RNA transcripts for TNF-a, transforming growth factor (TGF)-b, IFN-g, IL-17A,
IL-16, IL-10, CXCL9 and CXCL10 was done according to the manufacturer’s instructions for
RNAScope


2.0 (Wanget al., 2012; Tubbs et al.,
2013). A proprietary probe combination was used
for each of the cytokine and chemokine mRNAs.
Briefly, sections (5mm) were heated for 60 min at
60

C in a HybEZhybridization oven (Advanced
Cell Diagnostics). Tissues were dewaxed in xylene
followed by dehydration in an ethanol series and air
dried for 5 min. Tissue sections were incubated with
pretreatment 1 solution (endogenous peroxidase
block) for 10 min at room temperature (RT). Slides
were rinsed by immersion in double distilled water
(ddH2O), followed by immersion in pretreatment 2
solution (antigen retrieval citrate buffer) for
15 min at 100e104

C (boiling). Slides were washed
in ddH2
O and pretreatment 3 (protease) was
applied for 30 min at 40

C. Slides were washed in
ddH2O and target or control probes were applied
with incubation at 40

C for 2 h followed by rinsing
in wash buffer (Advanced Cell Diagnostics) for
2 min at RT. Signal amplification reagents 1 to 6
were applied sequentially for 30 min, 15 min,
30 min, 15 min, 30 min and 15 min, respectively.
Slides were rinsed in wash buffer for 2 min between
amplification reagents. Incubations with amplifier
reagents 1 to 4 were at 40

C, while incubations with
amplifier reagents 5 and 6 were at RT. Positive
signal was visualized using Fast Reddye with
Gill’s haematoxylin counterstain. After drying for
15 min at 60

C, slides were coverslipped using
mounting media (EcoMount, Biocare Medical,
Concord, California, USA). The positive control
probe consisted of proprietary probe forBos taurus
cyclophilin B (PPIB), while the negative control
probe targeteddapBofBacillus subtilis.
Morphometry
Slides were scanned at40 magnification using the
Aperio ScanScope XT workstation (Aperio Technology Inc., Vista, California, USA). Images were digitized with ImageScope software (Aperio) and
analyzed using a modification of a standard colour
deconvolution analysis algorithm (Aperio). Microscopical granulomas were identified as belonging to
one of the four stages (IeIV). Each granuloma was
selected as a region of interest using a freehand pen
tool (Fig. 1). Using the ImageScope colour deconvolution analysis algorithm, the chromogenic reaction
of Fast Redwas identified, quantified and the
percent area of Fast Redlabelling permm
2
of granuloma was calculated. Labelling controls (i.e. slides
with Fast Redstaining only or Gill’s haematoxylin
staining only) were used in the colour deconvolution
algorithm to maximize identification of Fast Red
labelling and minimize inclusion of background haematoxylin counterstaining.
Statistical Analysis
Data were normalized using a log10transformation.
Mean values of percent positive labelling for each
granuloma stage were compared using one-way analysis of variance (GraphPad Prism 6.0, GraphPad
Software, San Diego, California, USA). Differences
between means were then compared using Tukey’s
multiple comparison tests.P

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Aerosol Challenge with M. bovisTwo strains ofM. boviswere used for challenge: 95-1315 (Schmittet al., 1997) and 10-7428 (Franciscoet al., 2014). Low passage (#3) cultures of both strainswere prepared using standard techniques (Larsenet al., 2007) in Middlebrook 7H9 liquid media (BectonDickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA) supplemented with 10% oleic acidealbuminedextrosecomplex (OADC) plus 0.05% Tween 80. These twostrains have been shown to be of equal virulenceand induce lesions of similar severity (Waterset al.,2014). As such, for analysis all calves were consideredas a single group ofM. bovisinfected animals. Holsteincalves (6-month-old neutered males) were obtainedfrom a tuberculosis free herd and housed in a biosafetylevel (BSL)-3 facility at the National Animal DiseaseCenter, Ames, Iowa, according to InstitutionalBiosafety and Animal Care and Use Committeeguidelines. Three months after acquisition of thecalves,M. bovischallenge inoculum was delivered bynebulization into a mask (Equine AeroMask
; Trudell Medical International, London, Ontario, Canada) covering the nostrils and mouth. Calvesreceived either 104colony forming units (cfu) ofM. bovis95-1315 (n¼8) or 104cfuM. bovis10-7428 (n¼8)by aerosol as described (Palmeret al., 2002). The inoculum was inhaled through a one-way valve into themask and directly into the lungs via the nostrils.The process continued until the inoculum, a 1 mlphosphate buffered saline (PBS) wash of the inoculumtube and an additional 2 ml of PBS were delivered, aprocess taking approximately 10 min. Strict biosafetyprotocols were followed to protect personnel fromexposure to M. bovisthroughout the study. TheBSL-3 animal housing had negative air pressure ascompared with the outside. Airflow within the animalrooms was such that air was extracted from individualrooms, preventing air exchange between rooms.Airflow was adjusted to produce 11.4 air changesper hour.Mycobacterial Isolation and Staging of LesionsAll calves were killed 150 days after challenge byintravenous administration of sodium pentobarbital.Tissues were examined for gross lesions and processedfor microscopical analysis and isolation ofM. bovisbybacteriological culture. The findings for all tissuesexamined are reported in detail elsewhere (Waterset al., 2014). The in-situ cytokine and chemokinegene expression reported herein was limited to samples from the lung. Samples of lung containing representative gross lesions were collected formicroscopical evaluation, ISH using theRNAScope
system (Advanced Cell DiagnosticsInc., Hayward, California, USA) and morphometricanalyses. Samples were fixed in 10% neutral bufferedformalin, processed routinely and embedded inparaffin wax. Sections (5mm) were stained with haematoxylin and eosin (HE). Adjacent sections fromsamples containing caseonecrotic granulomas suggestive of tuberculosis were stained by theZiehleNeelsen technique for visualization of acidfast bacteria (AFB). Adjacent unstained sectionswere also prepared for ISH.One to three slides with tuberculoid granulomaswere analyzed from each animal. For each slide, allgranulomas were staged (IeIV) according to criteriaadapted from those described previously (Rhoadeset al., 1997; Wangoo et al., 2005; Palmer et al.,2007). For each cytokine or chemokine investigateda minimum of 35 granulomas were analyzed. Fornegative controls 120 (15 for each cytokine orchemokine) regions (12  106mm2each) ofmicroscopically normal, non-lesional lung wereanalyzed. Stage I (initial) granulomas were characterized by accumulations of epithelioid macrophagesadmixed with low numbers of lymphocytes and neutrophils. Multinucleated giant cells were sometimespresent, but necrosis was absent. When present,AFB were seen within macrophages or multinucleated giant cells. Stage II (solid) granulomas werecharacterized by accumulations of epithelioid macrophages surrounded by a thin, incomplete connectivetissue capsule. Infiltrates of neutrophils, lymphocytesand multinucleated giant cells were sometimes present. Necrosis was centrally located and minimal tomild. When present, AFB were seen within macrophages or multinucleated giant cells. Stage III(necrotic) granulomas were characterized by necroticcores, some with small foci of dystrophic mineralization, surrounded by a zone of epithelioid macrophages admixed with multinucleated giant cells andlymphocytes. As distance from the necrotic coreincreased, the relative number of lymphocytes alsoincreased and the number of epithelioid macrophagesand multinucleated giant cells decreased. The entiregranuloma was surrounded by a thin to moderatefibrous capsule. When present, AFB were seen withinthe necrotic core and, to a lesser extent, within macrophages or multinucleated giant cells. Stage IV(necrotic and mineralized) granulomas were characterized by a variably thick fibrous capsule surrounding irregular multicentric granulomas with multiplenecrotic cores, often with foci of dystrophic mineralization. Epithelioid macrophages and multinucleatedgiant cells surrounded necrotic areas; these cellularinfiltrates were bordered by a zone of large numbers152 M.V. Palmeret al.of lymphocytes. AFB were most often present withinthe necrotic core.RNA Chromogenic In-situ HybridizationVisualization of RNA transcripts for TNF-a, transforming growth factor (TGF)-b, IFN-g, IL-17A,IL-16, IL-10, CXCL9 and CXCL10 was done according to the manufacturer’s instructions forRNAScope
2.0 (Wanget al., 2012; Tubbs et al.,2013). A proprietary probe combination was usedfor each of the cytokine and chemokine mRNAs.Briefly, sections (5mm) were heated for 60 min at60C in a HybEZhybridization oven (AdvancedCell Diagnostics). Tissues were dewaxed in xylenefollowed by dehydration in an ethanol series and airdried for 5 min. Tissue sections were incubated withpretreatment 1 solution (endogenous peroxidaseblock) for 10 min at room temperature (RT). Slideswere rinsed by immersion in double distilled water(ddH2O), followed by immersion in pretreatment 2solution (antigen retrieval citrate buffer) for15 min at 100e104C (boiling). Slides were washedin ddH2O and pretreatment 3 (protease) wasapplied for 30 min at 40C. Slides were washed inddH2O and target or control probes were appliedwith incubation at 40C for 2 h followed by rinsingin wash buffer (Advanced Cell Diagnostics) for2 min at RT. Signal amplification reagents 1 to 6were applied sequentially for 30 min, 15 min,30 min, 15 min, 30 min and 15 min, respectively.Slides were rinsed in wash buffer for 2 min betweenamplification reagents. Incubations with amplifierreagents 1 to 4 were at 40C, while incubations withamplifier reagents 5 and 6 were at RT. Positivesignal was visualized using Fast Reddye withGill’s haematoxylin counterstain. After drying for15 min at 60C, slides were coverslipped usingmounting media (EcoMount, Biocare Medical,Concord, California, USA). The positive controlprobe consisted of proprietary probe forBos tauruscyclophilin B (PPIB), while the negative controlprobe targeteddapBofBacillus subtilis.MorphometrySlides were scanned at40 magnification using theAperio ScanScope XT workstation (Aperio Technology Inc., Vista, California, USA). Images were digitized with ImageScope software (Aperio) andanalyzed using a modification of a standard colour
deconvolution analysis algorithm (Aperio). Microscopical granulomas were identified as belonging to
one of the four stages (IeIV). Each granuloma was
selected as a region of interest using a freehand pen
tool (Fig. 1). Using the ImageScope colour deconvolution analysis algorithm, the chromogenic reaction
of Fast Redwas identified, quantified and the
percent area of Fast Redlabelling permm
2
of granuloma was calculated. Labelling controls (i.e. slides
with Fast Redstaining only or Gill’s haematoxylin
staining only) were used in the colour deconvolution
algorithm to maximize identification of Fast Red
labelling and minimize inclusion of background haematoxylin counterstaining.
Statistical Analysis
Data were normalized using a log10transformation.
Mean values of percent positive labelling for each
granuloma stage were compared using one-way analysis of variance (GraphPad Prism 6.0, GraphPad
Software, San Diego, California, USA). Differences
between means were then compared using Tukey’s
multiple comparison tests.P<0.05 was considered
significant.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สเปรย์ที่มีความท้าทาย M. bovis
สองสายพันธุ์ OFM boviswere ใช้สำหรับความท้าทาย: 95-1315 (. Schmittet อัล, 1997) และ 10-7428
(ฟรานซิส. et al, 2014) ทางต่ำ (# 3)
วัฒนธรรมของทั้งสองสายพันธุ์ที่ถูกจัดทำขึ้นโดยใช้เทคนิคมาตรฐาน(เสน
et al., 2007) ใน Middlebrook 7H9 สื่อเหลว (Becton
ดิกคินสัน, แฟรงคลินทะเลสาบ, New Jersey, USA) เสริมด้วยโอเลอิก 10% acidealbuminedextrose
ซับซ้อน (OADC) บวก 0.05% Tween 80
ทั้งสองสายพันธุ์ที่ได้รับการแสดงที่จะมีความรุนแรงเท่าๆ
กันและทำให้เกิดแผลความรุนแรงที่คล้ายกัน(Waterset al.,
2014) เช่นสำหรับการวิเคราะห์น่องทั้งหมดได้รับการพิจารณาเป็นกลุ่มเดียว OFM
สัตว์ bovisinfected โฮลน่อง (6 เดือนอายุเพศ neutered) ที่ได้รับจากฝูงวัณโรคฟรีและตั้งอยู่ในความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ(BSL) -3 สิ่งอำนวยความสะดวกที่ National โรคสัตว์ศูนย์อาเมสไอโอวาตามสถาบันความปลอดภัยทางชีวภาพและการดูแลสัตว์และการใช้คณะกรรมการแนวทาง สามเดือนหลังจากเข้าซื้อกิจการของน่อง, M หัวเชื้อ bovischallenge ถูกส่งโดยพ่นยาเข้าไปในหน้ากาก(ม้า AeroMask?; Trudell แพทย์นานาชาติ, ลอนดอน, Ontario, แคนาดา) ครอบคลุมจมูกและปาก น่องที่ได้รับทั้ง 10 4 อาณานิคมสร้างหน่วย (cfu) OFM bovis95-1315 (n¼8) หรือ 10 4 cfuM bovis10-7428 (n¼8) โดยสเปรย์ตามที่อธิบายไว้ (Palmeret al., 2002) หัวเชื้อที่ได้รับการสูดดมผ่านวาล์วทางเดียวเข้าไปในหน้ากากและตรงเข้าไปในปอดผ่านจมูก. กระบวนการอย่างต่อเนื่องจนหัวเชื้อที่เป็นมล. 1 น้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (พีบีเอส) ล้างของเชื้อหลอดและเพิ่มอีก2 มิลลิลิตรพีบีเอส ถูกส่งเป็นกระบวนการที่ใช้เวลาเดินประมาณ10 นาที ความปลอดภัยทางชีวภาพที่เข้มงวดโปรโตคอลตามมาเพื่อปกป้องบุคลากรจากการสัมผัสกับเอ็มbovisthroughout การศึกษา BSL-3 ที่อยู่อาศัยของสัตว์มีความดันอากาศเชิงลบเมื่อเทียบกับด้านนอก ไหลเวียนของอากาศภายในสัตว์ห้องเป็นเช่นนั้นอากาศสกัดจากแต่ละห้องป้องกันการแลกเปลี่ยนอากาศระหว่างห้อง. ไหลเวียนของอากาศมีการปรับการผลิต 11.4 การเปลี่ยนแปลงของอากาศต่อชั่วโมง. วัณโรคการแยกและการแสดงละครของแผลน่องทั้งหมดถูกฆ่าตาย 150 วันหลังจากที่ท้าทายโดยการบริหารทางหลอดเลือดดำของPentobarbital โซเดียม. เนื้อเยื่อมีการตรวจสอบหารอยโรคขั้นต้นและการประมวลผลสำหรับการวิเคราะห์และการแยกจุล OFM bovisby วัฒนธรรมแบคทีเรีย ผลการวิจัยสำหรับเนื้อเยื่อตรวจสอบจะมีการรายงานในรายละเอียดอื่น ๆ (น้ำ et al., 2014) ไซโตไคน์และ chemokine ในแหล่งกำเนิดการแสดงออกของยีนรายงานในที่นี้ก็ถูกจำกัด ตัวอย่างจากปอด ตัวอย่างของปอดที่มีรอยโรคขั้นต้นเป็นตัวแทนที่ถูกเก็บรวบรวมสำหรับการประเมินผลจุล, ISH ใช้ RNAScope? ระบบ (ขั้นสูงการวินิจฉัยเซลล์อิงค์เฮย์เวิร์ด, California, USA) และเมตริกวิเคราะห์ ตัวอย่างการแก้ไขในบัฟเฟอร์เป็นกลาง 10% ฟอร์มาลินประมวลผลเป็นประจำและฝังตัวอยู่ในขี้ผึ้งพาราฟิน ส่วน (5mm) ถูกย้อมด้วยสี haematoxylin และ Eosin (HE) ส่วนที่ติดกันจากตัวอย่างที่มี granulomas caseonecrotic ชี้นำของวัณโรคมีการย้อมโดยใช้เทคนิคการสร้างภาพZiehleNeelsen สำหรับแบคทีเรีย acidfast (AFB) ส่วนที่ไม่มีรอยเปื้อนที่อยู่ติดกันนอกจากนี้ยังได้จัดเตรียมไว้สำหรับ ISH. หนึ่งถึงสามภาพนิ่งกับ granulomas tuberculoid วิเคราะห์จากสัตว์แต่ละ สำหรับแต่ละภาพนิ่งทั้งหมดgranulomas เป็นฉาก (IeIV) ตามเกณฑ์ที่ดัดแปลงมาจากผู้ที่อธิบายไว้ก่อนหน้า(โรท์ส, et al, 1997;.. Wangoo et al, 2005;. พาลเมอร์, et al, 2007) สำหรับแต่ละไซโตไคน์ chemokine หรือตรวจสอบขั้นต่ำ35 granulomas ถูกวิเคราะห์ สำหรับการควบคุมเชิงลบ 120 (15 สำหรับแต่ละไซโตไคน์หรือ chemokine) ภูมิภาค (12 10 6 มม2 ในแต่ละ) ของปกติกล้องจุลทรรศน์ไม่ใช่รอยโรคปอดถูกวิเคราะห์ เวทีผม (เริ่มต้น) granulomas โดดเด่นด้วยการสะสมของ epithelioid ใหญ่ผสมกับตัวเลขที่ต่ำของเซลล์เม็ดเลือดขาวและนิวโทรฟิ Multinucleated เซลล์ยักษ์บางครั้งปัจจุบันแต่เนื้อร้ายขาด เมื่อปัจจุบันAFB ได้เห็นภายในขนาดใหญ่หรือเซลล์ยักษ์ multinucleated ขั้นที่สอง (ของแข็ง) granulomas ถูกโดดเด่นด้วยการสะสมของepithelioid ขนาดใหญ่ล้อมรอบด้วยบางเกี่ยวพันไม่สมบูรณ์แคปซูลเนื้อเยื่อ แทรกตัวเข้าไปของนิวโทรฟิเซลล์เม็ดเลือดขาวและเซลล์ multinucleated ยักษ์อยู่ในปัจจุบันบางครั้ง เนื้อร้ายถูกตั้งอยู่ใจกลางเมืองและน้อยที่สุดที่จะอ่อน เมื่อปัจจุบัน AFB ได้เห็นภายในขนาดใหญ่หรือเซลล์ยักษ์ multinucleated ขั้นตอนที่สาม(เศษ) granulomas โดดเด่นด้วยเศษแกนบางคนที่มีขนาดเล็กfoci ของแร่ dystrophic ล้อมรอบด้วยโซนใหญ่ epithelioid ผสมกับเซลล์ยักษ์ multinucleated และเซลล์เม็ดเลือดขาว เป็นระยะทางจากแกนเศษเพิ่มขึ้นจำนวนญาติของเซลล์เม็ดเลือดขาวยังเพิ่มขึ้นและจำนวนขนาดใหญ่epithelioid และเซลล์ยักษ์ multinucleated ลดลง ทั้งgranuloma ถูกล้อมรอบด้วยบางถึงปานกลางแคปซูลเส้นใย เมื่อปัจจุบัน AFB ได้เห็นภายในแกนเศษและในระดับน้อยภายในขนาดใหญ่หรือเซลล์ยักษ์multinucleated IV เวที(เศษและแร่ธาตุ) granulomas โดดเด่นด้วยแคปซูลเป็นเส้นหนาแตกรอบ granulomas multicentric ผิดปกติมีหลายแกนตายมักจะมีfoci ของแร่ dystrophic ขนาดใหญ่และ epithelioid multinucleated เซลล์ยักษ์ล้อมรอบพื้นที่เศษ; โทรศัพท์มือถือเหล่านี้แทรกตัวเข้าไปถูกล้อมรอบด้วยโซนของตัวเลขขนาดใหญ่152 MV Palmeret al. ของเซลล์เม็ดเลือดขาว AFB ส่วนใหญ่มักจะนำเสนอภายในแกนเศษ. อาร์เอ็นเอให้สีในแหล่งกำเนิดพันธุ์การแสดงของอาร์เอ็นเอจิตบำบัดสำหรับ TNF-a, เปลี่ยนปัจจัยการเจริญเติบโต (ทีจี) -b, IFN-กรัม IL-17A, IL-16, IL-10, CXCL9 CXCL10 และได้ทำตามคำแนะนำของผู้ผลิตสำหรับRNAScope? 2.0 (Wanget อัล 2012;.. Tubbs, et al, 2013) การรวมกันเป็นกรรมสิทธิ์ของการสอบสวนที่ใช้สำหรับแต่ละไซโตไคน์และ chemokine mRNAs. สั้น ๆ ส่วน (5mm) ถูกความร้อนเป็นเวลา 60 นาทีที่60? C ในเตาอบ HybEZ พันธุ์? (ขั้นสูงการวินิจฉัยของเซลล์) เนื้อเยื่อถูก dewaxed ในไซลีนตามด้วยการคายน้ำในซีรีส์เอทานอลและอากาศแห้งเป็นเวลา5 นาที ส่วนเนื้อเยื่อถูกบ่มกับการปรับสภาพ 1 การแก้ปัญหา (peroxidase ภายนอกบล็อก) เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง (RT) ภาพนิ่งที่ถูกล้างโดยการแช่ในน้ำกลั่นคู่(ddH2O) ตามด้วยการแช่ในการปรับสภาพ 2 การแก้ปัญหา (บัฟเฟอร์ซิเตรตแอนติเจนดึง) สำหรับ15 นาทีที่ 100e104? C (เดือด) ภาพนิ่งถูกล้างใน ddH2 O และปรับสภาพ 3 (protease) ถูกนำมาใช้เป็นเวลา30 นาทีที่ 40? C. ภาพนิ่งถูกล้างในddH2O และเป้าหมายการควบคุมยานสำรวจหรือถูกนำไปใช้กับการบ่มที่40? C เป็นเวลา 2 ชั่วโมงตามด้วยการล้างในบัฟเฟอร์ล้าง(วินิจฉัยมือถือขั้นสูง) สำหรับ2 นาทีที่ RT น้ำยาขยายสัญญาณ 1-6 ถูกนำไปใช้ตามลำดับเป็นเวลา 30 นาที, 15 นาที, 30 นาที, 15 นาที, 30 นาทีและ 15 นาทีตามลำดับ. ภาพนิ่งถูกล้างในบัฟเฟอร์ล้างเป็นเวลา 2 นาทีระหว่างน้ำยาขยาย ฟักตัวของเชื้อที่มีเครื่องขยายเสียงน้ำยา 1-4 อยู่ที่ 40? C ในขณะที่ฟักตัวของเชื้อที่มีสารแอมป์5 และ 6 อยู่ที่ RT บวกสัญญาณภาพโดยใช้สีแดงได้อย่างรวดเร็ว? ย้อมกับกิลล์ของhaematoxylin counterstain หลังจากการอบแห้งสำหรับ15 นาทีที่ 60? C สไลด์ถูก coverslipped โดยใช้สื่อการติดตั้ง(EcoMount, Biocare แพทย์คองคอร์ด, California, USA) การควบคุมบวกสอบสวนประกอบด้วยหัววัดที่เป็นกรรมสิทธิ์ forBos taurus cyclophilin B (PPIB) ในขณะที่การควบคุมเชิงลบsubtilis targeteddapBofBacillus สอบสวน. morphometry ภาพนิ่งถูกสแกนที่ 40 การขยายการใช้เวิร์กสเตชันAperio ScanScope XT (Aperio เทคโนโลยีอิงค์, Vista, California, USA) . เป็นภาพดิจิตอลที่มีซอฟแวร์ ImageScope (Aperio) และใช้ในการวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงของสีมาตรฐานขั้นตอนวิธีการวิเคราะห์deconvolution (Aperio) granulomas จุลถูกระบุว่าเป็นหนึ่งในสี่ขั้นตอน(IeIV) granuloma แต่ละคนได้รับการคัดเลือกให้เป็นภูมิภาคที่น่าสนใจโดยใช้ปากกาด้วยมือเปล่าเครื่องมือ(รูปที่ 1). การใช้สี ImageScope ขั้นตอนวิธีการวิเคราะห์ deconvolution ปฏิกิริยา chromogenic ของสีแดงได้อย่างรวดเร็ว? ได้รับการระบุปริมาณและพื้นที่เปอร์เซ็นต์ของสีแดงได้อย่างรวดเร็ว? การติดฉลาก permm 2 ของ granuloma ที่คำนวณได้ การควบคุมการติดฉลาก (ภาพนิ่งเช่นกับรวดเร็วแดง? ย้อมสีเพียงอย่างเดียวหรือ haematoxylin กิลล์ของการย้อมสีเท่านั้น) ถูกนำมาใช้ใน deconvolution สีขั้นตอนวิธีการที่จะเพิ่มการระบุอย่างรวดเร็วสีแดง? การติดฉลากและลดการรวมของพื้นหลัง haematoxylin counterstaining. การวิเคราะห์ทางสถิติข้อมูลปกติใช้ log10transformation ได้. หมายถึง ค่าของการติดฉลากบวกร้อยละสำหรับแต่ละขั้นตอนgranuloma ถูกนำมาเปรียบเทียบโดยใช้การวิเคราะห์ทางเดียวความแปรปรวน (ปริซึม GraphPad 6.0 GraphPad ซอฟแวร์, San Diego, California, USA) ความแตกต่างระหว่างวิธีมาเปรียบเทียบโดยใช้ของ Tukey เปรียบเทียบหลาย tests.P <0.05 ได้รับการพิจารณาอย่างมีนัยสำคัญ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ละอองความท้าทายกับม. bovis
สองสายพันธุ์ OFM . boviswere ใช้สำหรับความท้าทาย : 95-1315 ( schmittet al . , 1997 ) และ 10-7428 ( ฟราน
et al . , 2010 ) ผ่านต่ำ ( # 3 ) วัฒนธรรมของทั้งสองสายพันธุ์
เตรียมได้โดยใช้เทคนิคมาตรฐาน ( Larsen
et al . , 2007 ) ในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลว ( หรือเปล่า 7h9 เบคตอน
ดิกคินสัน Franklin Lakes , New Jersey , USA ) เสริมด้วย 10% acidealbuminedextrose
เทนซับซ้อน ( มสธ. ) บวก 0.05 เปอร์เซ็นต์ Tween 80 สองคนนี้
สายพันธุ์ได้รับการแสดงที่จะทำให้เกิดความรุนแรงของ
เท่ากันและระดับความรุนแรงของรอยโรคคล้ายกัน ( waterset al . ,
2014 ) เช่น การวิเคราะห์ทั้งหมด calves ถือว่า
เป็น OFM กลุ่มเดียว bovisinfected สัตว์ ลูกโคโฮลสไตน์
( 6 เดือน neutered ชาย ) ได้
จากวัณโรคฟรีฝูงและตั้งอยู่ใน Biosafety
ระดับ ( BSL ) - 3 สถานที่ที่สัตว์ประจำชาติโรค
ศูนย์เอมส์ , ไอโอวา , ตามสถาบันความปลอดภัยและดูแลสัตว์และแนวทางคณะกรรมการ

ใช้ . สามเดือนหลังจากการซื้อกิจการของ
น่อง , ม. bovischallenge เชื้อที่ถูกส่งโดย
nebulization เป็นหน้ากาก ( ม้า
aeromask

; trudell ทางการแพทย์นานาชาติ ลอนดอน , Ontario , แคนาดา ) ครอบคลุมจมูกและปาก ลูกวัว
ได้รับทั้ง 10
4
อาณานิคมสร้างหน่วย ( CFU ) OFM . bovis95-1315 ( N ¼ 8 ) หรือ 10
4
cfum . bovis10-7428 ( N ¼ 8 )
โดยสเปรย์ตามที่อธิบายไว้ ( palmeret al . , 2002 ) เชื้อถูกสูดดมผ่านทางวันเวย์วาล์วใน
หน้ากากและตรงเข้าไปในปอดผ่านจมูก .
กระบวนการอย่างต่อเนื่อง จนปริมาณฟอสเฟต 1 ml
ในน้ำเกลือ ( PBS ) ล้างเชื้อ
หลอดและการเพิ่มเติม 2 ml ของ PBS ถูกส่ง , กระบวนการใช้เวลาประมาณ 10 นาที

โปรโตคอลเข้มงวดความปลอดภัยทางชีวภาพ การปกป้องบุคคลจาก
เปิดรับม. bovisthroughout การศึกษา
เลี้ยงสัตว์ bsl-3 มีความดันอากาศเป็นลบเป็น
เมื่อเทียบกับข้างนอก การไหลของอากาศภายในห้องเป็นสัตว์
อากาศสกัดจากห้องแต่ละ
,การป้องกันการแลกเปลี่ยนอากาศระหว่างห้อง .
ให้ปรับการผลิตเนื่องจากการเปลี่ยนแปลงอากาศ

แยกดีเอ็นเอต่อชั่วโมง และการแสดงละครของรอยโรค
ทั้งหมดลูกวัวถูกฆ่าตาย 150 วันหลังจากที่ท้าทายโดยการบริหารยาของโซเดียม เพน
.
เนื้อเยื่อถูกตรวจแผลขั้นต้นและการวิเคราะห์และประมวลผล
สมุนไพร OFM แยก วัฒนธรรมแบคทีเรีย bovisby

พบทั้งหมดเนื้อเยื่อ
ตรวจสอบรายงานในรายละเอียดอื่น ๆ ( น้ำ
et al . , 2010 ) ไซโตไคน์ที่ควบคู่และการแสดงออกของยีนรายงานฉบับนี้ถูก จำกัด ให้คีโมไคน์
ตัวอย่างจากปอด ตัวอย่างของปอดที่มีตัวแทนรวมแผล ศึกษาด้านสมุนไพร ใช้
ประเมินผล จ้ะ


rnascope
ระบบขั้นสูงการวินิจฉัยเซลล์
อิงค์ , เฮย์เวิร์ด , แคลิฟอร์เนีย ,สหรัฐอเมริกา ) และการวิเคราะห์ขนาด

จำนวนคงที่ใน 10% ฟอร์มาลินที่เป็นกลางนี้

และประมวลผลตรวจที่ฝังอยู่ในขี้ผึ้งพาราฟิน ส่วน ( 5 ) ถูกย้อมด้วยสีฮีมาท๊อกซีลินและ eosin ( เขา ) ที่อยู่ติดกันส่วนจากตัวอย่างที่มี caseonecrotic ศัลยกรรมพลาสติก
ชี้นําวัณโรคเป็นคราบ
ziehleneelsen สำหรับเทคนิคการแสดงของ acidfast แบคทีเรีย ( AFB )