We conducted studies to determine t

We conducted studies to determine the minimum primer length required for PCR amplification by the S-Tbr and Taq polymerases. For initial testing, primers were designed based on the nondegenerate versions of the 27F (sometimes called 8F) and 1492R primers used to amplify bacterial 16S rRNA genes (designated 27F-P and 1492R-P in this work) (Table ​(Table1)1) (18). Beginning with a 20-nt forward primer sequence (Fig. ​(Fig.1A),1A), we designed a series of progressively shorter primers with lengths from 20 to 8 nt (Fig. ​(Fig.1A).1A). To determine the lower limit for primer length, PCRs were performed using a forward primer from the series of decreasing lengths paired with a 19-nt reverse primer; E. coli genomic DNA was used as the template (Fig. ​(Fig.1B).1B). With S-Tbr polymerase, successful amplification resulted with a primer as short as 10 nt. In a parallel experiment, Taq required the primer to be longer than 14 nt for detectable amplification (Fig. ​(Fig.1B).1B). PCR products were produced with forward and reverse primers of 10 nt at annealing temperatures as high as ∼49°C (Fig. ​(Fig.1C).1C). To distinguish this new PCR method from traditional Taq PCR, we refer to the shortened primers as “miniprimers” and to PCR using them as “miniprimer PCR”.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เราดำเนินการศึกษาเพื่อกำหนดความยาวไพรเมอร์ขั้นต่ำที่จำเป็นสำหรับการขยาย pcr โดย s-TBR และ taq polymerases สำหรับการทดสอบครั้งแรกของไพรเมอร์ได้รับการออกแบบขึ้นอยู่กับรุ่นของ nondegenerate 27f (บางครั้งเรียก 8f) และไพรเมอร์ 1492r ใช้เพื่อขยายแบคทีเรีย rrna 16s ยีน (p-27f กำหนดและ 1492r-p ในงานนี้) (ตาราง (table1) 1 ) (18)เริ่มต้นด้วย 20-NT ไพรเมอร์ไปข้างหน้าตามลำดับ (รูปที่ (fig.1a) 1a) เราได้รับการออกแบบชุดของไพรเมอร์มีความก้าวหน้าสั้นที่มีความยาว 20-8 NT (รูป (fig.1a) .1) เพื่อกำหนดวงเงินที่ต่ำกว่าสำหรับความยาวไพรเมอร์ PCRs ถูกดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์ไปข้างหน้าจากชุดของความยาวลดลงจับคู่กับไพรเมอร์ 19-NT กลับจ dna จีโนม coli ถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบ (รูป (รูปที่1b) .1 ข) ด้วย s-TBR โพลิเมอร์ขยายผลให้ประสบความสำเร็จด้วยไพรเมอร์สั้นที่สุดเท่าที่ 10 NT ในการทดลองขนาน taq ต้องไพรเมอร์ที่จะนานกว่า 14 NT สำหรับการขยายการตรวจพบ (รูปที่ (fig.1b) .1 ข) pcr ผลิตภัณฑ์ที่ผลิตด้วยไปข้างหน้าและย้อนกลับไพรเมอร์จาก 10 NT ที่อุณหภูมิการหลอมสูงที่สุดเท่าที่ ~ 49 องศาเซลเซียส (รูปที่ (fig.1c) 0.1 ค)ที่จะแยกวิธี PCR นี้ใหม่จาก pcr taq แบบดั้งเดิมที่เราจะเรียกสั้นลงเป็นไพรเมอร์ "miniprimers" และ pcr ใช้พวกเขาในฐานะ "pcr miniprimer"

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เราดำเนินการศึกษาเพื่อกำหนดความยาวพื้นขั้นต่ำที่จำเป็นสำหรับการขยาย PCR โดย polymerases S-Tbr และ Taq การทดสอบเริ่มต้น ไพรเมอร์ถูกออกแบบตามรุ่น 27F (บางครั้งเรียกว่า 8F) และไพรเมอร์ 1492R ที่ใช้ในการขยายเชื้อแบคทีเรีย 16S rRNA ยีน (กำหนด 27F-P และ P 1492R ในงานนี้) nondegenerate (ตาราง (Table1) 1) (18) เริ่มต้น ด้วยลำดับรองพื้นไปข้างหน้า 20-nt (ฟิก(Fig.1A),1A), เราออกแบบชุดของไพรเมอร์ความก้าวหน้าสั้นมีความยาว 20 8 nt (ฟิก(Fig.1A).1A) เพื่อกำหนดขีดจำกัดล่างสำหรับรองพื้นยาว PCRs ได้ดำเนินการโดยใช้รองพื้นไปข้างหน้าจากชุดของการจับคู่กับพื้นตัวกลับ 19-nt ความยาวลดลง E. coli genomic DNA ถูกใช้เป็นแม่แบบ (ฟิก(ฟิก1B) .1B) กับพอลิเมอเรส S Tbr ประสบความสำเร็จขยายผลกับพื้นที่สั้นเพียง 10 nt ในทดลองขนาน Taq ต้องรองพื้นนานกว่า 14 สำหรับอาสาขยาย (ฟิก(Fig.1B).1B) ผลิตผลิตภัณฑ์ PCR กับไพรเมอร์ไปข้างหน้า และย้อนกลับ 10 nt ในการอบเหนียวสูง ∼49 ° C อุณหภูมิ (ฟิก(Fig.1C).1C) เมื่อต้องการแยกแยะวิธี PCR นี้ใหม่จาก PCR Taq ดั้งเดิม เราดูไพรเมอร์ย่อเป็น "miniprimers" และ PCR นั้นเป็น "miniprimer PCR"

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เราจัดให้บริการการศึกษาเพื่อกำหนดความยาว Primer ต่ำสุดที่จำเป็นสำหรับการขยายเสียง pcr โดย polymerases S - TBR และ taq ได้ สำหรับการทดสอบครั้งแรก, primers ได้รับการออกแบบที่ใช้ nondegenerate รุ่น 27 F (บางครั้งเรียกว่า 8 f )และ 1492 R primers ใช้แบคทีเรียในการเพิ่ม 16 S rrna ยีน(ที่กำหนด 27 F - P และ 1492 R - P ในเรื่องนี้ทำงาน)(ตาราง ​ (โต๊ะ 1 ) 1 )( 18 ).เริ่มต้นด้วย 20 - NT ส่งต่อเชื้อปะทุตามลำดับ(รูปที่ ​ (รูปที่ 1 ) 1 )เราได้รับการออกแบบชุดของ primers สั้นลงอย่างต่อเนื่องด้วยความยาวตั้งแต่ 20 ถึง 8 NT (รูปที่ ​ (รูปที่ 1 ) 1 ) ในการกำหนดวงเงินลดลงของความยาวเชื้อปะทุ pcrs นั้นดำเนินการโดยใช้ส่งต่อชนวนจากชุดของการลดความยาวที่จับคู่กับ 19 - NT ย้อนกลับเชื้อปะทุที่ผลดีเอ็นเอ genomic ถูกใช้เป็นเทมเพลต(รูปที่ ​ (รูปที่B 1 b ) 1 ) พร้อมด้วย polymerase S - TBR ประสบความสำเร็จทำให้การขยายสัญญาณเสียงพร้อมด้วยเชื้อปะทุเป็นในระยะสั้น 10 NT ในการทดลองแบบคู่ขนานที่ taq ต้องมีเชื้อปะทุที่จะต้องมีความยาวไม่เกิน 14 NT สำหรับสามารถตรวจพบการขยายสัญญาณเสียง(รูปที่ B ​ (รูปที่ 1 b ) 1 ) ผลิตภัณฑ์ pcr มีการผลิตด้วยไปข้างหน้าและ primers ย้อนกลับของ 10 NT ที่ อุณหภูมิ annealing สูงเป็น ∼ 49 ° C (รูปที่ C ​ (รูปที่ 1 C ) 1 )ในการแยกวิธีการ pcr ใหม่นี้จาก taq pcr แบบดั้งเดิมเราดู primers สั้นลงเป็น" miniprimers "และเพื่อใช้เป็น pcr " pcr miniprimer "