This example describes the การสร้าง

This example describes the การสร้างเซลล์ประสาทใหม่ of hADSCs by PE as compared to

DHA and a ชุดควบคุมเชิงลบ.

[0186] PE from bovine and plant was purchased from Matreya ® (Cat.#1069) and (Cat.#1301) respectively. PE from bovine was diluted in 100% ethanol to 67.2mM. PE from plant was diluted in 100% ethanol to 67.6 mM. These สารละลายs were then stored at 4°- 8° C. [0187] hADSCs were purchased from lnvitrogen, also known as Life Technologies, of Carlsbad, CA, U.S.A., and were cultured as near confluent monolayers in 1 OOmm จานเพาะเลี้ยง

within a maintenance media consisting of Complete MesenPro RS อาหารเพาะเชื้อ with growth supplement and L-glutamine obtained from lnvitrogen®. The process of culturing, พาสเซจ, และ seeding the hADSCs is described below.
[0188] The subculture of hADSCs was performed when cell culture reached confluence.

เพื่อพาสเซจ hADSCs, the following procedure is used: i) aspirate the Complete MesenPRO RS อาหารเพาะเชื้อ from the cells; ii) rinse the surface area of the cell layer with Dulbecco's ฟอสเฟต buffered saline (DBPS) buffer by adding the DPBS to the side of the vessel opposite the attached cell layer and rocking the vessel back and forth several times; iii) remove the DPBS by aspiration and discard; iv) detach the cells by adding a sufficient volume of pre-warmed trypsin• EDTA สารละลาย without phenol red to cover the cell layer; v) incubate at 37°C. for approximately
7 minutes; vi) observe the cells under a microscope to determine if additional incubation is needed; vii) add 3ml of the maintenance media to the plate, mix the cell suspension, add the suspension to a 15ml centrifuge tube and centrifuge at 21 Og for 5 minutes; viii) determine the total number of cells and percent viability using a hemacytometer; ix) add Complete MesenPRO RS อาหารเพาะเชื้อ to each vessel so that the final culture volume is 0.2ml - 0.5ml per cm2; x) seed the cells by adding the appropriate volume of cells to each vessel and incubate at 37°C., 5%
C02 and 90% humidity; and xi) three or four days after seeding, completely remove the อาหารเพาะเชื้อ and replace with an equal volume of Complete MesenPRO RS อาหารเพาะเชื้อ.
89] Before seeding the พาสเซจd hADSCs on fresh จานเพาะเลี้ยง, the surfaces of the culture ware are washed with sterile DPBS สารละลาย three times, followed by multiple rinses with sterile water. The first layer of coating is โพลี-L-ออร์นิธีน. The coating is prepared by adding about 15 ถึงประมาณ 20 µg/ml of โพลี-L-ออร์นิธีน and incubating at 37°C. for one hour.
The plate is washed three times with DPBS, 15 minutes per wash. The second layer of coating is bovine plasma ไฟโบรเนคติน. The ไฟโบรเนคติน is diluted in DPBS from stock to 1: 1000 and 500
µL ถูกเติม to each well. The plate is left at room temperature for one hour. One final wash with 500 µL ต่อหลุม of DPBS is performed and the plate is used immediately.
เซลล์จากนั้นถุกนำไปผ่านการนำเอาออกและหว่านซ้ำที่ความหนาแน่น 2x104 เซลล์/ml ( 1 x104 เซลล์/หลุม) ลงบน จานเพาะเลี้ยง 24 หลุมซึ่งมีการเคลือบโพลี-L-ออร์นิธีนและโบไวน์พลาสมาไฟโบรเนคติน
สามวันหลังการหว่านและการเตรียมพร้อม; อาหารเพาะเลี้ยงถุกเปลี่ยนเป็นอาหารเพาะเชื้อการพัฒนาเปลี่ยนแปลงของนิวรอน จานเพาะเลี้ยง were removed from the incubator and all procedures were conducted in a laminar flow hood. The อาหารเพาะเลี้ยง was completely removed from each well. The hADSCs were then washed with sterile DPBS สารละลาย in an amount of about 1 ml ต่อหลุม, to remove excess อาหารเพาะเลี้ยง. The DPBS สารละลาย was removed and replaced with อาหารเพาะเชื้อการพัฒนาเปลี่ยนแปลงของนิวรอน The formulation of the อาหารเพาะเชื้อการพัฒนาเปลี่ยนแปลงของนิวรอนคือในรูปแบบที่ว่าการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ would be attributed to the สารอาหาร and not to the อาหารเพาะเชื้อ. อาหารเพาะเชื้อการพัฒนาเปลี่ยนแปลงของนิวรอนที่ใช้คือ Neurobasal™ อาหารเพาะเชื้อ, available from lnvitrogen®, which comprises the following ingredients listed below in Table 1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวอย่างนี้อธิบายการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ของ hADSCs โดย PE เป็น compared เพื่อ ดีเอชเอและชุดควบคุมเชิงลบการ[0186] PE จากวัวและโรงงานที่ซื้อจาก Matreya ® (Cat. #1069) และ (Cat. #1301) ตามลำดับ PE จากวัวถูกทำให้เจือจางในเอทานอล 100% 67.2 มม. PE จากพืชถูกทำให้เจือจางในเอทานอล 100% ถึง 67.6 มม สารละลายs เหล่านี้ถูกเก็บไว้แล้ว 4° 8 ° C. [0187] hADSCs ซื้อจาก lnvitrogen หรือที่เรียกว่าชีวิตเทคโนโลยี ของคาร์ลส CA สหรัฐอเมริกา และมีอ่างเป็นใกล้ monolayers confluent ใน 1 OOmm จานเพาะเลี้ยงภายในประกอบด้วย RS MesenPro สมบูรณ์บำรุงรักษาสื่อ อาหารเพาะเชื้อเสริมการเจริญเติบโตและ L glutamine ได้จาก lnvitrogen ® การ culturing พาสเซจ และเมล็ด hADSCs ที่อธิบายด้านล่าง[0188] วัฒนธรรมของ hADSCs ทำการเพาะเลี้ยงเซลล์ถึงบรรจบเพื่อพาสเซจ hADSCs ขั้นตอนต่อไปนี้ใช้: ฉัน) aspirate อาหารเพาะเชื้อสมบูรณ์ MesenPRO RS จากเซลล์ ii) ล้างพื้นที่ผิวของชั้นเซลล์กับดุลเบกโกของฟอสเฟต buffered saline (DBPS) บัฟเฟอร์ โดยการเพิ่ม DPBS ที่ข้างเรือตรงข้ามชั้นเซลล์แนบ และโยกไปมาหลายครั้ง เรือ iii) เอา DPBS ด้วยความใฝ่ฝันและละทิ้ง iv) เซลล์แยกออก โดยการเพิ่มปริมาณที่เพียงพอของสารละลาย EDTA trypsin• warmed ก่อนโดยวางแดงกลบชั้นเซลล์ v) ฟักที่ 37 องศาเซลเซียส สำหรับการประมาณ7 นาที vi) สังเกตเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์การตรวจสอบถ้าบ่มเพิ่มเติมเป็นสิ่งจำเป็น vii) เพิ่ม 3 ml บำรุงรักษาสื่อจาน ผสมระงับเซลล์ เพิ่มการระงับ 15 ml หลอดเครื่องหมุนเหวี่ยงและเครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 21 ออก 5 นาที viii) กำหนดจำนวนและเปอร์เซ็นต์นี้ใช้ hemacytometer ix) เพิ่มสมบูรณ์อาหารเพาะเชื้อ MesenPRO RS เรือแต่ละเพื่อให้เสียงวัฒนธรรมสุดท้าย มล 0.2-0.5 ml ต่อ cm2 x) เมล็ดเซลล์ โดยการเพิ่มปริมาณเซลล์ที่เหมาะสมกับเรือแต่ละ และฟักที่ 37 องศาเซลเซียส 5%ความชื้น C02 และ 90% และ xi) สาม หรือสี่วันหลังจากปลูก เอาอาหารเพาะเชื้อ และแทนที่ ด้วยปริมาณเท่ากันของอาหารเพาะเชื้อเสร็จสมบูรณ์ MesenPRO RS อย่างสมบูรณ์89] ก่อนที่จะปลูก hADSCs พาสเซจd บนจานเพาะเลี้ยงสด พื้นผิวของเครื่องวัฒนธรรมจะล้างกับกอซ DPBS สารละลายสามครั้ง ตาม ด้วย rinses หลายกระบอกน้ำ ชั้นแรกของเคลือบคือโพลี-L-ออร์นิธีน เป็นเตรียมเคลือบ โดยเพิ่มประมาณ 15 ถึงประมาณ 20 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง/มลโพลี-L-ออร์นิธีน และ incubating ที่ 37 องศาเซลเซียส ในหนึ่งชั่วโมงจานไม่ล้างสามครั้ง ด้วย DPBS ต่อซัก 15 นาที ชั้นที่สองของเคลือบเป็นพลาสม่าวัวไฟโบรเนคติน ไฟโบรเนคตินถูกทำให้เจือจางใน DPBS จากหุ้น 1:1000 และ 500ถูกเติม µL ให้ดีละ จานที่เหลือที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง ดำเนินการหนึ่งสุดท้ายซัก 500 µL ต่อหลุมของ DPBS และใช้แผ่นทันทีเซลล์จากนั้นถุกนำไปผ่านการนำเอาออกและหว่านซ้ำที่ความหนาแน่น 2 x 104 เซลล์/มล. (เซลล์ 1 x 104 หลุม) ลงบนจานเพาะเลี้ยง 24 หลุมซึ่งมีการเคลือบโพลี-L-ออร์นิธีนและโบไวน์พลาสมาไฟโบรเนคตินสามวันหลังการหว่านและการเตรียมพร้อม อาหารเพาะเลี้ยงถุกเปลี่ยนเป็นอาหารเพาะเชื้อการพัฒนาเปลี่ยนแปลงของนิวรอนจานเพาะเลี้ยงออกจากการบ่มเพาะวิสาหกิจ และกระบวนงานทั้งหมดได้ดำเนินการในฮูดกระแส laminar อาหารเพาะเลี้ยงสมบูรณ์ได้ถูกเอาออกจากบ่อแต่ละ แล้ว hADSCs ถูกล้าง ด้วยสารละลาย DPBS ใส่ในเป็นจำนวนเงินประมาณ 1 ml ต่อหลุม เอาอาหารเพาะเลี้ยงส่วนเกิน DPBS สารละลายถูกเอาออก และแทนที่ ด้วยอาหารเพาะเชื้อการพัฒนาเปลี่ยนแปลงของนิวรอนที่กำหนดอาหารเพาะเชื้อการพัฒนาเปลี่ยนแปลงของนิวรอนคือในรูปแบบที่ว่าการสร้างเซลล์ประสาทใหม่จะเกิดจาก การสารอาหาร และไม่อาหารเพาะเชื้อ อาหารเพาะเชื้อการพัฒนาเปลี่ยนแปลงของนิวรอนที่ใช้คือ Neurobasal ™อาหารเพาะเชื้อ จาก lnvitrogen ®, ซึ่งประกอบด้วยส่วนผสมดังต่อไปนี้ที่แสดงด้านล่างในตารางที่ 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวอย่างเช่นนี้อธิบายถึงการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ของ hADSCs โดย PE เมื่อเทียบกับดีเอชเอและชุดควบคุมเชิงลบ. [0186] PE จากวัวและโรงงานซื้อมาจาก Matreya ® (Cat. # 1069) และ (Cat. # 1301) ตามลำดับ PE จากวัวที่ถูกเจือจางในเอทานอล 100% เพื่อ 67.2mM PE จากโรงงานเอทานอลเจือจางใน 100% ถึง 67.6 มิลลิ เหล่านี้สารละลายของถูกเก็บไว้ที่ 4 องศา - 8 องศาเซลเซียส [0187] hADSCs ซื้อจาก lnvitrogen ยังเป็นที่รู้จักเทคโนโลยีชีวิตของคาร์ลส, CA, USA และเพาะเลี้ยงที่ใกล้ monolayers ไหลมารวมกันใน 1 OOmm จานเพาะเลี้ยงภายใน สื่อการซ่อมบำรุงประกอบด้วยอาร์เอสที่สมบูรณ์ MesenPro อาหารเพาะเชื้อที่มีการเจริญเติบโตและเสริม L-glutamine ที่ได้รับจากlnvitrogen® กระบวนการของการเพาะเลี้ยง, พาสเซจ, และการเพาะ hADSCs ดังนี้. [0188] วัฒนธรรมของ hADSCs ได้ดำเนินการเพาะเลี้ยงเซลล์เมื่อถึงจุดบรรจบ. เพื่อพาสเซจ hADSCs, ขั้นตอนต่อไปจะใช้ i) ดูดสมบูรณ์ MesenPRO อาร์เอสอาหารเพาะเชื้อจากเซลล์; ii) การล้างพื้นที่ผิวของชั้นเซลล์ที่มี Dulbecco ของฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (DBPs) โดยการเพิ่มบัฟเฟอร์ DPBS ไปที่ด้านข้างของเรือตรงข้ามชั้นเซลล์ที่แนบมาและโยกเรือไปมาหลายครั้ง; iii) การลบ DPBS โดยความทะเยอทะยานและทิ้ง; iv) การแยกเซลล์โดยการเพิ่มปริมาณที่เพียงพอของ trypsin ก่อนอุ่น• EDTA สารละลายฟีนอลสีแดงโดยไม่ต้องให้ครอบคลุมถึงชั้นเซลล์; โวลต์) ฟักที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ประมาณ7 นาที; vi) การสังเกตเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เพื่อตรวจสอบว่าการบ่มเพิ่มเติมเป็นสิ่งจำเป็น; vii) เพิ่ม 3ml ของสื่อการซ่อมบำรุงจานผสมเซลล์แขวนลอยเพิ่มระงับไปยังหลอด centrifuge 15ml และหมุนเหวี่ยงที่ 21 Og เป็นเวลา 5 นาที viii) กำหนดจำนวนของเซลล์ที่มีชีวิตและร้อยละโดยใช้ hemacytometer; ix) เพิ่มอาร์เอสที่สมบูรณ์ MesenPRO อาหารเพาะเชื้อเรือแต่ละเพื่อให้ปริมาณวัฒนธรรมสุดท้ายคือ 0.2ml - 0.5ml ต่อ cm2; x) เมล็ดพันธุ์เซลล์โดยการเพิ่มปริมาณที่เหมาะสมของเซลล์แต่ละเรือและฟักไข่ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส, 5%. C02 และ 90% ความชื้น และจิน) สามหรือสี่วันหลังจากการเพาะเอาอาหารเพาะเชื้อและแทนที่ด้วยปริมาณที่เท่ากันของอาร์เอสที่สมบูรณ์ MesenPRO อาหารเพาะเชื้อ. 89] ก่อนการเพาะพาสเซจ d hADSCs บนจานเพาะเลี้ยงสด, พื้นผิวของ เครื่องวัฒนธรรมล้างด้วยสารละลาย DPBS หมันสามครั้งตามด้วยการล้างหลายน้ำหมัน ชั้นแรกของการเคลือบเป็นโพลี -L- ออร์นิธีน เคลือบจะถูกจัดเตรียมโดยการเพิ่มประมาณ 15 ถึงประมาณ 20 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรโพลี -L- ออร์นิธีนและบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง. จานล้างสามครั้งด้วย DPBS 15 นาทีต่อการซัก ชั้นที่สองของการเคลือบเป็นพลาสม่าวัวไฟโบรเนคติน ไฟโบรเนคตินมีการปรับลดใน DPBS จากสต็อก 1: 1,000 และ 500 ไมโครลิตรถูกเติมให้กันดี แผ่นที่เหลืออยู่ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง หนึ่งล้างสุดท้ายกับ 500 ไมโครลิตรต่อหลุมของ DPBS จะดำเนินการและแผ่นที่ใช้ 2x104 เซลล์ / มล. (1 x104 เซลล์ / หลุม) ลงบนจานเพาะเลี้ยง 24 จานเพาะเลี้ยงออกจากศูนย์บ่มเพาะและทุกขั้นตอนได้ดำเนินการในเครื่องดูดควันไหล อาหารเพาะเลี้ยงจะถูกลบออกจากกันอย่างสมบูรณ์ดี hADSCs ถูกล้างด้วยสารละลาย DPBS ผ่านการฆ่าเชื้อในปริมาณประมาณ 1 มิลลิลิตรต่อหลุมเพื่อลบส่วนเกินอาหารเพาะเลี้ยง DPBS สารละลายจะถูกลบออกไปและแทนที่ด้วย การกำหนดของ จะนำมาประกอบกับสารอาหารและไม่ให้อาหารเพาะเชื้อ Neurobasal ™อาหารเพาะเชื้อที่มีอยู่จากlnvitrogen®ซึ่งประกอบด้วยส่วนผสมดังต่อไปนี้ระบุไว้ด้านล่างในตารางที่ 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตัวอย่างอธิบายการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ของ hadscs โดย PE เทียบกับ

DHA และชุดควบคุมเชิงลบ

[ 0186 ] PE จากวัว และปลูกได้ ซื้อจาก matreya ® ( แมว # 1069 ) และ ( แมว # 1844 ) ตามลำดับ PE จาก pantip.com เจือจางในเอทานอล 100% 67.2mm . PE จากพืชเจือจางในเอทานอล 100 % ส่วน mmเหล่านี้สารละลาย S แล้วเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4 องศา - 8 องศา 0187 ] [ hadscs ซื้อมาจาก lnvitrogen ที่เรียกว่าเทคโนโลยี ชีวิตของคาร์ลสแบด , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา และถูกเลี้ยงเป็นใกล้กระจู๋กระจี๋ monolayers ใน 1 oomm จานเพาะเลี้ยง

ในการบำรุงรักษาสื่อประกอบด้วย mesenpro RS เสร็จอาหารเพาะเชื้อกับเสริมการเจริญเติบโตและ Glutamine ได้จาก lnvitrogen ® . กระบวนการของการเพาะเลี้ยง , พาสเซจและ , เมล็ด hadscs อธิบายด้านล่าง .
[ ] 0188 วัฒนธรรมของการเพาะเลี้ยงเซลล์ hadscs เมื่อมาถึงจุดบรรจบ

เพื่อพาสเซจ hadscs , ขั้นตอนต่อไปคือการใช้ฉัน ) หรือที่อาหารเพาะเชื้อ mesenpro RS เสร็จจากเซลล์ ; 2 ) ล้างพื้นที่ผิวของชั้นเซลล์กับดัลเบโค่ก็ฟอสเฟตในน้ำเกลือ ( dbps ) บัฟเฟอร์โดยเพิ่ม dpbs กับด้านข้างของเรือตรงข้ามแนบชั้นเซลล์หลอดเลือด และโยกไปมาหลายครั้ง ; 3 ) เอา dpbs ด้วยปณิธาน และทิ้ง ;4 ) แยกเซลล์โดยการเพิ่มปริมาณเพียงพอของก่อนออกทริป - EDTA สารละลายปราศจากฟีนอลสีแดงที่จะครอบคลุมชั้นเซลล์ ; V ) บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศา ประมาณ
7 นาที ; 6 ) สังเกตเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เพื่อตรวจสอบหากพบเพิ่มเติมคือ ต้องการ ; 7 ) เพิ่มในการบำรุงรักษาสื่อม. จานผสมเซลล์ระงับเพิ่มระบบกันสะเทือน เพื่อเหวี่ยงทาหลอดและเครื่อง 21 และ 5 นาที ; 8 ) ตรวจสอบจำนวนเซลล์และความมีชีวิตและการใช้ hemacytometer ; 9 ) เพิ่ม mesenpro สมบูรณ์ RS อาหารเพาะเชื้อแต่ละภาชนะเพื่อให้ปริมาณวัฒนธรรมสุดท้ายคือ 0.2ml - 0.5ml ต่อ CM2 ;x ) เมล็ดเซลล์โดยการเพิ่มปริมาณที่เหมาะสมของเซลล์ แต่ละเรือและบ่มที่ 37 ° C , C02 5 %
และความชื้น 90% และ Xi ) สามหรือสี่วัน น้ำหนักอาหารเพาะเชื้อลบและแทนที่ด้วยปริมาณเท่ากัน mesenpro RS เสร็จอาหารเพาะเชื้อ .
0 ] ก่อนที่เมล็ดพาสเซจ D hadscs บนจานเพาะเลี้ยงสดพื้นผิวของสินค้าวัฒนธรรมจะถูกล้างด้วย dpbs เป็นหมันสารละลาย 3 ครั้ง ตามด้วย rinses หลายกับน้ำหมัน ชั้นแรกของการเคลือบโพลี - L - ออร์นิธีน . เคลือบที่เตรียมไว้ โดยการเพิ่มประมาณ 15 ถึงประมาณ 20 µ g / ml โพลี - L - ออร์นิธีนเพาะที่อุณหภูมิ 37 องศา และหนึ่งชั่วโมง
จานซักสามครั้ง dpbs ด้วย ,15 นาทีต่อซัก ชั้นที่สองของโคพลาสม่าเคลือบไฟโบรเนคติน . การไฟโบรเนคตินเป็นเจือจางใน dpbs จากหุ้น 1 : 1000 และ 500
µผมถูกเติมแต่ละอย่างดี จานไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง หนึ่งล้างครั้งสุดท้ายกับ 500 µผมต่อหลุมของ dpbs จะดําเนินการและจานใช้ทันที
.เซลล์จากนั้นถุกนำไปผ่านการนำเอาออกและหว่านซ้ำที่ความหนาแน่น 2x104 เซลล์ / ml ( 1 x104 เซลล์ / หลุม ) ลงบนจานเพาะเลี้ยง 24 หลุมซึ่งมีการเคลือบโพลี - L - ออร์นิธีนและโบไวน์พลาสมาไฟโบรเนคติน
สามวันหลังการหว่านและการเตรียมพร้อม ;อาหารเพาะเลี้ยงถุกเปลี่ยนเป็นอาหารเพาะเชื้อการพัฒนาเปลี่ยนแปลงของนิวรอนจานเพาะเลี้ยงถูกเอาออกจากตู้อบ และขั้นตอนทั้งหมดมีวัตถุประสงค์ในการไหลแบบราบเรียบ เครื่องดูดควัน การอาหารเพาะเลี้ยงถูกลบออกอย่างสมบูรณ์จากแต่ละคนได้ดีการ hadscs แล้วล้างด้วยสารละลาย dpbs เป็นหมัน ในจํานวนประมาณ 1 ml ต่อหลุมเพื่อลบอาหารเพาะเลี้ยงส่วนเกินการ dpbs สารละลายถูกถอดออกและแทนที่ด้วยอาหารเพาะเชื้อการพัฒนาเปลี่ยนแปลงของนิวรอนสูตรของอาหารเพาะเชื้อการพัฒนาเปลี่ยนแปลงของนิวรอนคือในรูปแบบที่ว่าการสร้างเซลล์ประสาทใหม่จะเกิดจากการสารอาหารและไม่ต้องอาหารเพาะเชื้อการพัฒนาเปลี่ยนแปลงของนิวรอนที่ใช้คือ neurobasal ™อาหารเพาะเชื้อที่มีอยู่จาก lnvitrogen ®ซึ่งประกอบด้วยส่วนผสมด้านล่างตารางที่ 1 ต่อไปนี้