Culturing and Preparing BacteriaUsi

Culturing and Preparing Bacteria

Using good aseptic culturing technique, grow cells in liquid culture or on agar plates until solid cultures are dense or liquid cultures are in early stationary phase. In practice, this would be equivalent of shaking a bacterial culture overnight or letting cells grow on a plate for 1-2 days. For agar cultures, growing cells on slants (glass tubes) may be more practical as it omits the centrifugation step below. However, liquid cultures normally yield a greater number of viable cells.

For liquid cultures, the cells are centrifuged, the culture broth is removed, and the pellet is suspended in an equal volume of lyophilization medium. We recommend Reagent 18 or the Microbial Freeze Drying Buffer, though skim milk and sucrose will work. For agar cultures, flood the plate/tube with 5-10 ml of lyophilization medium. Using a sterile pipette, flush the medium over the colonies to dislodge the cells. Transfer the cell suspension to a sterile tube. We recommend that a cell count is performed which can be compared to cells following freeze drying. A simple dilution to extinction protocol is available here.

Aliquot the cell suspension into sterile vials or tubes. Only 250-500 μl is needed per vial as this represents around 108 bacteria. Place split stoppers on the vials or loosely plug tubes with glass wool. Vials with split stoppers are technically open to the air, thus at risk of contamination. In practice we have not found this to be an issue. If a vial contains upwards of a billion bacteria, one or two contaminating microbes become insignificant when that culture is rehydrated and streaked. If there is fear of contamination, or containment, then glass wool or cotton can be placed under the stopper to prevent contamination.
Freeze Drying Process - Shelf Lyophilizer

Turn on the lyophilizer and start the condenser. If there is an external condenser using a dry ice/ethanol mixture then prepare this as well. The shelf can be set to 4°C.

Center the vials on the shelf. This placement is important so that the stoppering plate can evenly press on the stoppers following freeze drying.

Using either manual or programmed controls, freeze the samples down to -40°C. This step should take approximately 30-60 minutes and is very dependent upon the instrument. If the rate of freezing can be controlled, then a drop of 1°C per minute is a practical rate. Once the samples reach temperature, they should be visibly frozen (clear liquid turn opaque and skim milk appears solid).

Allow the sample to sit at -40°C for 1 hr to ensure complete freezing. Vials at the center of a cluster may freeze more slowly than those on the outside.

Turn on the vacuum pump. Within 10-20 minutes, the vacuum should be under 200 millitorr (mtorr). Depending on the instrument, pressure may be reported in mtorr, mbar, Pascal, or "inches Hg" on a vacuum gauge. For reference, 100 mtorr = 0.133 mbar = 13.3 Pascal = 29.9" Hg = 0.000132 atm = 99.99% vacuum.

Once the vacuum is below 200 mtorr, increase the temperature of the shelf for primary drying, the phase associated with water sublimation. The temperature of the shelf is dependent upon the lyophilization medium. For sucrose, keep the shelf temperature at -25°C. For Reagent 18 or Microbial Freeze Drying Buffer, the shelf can be as high as -15°C. In any case, the greater the difference in temperature between the shelf and the condenser/ice trap, the more efficient the primary drying process will be.

If melting of the samples occurs, then it might be necessary to empirically determine a shelf temperature. A practical means to do this involves placing a sample of the lyoprotective medium on a shelf and incrementally lowering the temperature every 15 minutes. At some point the sample freezes. Under vacuum with a cold trap, your sample will be safe and will remain frozen. This is a practical method and is certainly not necessarily the most efficient primary drying temperature, but it should work well enough.

Primary drying is the longest phase of the freeze drying process. The idea is to keep the sample colder than condenser (or ice trap) but still sufficiently warm so that water sublimes rapidly. The temperature of the shelf can be raised to above the melting temperature as long as the sublimation process removes the heat flowing into the sample sufficiently fast to prevent melting and sample collapse (where the matrix literally caves in). The time for primary drying will also depend upon the volume of the sample. For bacteria, samples rarely need to be large and typically are 0.25 to 0.5 ml. A limited number of samples (10-20) in a shelf dryer can be completed in just a couple of hours. A fully loaded dryer with several hundred samples will take longer. Safely, a primary drying period which is overnight should work, but test this first before you attempt to freeze dry large numbers of vials. As a standard guide, freeze dry overnight.

Samples still contain moisture following primary drying. The amount is debatable, but it somewhere between 2 and 4%. This moisture level needs to be reduced and that is done by pumping heat into the sample during the secondary drying phase. This phase is relatively short, lasting 1 to 2 hours, but important for long-term viability. However, over drying of the bacteria can be detrimental as well. Once again, based on the idiosyncrasies of your lyophilizer and samples, the ideal time for secondary drying needs to be determined experimentally. Generally, raise the shelf temperature to 20°C and dry for 2 hours.

With the vacuum in place, stopper the vials using the stoppering plate/mechanism. Release the vacuum, remove the vials, and further secure the rubber bungs/stoppers with foil crimp seals. It is best to store the vials at 4°C in the dark.

Test the freeze dried bacteria for viability as compared to the original culture (see link). Additionally, monitor the stability/viability of the freeze dried cultures by testing at 30, 90, 180 and 365 days. A good protocol will yield nearly 100% viable cells. Anything above 50% is considered acceptable by many labs. Skim milk will yield 10-20%. However, % viable after freeze drying is not as important as the number viable following storage. If viability starts to decline rapidly by a log or more per month, then modification of the protocol is probably necessary. Note that some strains are simply very difficult to freeze dry and no matter what, these may die off quickly following lyophilization.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แบคทีเรียที่เพาะเลี้ยงและการจัดเตรียม

โดยใช้เทคนิคการเพาะเลี้ยงที่ดีปลอดเชื้อเติบโตเซลล์ในวัฒนธรรมของเหลวหรือบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อจนวัฒนธรรมที่เป็นของแข็งวัฒนธรรมหนาแน่นหรือของเหลวอยู่ในเฟสแรก ในทางปฏิบัตินี้จะเทียบเท่ากับการสั่นวัฒนธรรมแบคทีเรียในชั่วข้ามคืนหรือจะปล่อยให้เซลล์เจริญเติบโตบนแผ่น 1-2 วัน วัฒนธรรมวุ้นเซลล์ที่เจริญเติบโตบน slants (หลอดแก้ว) อาจมีการปฏิบัติมากขึ้นเท่าที่จะละเว้นขั้นตอนการปั่นแยกด้านล่าง แต่วัฒนธรรมของเหลวปกติผลผลิตจำนวนมากของเซลล์ทำงานได้.

วัฒนธรรมของเหลวเซลล์จะปั่น, น้ำซุปวัฒนธรรมจะถูกลบออกและเม็ดถูกระงับในปริมาตรที่เท่ากันของสื่อ lyophilization เราขอแนะนำสาร 18 หรือบัฟเฟอร์การอบแห้งแช่แข็งของจุลินทรีย์แม้ว่านมพร่องมันเนยและน้ำตาลซูโครสจะทำงาน วัฒนธรรมวุ้นน้ำท่วมแผ่น / หลอด 5-10 มล. ของกลาง lyophilization โดยใช้ปิเปตผ่านการฆ่าเชื้อล้างกลางผ่านอาณานิคมที่จะทำให้หลุดจากเซลล์ โอนเซลล์แขวนลอยเพื่อหลอดปลอดเชื้อ เราขอแนะนำให้นับเซลล์จะดำเนินการที่สามารถนำมาเปรียบเทียบกับการแช่แข็งเซลล์ต่อไปนี้การอบแห้งการลดสัดส่วนที่ง่ายในการโปรโตคอลการสูญเสียสามารถใช้ได้ที่นี่.

หารเซลล์แขวนลอยลงในขวดผ่านการฆ่าเชื้อหรือท่อ เพียง 250-500 ไมโครลิตรเป็นสิ่งจำเป็นต่อขวดเช่นนี้แสดงให้เห็นถึงรอบ 108 แบคทีเรีย วาง Stoppers แยกบนขวดหรือหลวมเสียบหลอดด้วยใยแก้ว ขวดด้วย Stoppers แยกเป็นเทคนิคเปิดให้อากาศจึงมีความเสี่ยงของการปนเปื้อนในทางปฏิบัติเรายังไม่ได้พบนี้เป็นปัญหา ถ้าขวดมีมากกว่าพันล้านแบคทีเรียหนึ่งหรือสองปนเปื้อนเชื้อจุลินทรีย์ที่ไม่มีนัยสำคัญเมื่อกลายเป็นวัฒนธรรมที่มีการคืนรูปและลาย ถ้ามีความกลัวการปนเปื้อนหรือบรรจุแล้วใยแก้วหรือผ้าฝ้ายสามารถอยู่ภายใต้การปิดเพื่อป้องกันการปนเปื้อน
หยุดกระบวนการอบแห้ง -. ชั้น lyophilizer

เปิด lyophilizer และเริ่มต้นคอนเดนเซอร์ ถ้ามีคอนเดนเซอร์ภายนอกโดยใช้ส่วนผสมน้ำแข็ง / เอทานอลที่แห้งแล้วเตรียมนี้เป็นอย่างดี หิ้งสามารถตั้งค่าให้ 4 ° c.

ศูนย์ขวดบนหิ้ง ตำแหน่งนี้เป็นสิ่งสำคัญที่แผ่น stoppering อย่างสม่ำเสมอสามารถกดบน Stoppers ต่อไปนี้การอบแห้งแช่แข็ง.

โดยใช้การควบคุมทั้งด้วยตนเองหรือโปรแกรมแช่แข็งตัวอย่างลงไปที่ -40 องศาเซลเซียสขั้นตอนนี้ควรใช้เวลาประมาณ 30-60 นาทีและมากขึ้นอยู่กับเครื่องมือ ถ้าอัตราของการแช่แข็งสามารถควบคุมได้แล้วลดลง 1 องศาเซลเซียสต่อนาทีเป็นอัตราที่ปฏิบัติ เมื่อกลุ่มตัวอย่างถึงอุณหภูมิพวกเขาควรจะแช่แข็งอย่างเห็นได้ชัด (เปิดของเหลวใสขุ่นและนมพร่องมันเนยแข็งปรากฏ).

ตัวอย่างให้ไปนั่งที่ -40 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อให้แน่ใจว่าการแช่แข็งที่สมบูรณ์ขวดที่เป็นศูนย์กลางของกลุ่มอาจหยุดได้ช้ากว่าผู้ที่อยู่ข้างนอก

เปิดปั๊มสูญญากาศ ภายใน 10-20 นาที, สูญญากาศที่ควรจะเป็นภายใต้ 200 millitorr (mtorr) ขึ้นอยู่กับตราสารที่ความดันอาจมีการรายงานใน mtorr, เอ็มบาร์, ปาสกาลหรือ "hg นิ้ว" บนมาตรวัดสูญญากาศ สำหรับการอ้างอิง 100 mtorr = 0.133 เอ็มบาร์ = 13.3 ปาสกาล = 29.9 "hg = 0.000132 เอทีเอ็ม = 99.99% สูญญากาศ.

เมื่อสูญญากาศต่ำกว่า 200 mtorr เพิ่มอุณหภูมิของการเก็บรักษาหลักสำหรับการอบแห้งขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับการระเหิดน้ำ อุณหภูมิของการเก็บรักษาจะขึ้นอยู่กับขนาดกลาง lyophilization เพื่อซูโครสรักษาอุณหภูมิการเก็บรักษาที่ -25 องศาเซลเซียส กับ 18 หรือสารบัฟเฟอร์แช่แข็งอบแห้งจุลินทรีย์ชั้นสามารถจะสูงถึง -15 องศาเซลเซียส ในกรณีใด ๆมากขึ้นความแตกต่างของอุณหภูมิระหว่างการเก็บรักษาและดักคอนเดนเซอร์ / น้ำแข็งมีประสิทธิภาพมากขึ้นกระบวนการอบแห้งหลักจะเป็น

ถ้าละลายของตัวอย่างที่เกิดขึ้นแล้วมันอาจจะจำเป็นที่จะต้องสังเกตุตรวจสอบอุณหภูมิการเก็บรักษาหมายถึงการปฏิบัติที่จะทำนี้เกี่ยวข้องกับการวางตัวอย่างของกลาง lyoprotective บนหิ้งและลดอุณหภูมิเพิ่มขึ้นทุก 15 นาที ในบางจุดค้างตัวอย่าง ภายใต้สูญญากาศกับดักเย็นตัวอย่างของคุณจะปลอดภัยและจะยังคงแช่แข็ง นี้เป็นวิธีการปฏิบัติและเป็นที่แน่นอนไม่จำเป็นต้องมีประสิทธิภาพมากที่สุดที่อุณหภูมิการอบแห้งหลักแต่มันควรจะทำงานได้ดีพอ

อบแห้งหลักคือขั้นตอนที่ยาวที่สุดของกระบวนการอบแห้งแช่แข็ง ความคิดที่จะเก็บตัวอย่างเย็นกว่าคอนเดนเซอร์ (หรือกับดักน้ำแข็ง) แต่ยังคงอบอุ่นพอเพื่อให้ระเหิดน้ำอย่างรวดเร็วอุณหภูมิของชั้นวางของที่สามารถยกขึ้นไปเหนืออุณหภูมิหลอมละลายตราบใดที่กระบวนการระเหิดเอาความร้อนที่ไหลเข้ามาในตัวอย่างรวดเร็วเพียงพอเพื่อป้องกันการละลายและการล่มสลายของกลุ่มตัวอย่าง (เมทริกซ์ที่แท้จริงในถ้ำ) เวลาในการอบแห้งเป็นหลักนอกจากนี้ยังจะขึ้นอยู่กับปริมาณของตัวอย่าง สำหรับแบคทีเรียตัวอย่างไม่ค่อยจำเป็นต้องมีขนาดใหญ่และมักจะเป็น 0.25-05 ml จำกัด จำนวนของตัวอย่าง (10-20) ในการเก็บรักษาเครื่องเป่าสามารถจะแล้วเสร็จในเวลาเพียงไม่กี่ชั่วโมง เครื่องเป่าแปล้หลายร้อยตัวอย่างจะใช้เวลานาน ได้อย่างปลอดภัยในช่วงเวลาการอบแห้งซึ่งเป็นหลักควรจะทำงานในชั่วข้ามคืน แต่การทดสอบครั้งแรกนี้ก่อนที่คุณพยายามที่จะแช่แข็งจำนวนมากแห้งของขวด เป็นคู่มือมาตรฐานแช่แข็งแห้งข้ามคืน.

กลุ่มตัวอย่างยังคงมีความชื้นต่อไปนี้การอบแห้งเป็นหลัก จำนวนเงินที่เป็นที่ถกเถียงกัน แต่มันอยู่ที่ไหนสักแห่งระหว่าง 2 และ 4% ระดับความชื้นนี้จะต้องลดลงและที่จะกระทำโดยการสูบน้ำร้อนเป็นตัวอย่างในระหว่างขั้นตอนการอบแห้งรอง ขั้นตอนนี้จะค่อนข้างสั้น, นาน 1 ถึง 2 ชั่วโมง แต่สิ่งที่สำคัญสำหรับชีวิตในระยะยาว แต่ผ่านการอบแห้งของแบคทีเรียที่สามารถเป็นอันตรายเช่นกันอีกครั้งขึ้นอยู่กับนิสัยของ lyophilizer และตัวอย่างของคุณเวลาที่เหมาะสำหรับการอบแห้งที่สองจะต้องมีการพิจารณาการทดลอง โดยทั่วไปเพิ่มอุณหภูมิการเก็บรักษาถึง 20 องศาเซลเซียสและแห้ง 2 ชั่วโมง

ด้วยสูญญากาศในสถานที่ปิดขวดโดยใช้แผ่น stoppering / กลไก สูญญากาศปล่อยให้เอาขวด,และต่อไปรักษาความปลอดภัย bungs ยาง / Stoppers ด้วยฟอยล์จีบซีล มันเป็นสิ่งที่ดีที่สุดเพื่อเก็บขวดที่ 4 องศาเซลเซียสในที่มืด.

ทดสอบแบคทีเรียแช่แข็งแห้งเพื่อความมีชีวิตเมื่อเทียบกับวัฒนธรรมเดิม (จะเห็นลิงค์) นอกจากนี้ยังตรวจสอบความมั่นคง / มีศักยภาพในการแช่แข็งแห้งวัฒนธรรมโดยการทดสอบที่ 30, 90, 180 และ 365 วัน โปรโตคอลที่ดีจะให้เซลล์ทำงานได้เกือบ 100%อะไรสูงกว่า 50% ถือว่าได้รับการยอมรับโดยห้องปฏิบัติการจำนวนมาก นมพร่องมันเนยจะให้ 10-20% แต่% ทำงานได้หลังจากการอบแห้งแช่แข็งไม่ได้ที่สำคัญเป็นจำนวนการจัดเก็บต่อไปนี้ทำงานได้ ถ้าชีวิตจะเริ่มต้นที่จะลดลงอย่างรวดเร็วจากการบันทึกหรือมากกว่าต่อเดือนแล้วการปรับเปลี่ยนของโปรโตคอลน่าจะเป็นสิ่งที่จำเป็น ทราบว่าบางสายพันธุ์เป็นเพียงเรื่องยากมากที่จะแช่แข็งแห้งและไม่ว่าสิ่งที่เหล่านี้อาจตายออกได้อย่างรวดเร็วต่อไปนี้ lyophilization

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Culturing และเตรียมแบคทีเรีย

ใช้เทคนิคเข้มข้น culturing ดี โตเซลล์ ในวัฒนธรรมของเหลว หรือแผ่น agar จนวัฒนธรรมที่เป็นของแข็งมีความหนาแน่นสูง หรือวัฒนธรรมของเหลวในระยะเริ่มต้นกับการ ในทางปฏิบัติ นี้จะเทียบเท่ากับการสั่นวัฒนธรรมแบคทีเรียเซลล์ค้างคืน หรือ letting เติบโตบนแผ่น 1-2 วัน สำหรับวัฒนธรรม agar เติบโตเซลล์บน slants (หลอดแก้ว) อาจจะมากจริงที่จะข้ามขั้นตอน centrifugation ด้านล่าง ผลอย่างไรก็ตาม วัฒนธรรมของเหลวปกติผลิตจำนวนของเซลล์ทำงานมากกว่า

สำหรับวัฒนธรรมของเหลว เซลล์มี centrifuged ซุปวัฒนธรรมจะถูกลบออก และเม็ดที่ถูกระงับในปริมาณเท่ากันของ lyophilization กลาง เราขอแนะนำ 18 รีเอเจนต์หรือจุลินทรีย์ตรึงแห้งบัฟเฟอร์ แม้ว่านม skim และซูโครสจะทำงาน สำหรับวัฒนธรรม agar น้ำท่วมแผ่น/หลอด มี 5-10 ml ของ lyophilization กลาง ใช้เปตต์กอซ ล้างสื่อผ่านอาณานิคมเพื่อไล่ออกเซลล์ โอนย้ายการระงับเซลล์ไปใส่หลอด เราขอแนะนำว่า จำนวนเซลล์จะทำซึ่งสามารถเปรียบเทียบกับเซลล์ที่ตรึงต่อการอบแห้ง เจือจางอย่างการดับโพรโทคอลได้มีที่นี่

ส่วนลงตัวระงับเซลล์ vials กระบอกหรือท่อ เพียง 250-500 μl เป็นสิ่งจำเป็นต่อคอนแทคนี้หมายถึงแบคทีเรียประมาณ 108 วางแบ่งจุกบน vials หรือต่อท่อ ด้วยเส้นใยแก้วซึ่ง Vials กับจุกแยกเทคนิคเปิดอากาศ ดังนั้นที่มีความเสี่ยงการปนเปื้อนได้ ในทางปฏิบัติ เราไม่พบนี้จะเป็นปัญหา ถ้าประกอบด้วยคอนแทคกับ upwards of พันล้านแบคทีเรีย จุลินทรีย์ contaminating หนึ่ง หรือสองเป็นสำคัญเมื่อว่า วัฒนธรรม rehydrated และลาย มีความกลัวปนเปื้อน หรือหาก ถ้าแก้วผ้าขนสัตว์หรือผ้าฝ้ายสามารถวางอยู่ใต้จุกเพื่อป้องกันการปนเปื้อน
กระบวนตรึงการแห้ง - Lyophilizer ชั้น

Lyophilizer ที่เปิด และเริ่มต้นที่เครื่องควบแน่น ถ้ามี เครื่องควบแน่นที่ภายนอกใช้การผสมผสานระหว่างน้ำแข็งแห้ง/เอทานอลแล้วเตรียมนี้เช่นกัน สามารถตั้งค่าชั้น 4 ° C.

ศูนย์ vials บนชั้นได้ ตำแหน่งนี้เป็นสิ่งสำคัญเพื่อให้จาน stoppering สามารถกดบนจุกต่อตรึงแห้งเท่า ๆ กัน

โดยใช้การควบคุมด้วยตนเอง หรือเตรียมโปรแกรม ตรึงตัวอย่างจนถึง-40 องศาเซลเซียส ขั้นตอนนี้ควรใช้เวลาประมาณ 30-60 นาที และจะมากขึ้นเครื่องมือ หากสามารถควบคุมอัตราของจุดเยือกแข็ง แล้วลดลง 1 องศาเซลเซียสต่อนาทีเป็นอัตราปฏิบัติ เมื่ออุณหภูมิที่ตัวอย่างการเข้าถึง พวกเขาควรจะมองเห็นแช่ (ล้างของเหลวเปิดทึบ และ skim นมปรากฏแข็ง)

ตัวอย่างนั่งที่-40 ° C สำหรับ 1 ชั่วโมงให้แช่แข็งทำให้ Vials ที่คลัสเตอร์อาจตรึงช้ากว่าด้านนอก

เปิดปั๊มสุญญากาศ ภายใน 10-20 นาที การดูดควรจะต่ำกว่า 200 millitorr (mtorr) ขึ้นอยู่กับอุปกรณ์ อาจรายงานใน mtorr, mbar ปาสกาล หรือ "นิ้ว Hg" ความดันบนเกจสุญญากาศ สำหรับการอ้างอิง 100 mtorr = 0.133 mbar = 13.3 ปาสกาล = 29.9 " Hg = 0.000132 atm = 99.99% ดูด

เมื่อดูดอยู่ด้านล่าง 200 mtorr เพิ่มอุณหภูมิของชั้นในแห้งหลัก ขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับการระเหิดของน้ำ อุณหภูมิของชั้นกลาง lyophilization ขึ้นได้ ซูโครส เก็บอุณหภูมิชั้นที่-25 องศาเซลเซียส 18 รีเอเจนต์หรือจุลินทรีย์ตรึงแห้งบัฟเฟอร์ ชั้นได้สูงถึงพี่ ๆ กลุ่มองศาเซลเซียส ในกรณีใดๆ ความแตกต่างของอุณหภูมิระหว่างชั้นน้ำแข็ง/เครื่องควบแน่นกับดักยิ่ง ยิ่งมีประสิทธิภาพกระบวนการหลักการอบแห้งจะ

ถ้าละลายตัวอย่างเกิดขึ้น แล้วอาจจำเป็นต้องกำหนดอุณหภูมิชั้น empirically วิธีปฏิบัติต้องเกี่ยวข้องกับตัวอย่างของสื่อ lyoprotective วางไว้บนชั้นวาง และแบบเพิ่มหน่วยลดอุณหภูมิทุก 15 นาที ในบางกรณีตัวอย่างการตอบสนอง ภายใต้สุญญากาศกับดักเย็น ตัวอย่างของคุณจะปลอดภัย และยังคงแช่แข็ง นี้คือ วิธีการปฏิบัติ และไม่จำเป็นต้องมีประสิทธิภาพสูงสุดหลักการอบแห้งอุณหภูมิ แต่ควรทำงานอย่างดีพอ

หลักแห้งเป็นขั้นตอนที่ยาวที่สุดของหยุดกระบวนการอบแห้ง ความคิดคือการ เก็บตัวอย่างหนาวกว่าเครื่องควบแน่น (หรือกับดักน้ำแข็ง) แต่ยังคงความอบอุ่นเพียงพอเพื่อให้น้ำ sublimes อย่างรวดเร็ว สามารถยกให้อุณหภูมิของชั้นเหนืออุณหภูมิละลายตราบใดที่การระเหิดการประมวลเอาความร้อนที่ไหลลงอย่างรวดเร็วเพียงพอเพื่อป้องกันการละลาย และตัวอย่างยุบ (ที่เมตริกซ์อักษรถ้ำ) เวลาสำหรับการอบแห้งหลักจะยังขึ้นอยู่ตามปริมาตรของตัวอย่าง สำหรับแบคทีเรีย ตัวอย่างแทบไม่ต้องมีขนาดใหญ่ และโดยทั่วไปคือ 0.25-05 ml จำนวนตัวอย่าง (10-20) ในชั้นวางไดร์เป่าจำกัดสามารถจะแล้วเสร็จในเพียงไม่กี่ชั่วโมง เครื่องเป่าโหลดเต็ม ด้วยตัวอย่างหลายร้อยตัวจะใช้เวลานาน ปลอดภัย หลักการอบแห้งระยะที่ค้างคืนควรทำ แต่ทดสอบก่อนนี้ก่อนที่คุณพยายามที่จะตรึง vials แห้งจำนวนมาก เป็นคู่มือมาตรฐาน ตรึงแห้งค้างคืน

ตัวอย่างยังประกอบด้วยความชื้นแห้งหลักต่อไปนี้ ยอดเป็นคุย แต่อยู่ระหว่าง 2 และ 4% ต้องสามารถลดระดับความชื้นนี้ และที่ทำได้ โดยสูบความร้อนเป็นตัวอย่างแห้งระยะรอง ระยะนี้เป็นสิ่งสำคัญสำหรับชีวิตระยะยาว แต่ค่อนข้าง สั้น ยาวนาน 1-2 ชั่วโมง อย่างไรก็ตาม ผ่านการอบแห้งของแบคทีเรียได้ผลดีเช่นกัน ครั้ง ตาม idiosyncrasies lyophilizer และตัวอย่างของคุณ เวลาเหมาะสำหรับอบแห้งรองที่ต้องการกำหนด experimentally ทั่วไป ยกชั้นอุณหภูมิ 20° c และแห้ง 2 ชั่วโมง

ด้วยสุญญากาศใน stopper vials ใช้จาน stoppering/กลไก การ ปล่อยสุญญากาศ เอา vials และเพิ่มเติม ความปลอดภัย bungs/จุก ยาง ด้วยฟอยล์ตราประทับใจคับ ควรเก็บ vials ที่ 4° C ในมืด

ทดสอบแบคทีเรียตรึงแห้งสำหรับชีวิตเมื่อเทียบกับวัฒนธรรมเดิม (ดูลิงค์) นอกจากนี้ ตรวจสอบเสถียรภาพ/ชีวิตวัฒนธรรมหยุดแห้ง โดยทดสอบที่ 30, 90, 180 และ 365 วัน โพรโทคอลที่ดีจะได้เกือบ 100% ทำงานเซลล์ สิ่งที่อยู่เหนือ 50% กำลังยอมรับหลายแล็บ Skim นมจะได้ 10-20% อย่างไรก็ตาม, %ได้หลังจากแช่แข็งแห้งไม่สำคัญเท่าทำงานต่อไปนี้จัดเก็บหมายเลข ถ้าชีวิตเริ่มจะลดลงอย่างรวดเร็ว โดยการล็อกหรือมากกว่าต่อเดือน ปรับเปลี่ยนโพรโทคอลคืออาจจำเป็น หมายเหตุบางสายพันธุ์ก็ยากมากที่จะตรึงแห้ง และไม่ ว่า อะไร เหล่านี้อาจตายปิดอย่างรวดเร็วต่อ lyophilization

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เปรียบและการเตรียมตัวเชื้อ แบคทีเรีย

โดยใช้เทคนิคการเล่นที่ดีขึ้นเปรียบ aseptic เซลล์ในวัฒนธรรมของเหลวหรือในแผ่นความร้อนจนกว่าทางวัฒนธรรมที่แข็งแกร่งสาหร่ายทะเลมีความหนาแน่นสูงหรือของเหลววัฒนธรรมอยู่ในช่วงต้นหยุดนิ่งอยู่กับที่ ในการปฏิบัติแบบนี้จะได้รับวัฒนธรรมของการสั่นเกิดจากเชื้อแบคทีเรียที่พักค้างคืนหรือปล่อยให้เซลล์ขึ้นอยู่บนแผ่นสำหรับ 1-2 1-2 วัน สำหรับวัฒนธรรมสาหร่ายทะเลเซลล์ขึ้นอยู่บน slants (ท่อแก้ว)อาจจะมากขึ้นในทางปฏิบัติซึ่งความช่วยเหลือต่างๆยังคงถูกละเลยจากขั้นตอนที่ผลิตที่ด้านล่าง แต่ถึงอย่างไรก็ตามทางวัฒนธรรมผสมน้ำยาทำความสะอาดตามปกติให้ผลตอบแทนจำนวนมากของเซลล์ได้.

สำหรับผสมน้ำยาทำความสะอาดวัฒนธรรมเซลล์ที่มีน้ำซุป centrifuged วัฒนธรรมจะถูกลบออกไปและเม็ดที่ถูกพักชั่วคราวในปริมาณเท่ากับที่มีขนาดกลาง lyophilization เราขอแนะนำให้คุณยาซัด 18 หรือจุลินทรีย์ที่เป่าผมแห้งแช่แข็งบัฟเฟอร์แม้ว่านมพร่องและซูโครสจะทำงาน สำหรับวัฒนธรรมสาหร่ายทะเลน้ำท่วมแผ่น/ท่อดูดฝุ่นที่มี 5-10 5-10 5-10 มล.ขนาดกลาง lyophilization การใช้หลอดเล็กสำหรับดูดของเหลวฆ่าเชื้อขวดนมที่ติดตั้งแบบฝังขนาดกลางที่เหนืออาณานิคมที่เพื่อขจัดสิ่งสกปรกเซลล์ บริการรับส่งบริการข้อมูลของสถานีฐานระบบกันสะเทือนเข้ากับท่อดูดขวดนมปราศจากเชื้อได้ที่ เราขอแนะนำให้จำนวนเซลล์ที่จะดำเนินการซึ่งสามารถนำไปเปรียบเทียบกับเซลล์ต่อไปนี้แช่แข็งทำให้แห้งเจือจางแบบเรียบง่ายที่เป็นโปรโตคอลการสูญพันธุ์มีให้ที่นี่.

aliquot ระบบกันสะเทือนแบบเซลล์ที่เข้าไปในท่อดูดหรือ vials ฆ่าเชื้อขวดนม เฉพาะ 250-500 μl เป็นสิ่งจำเป็นต่อขวดเป็นแห่งนี้ประมาณ 108 แบคทีเรีย ที่แยกตัวยึดบนท่อเสียบปลั๊ก vials หรือแก้ผ้าขนสัตว์ที่พร้อมด้วยกระจก vials พร้อมด้วยตัวยึดแยกในทางเทคนิคเปิดให้บริการไปในอากาศทำให้ที่ความเสี่ยงต่อการปนเปื้อนในทางปฏิบัติเราไม่พบนี้เพื่อจะเป็นปัญหาอย่างหนึ่ง หากขวดที่มีขึ้นในหนึ่งพันล้านแบคทีเรียหนึ่งหรือสองจุลชีพอาจไม่มีความหมายเมื่อกลายเป็นวัฒนธรรมที่มี rehydrated และลาย หากมีความกลัวของการปนเปื้อนหรือการปนเปื้อนในแล้วผ้าขนสัตว์กระจกหรือผ้าฝ้ายสามารถนำไปวางไว้ใต้จุกปิดเพื่อป้องกันไม่ให้สิ่งสกปรก.
ทำให้แห้งแช่แข็ง - ชั้น lyophilizer

เปิด lyophilizer และเริ่มคอนเดนเซอร์นี้ หากมีคอนเดนเซอร์ ภายนอก โดยใช้การผสมผสานน้ำแข็ง/เอทานอลให้แห้งแล้วเตรียมความพร้อมนี้เป็นอย่างดี ชั้นที่สามารถตั้งค่า 4 ° C

ศูนย์กลาง vials อยู่บนชั้นวางได้ การวางตำแหน่งนี้มีความสำคัญมากว่าแผ่น stoppering สามารถกดปุ่มบนตัวยึดต่อไปนี้ผมแห้งแช่แข็ง.

ทั้งการใช้การควบคุมด้วยตนเองหรือตั้งโปรแกรมแช่แข็งตัวอย่างที่ลงไปอย่างทั่วถึง 40 ° Cขั้นตอนนี้จะใช้เวลาเดินทางประมาณ 30-60 30-60 30-60 และใช้เวลาเดินทางไม่กี่นาทีเป็นอย่างมากขึ้นอยู่กับเครื่องมือที่ หากอัตราดอกเบี้ยที่การแช่แข็งสามารถควบคุมได้แล้วส่งผลให้ของ C 1 °ต่อนาทีมีอัตราที่ใช้งานได้จริง เมื่อตัวอย่างจะมี อุณหภูมิ จะได้รับอย่างเห็นได้ชัดแช่แข็ง(ล้างทึบแสงปิดผสมน้ำยาทำความสะอาดและนมพร่องจะปรากฏขึ้นที่แข็ง)

อนุญาตให้ตัวอย่างที่นั่งอยู่กับ HR 40 ° C สำหรับ 1 เพื่อตรวจสอบให้แน่ใจว่าความหนาวเย็นให้เสร็จสมบูรณ์vials ที่ศูนย์กลางของกลุ่มที่อาจช้ากว่ามากกว่าผู้ที่อยู่ ภายนอก

เปิดปั๊มดูดฝุ่น. ภายใน 10-20 10-20 10-20 ใช้เวลาเดินทางไม่กี่นาทีเครื่องดูดฝุ่นที่ควรจะต้องอยู่ ภายใต้ 200 millitorr ( mtorr ) ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับอุปกรณ์ที่อาจมีการรายงานความดันใน mBar mtorr ปาสคาลหรือ"นิ้ว HG "ในวัดดูดฝุ่น สำหรับการอ้างอิงเครื่องเอทีเอ็ม 100 mtorr = 0.133 mBar = 13.3 ปาสคาล= 29.9 " HG = 0.000132 = 99.99% เครื่องดูดฝุ่น.

เมื่อเครื่องดูดฝุ่นที่อยู่ด้านล่าง 200 mtorr เพิ่ม อุณหภูมิ ของไหล่ทวีปที่สำหรับหลักการเป่าผมแห้งที่เชื่อมโยงกับควันน้ำ อุณหภูมิ ของไหล่ทวีปที่มีขึ้นอยู่กับขนาดกลาง lyophilization ได้ สำหรับซูโครสรักษา อุณหภูมิ ไหล่ทวีปที่ - 25 ° C สำหรับยาซัด 18 หรือจุลินทรีย์บัฟเฟอร์สำหรับการเป่าผมแห้งแช่แข็งไหล่ทวีปที่สามารถเป็นที่สูง - 15 ° C ในกรณีใดๆที่มากกว่าความแตกต่างได้ใน อุณหภูมิ ระหว่างชั้นที่ Trap และคอนเดนเซอร์/น้ำแข็งที่ในกระบวนการผลิตมี ประสิทธิภาพ มากขึ้นหลักทำให้แห้งจะได้

หากละลายของตัวอย่างที่เกิดขึ้นแล้วและอาจจำเป็นต้องตรวจสอบ อุณหภูมิ ไหล่ทวีปที่เชิงประจักษ์วิธีการที่ใช้งานได้จริงในการดำเนินการนี้มีส่วนเกี่ยวข้องกับการวางตัวอย่างที่มีขนาดกลาง lyoprotective ไว้บนชั้นวางและ supervisors แบบเดิมช่วยลด อุณหภูมิ ได้ทุกๆ 15 นาที ที่จุดใดจุดหนึ่งซึ่งตัวอย่างที่หยุดทำงาน ตามดูดฝุ่นพร้อมด้วยกับดักเย็นตัวอย่างของคุณจะได้รับความ ปลอดภัย และจะยังคงอยู่แช่แข็ง โรงแรมแห่งนี้คือวิธีการที่ใช้งานได้จริงและแน่นอนว่าไม่จำเป็นต้องมี อุณหภูมิ มากที่สุดหลักการเป่าผมแห้งอย่างมี ประสิทธิภาพแต่ก็ควรจะทำงานได้เป็นอย่างดีไม่พอ

หลักการเป่าผมแห้งเป็นระยะยาวที่สุดของกระบวนการการเป่าผมแห้งแช่แข็งได้ แนวคิดที่จะทำให้ตัวอย่างที่หนาวเย็นลงกว่าคอนเดนเซอร์(หรือ Trap น้ำแข็ง)แต่ยังพออุ่นให้น้ำ sublimes อย่างรวดเร็วอุณหภูมิ ของชั้นสามารถยกขึ้นมาสูงกว่าที่ค่อยๆเลือนหาย อุณหภูมิ เท่าที่กลั่นกรองการจะขจัดความร้อนไหลเข้าไปในตัวอย่างมากพอได้อย่างรวดเร็วเพื่อป้องกันไม่ให้ละลายและลิ้มลองยุบ(ที่ Matrix Storage Technology ได้อย่างแท้จริงถ้ำใน) เวลาที่ได้สำหรับหลักการทำให้แห้งจะขึ้นอยู่กับระดับเสียงของตัวอย่างที่ยัง สำหรับตัวอย่างเชื้อแบคทีเรียแทบจะไม่จำเป็นต้องมีขนาดใหญ่และโดยทั่วไปแล้วมี 0.25 ไปที่ 05 มล. จำนวนที่จำกัดที่ของตัวอย่าง( 10-20 10-20 10-20 )ในที่เป่าผมชั้นที่สามารถทำให้เสร็จสมบูรณ์ได้ในระยะเวลาเพียงสองชั่วโมง ไดร์เป่าผมโหลดอย่างเต็มที่มีหลายร้อยตัวอย่างจะใช้เวลานานกว่าปกติ ระยะเวลาการเป่าผมแห้งได้อย่าง ปลอดภัย หลักซึ่งเป็นพักค้างคืนจะทำงานแต่การทดสอบนี้เป็นครั้งแรกก่อนที่คุณจะพยายามตรึงหมายเลขขนาดใหญ่แห้ง vials เป็นมัคคุเทศก์แบบมาตรฐานที่พักค้างคืนแห้งแช่แข็ง.

ตัวอย่างต่อไปนี้ยังมีความชุ่มชื้นหลักการเป่าผมแห้ง จำนวนเงินที่เป็นข้อถกเถียงกันคือมีแต่ที่ไหนสักแห่งระหว่าง 2 และ 4% ระดับความชุ่มชื้นนี้ความต้องการจะลดลงและที่ทำได้โดยการปั๊มความร้อนในตัวอย่างนี้ในระหว่างขั้นตอนการเป่าผมแห้งได้ ช่วงนี้เป็นระยะสั้นค่อนข้างใช้งานได้ยาวนาน 1 ถึง 2 ชั่วโมงแต่ที่สำคัญสำหรับความอยู่รอดระยะยาว อย่างไรก็ตามในช่วงการเป่าผมแห้งของแบคทีเรียที่สามารถจะเป็นการเอาเปรียบเป็นอย่างดีอีกครั้งที่ใช้อับอายของ lyophilizer ตัวอย่างของคุณและเวลาที่เหมาะสมสำหรับรองทำให้แห้งจะต้องกำหนดทดลอง โดยทั่วไปแล้วยกระดับ อุณหภูมิ บนชั้นที่ 20 ° C และแห้งสำหรับ 2 ชั่วโมง

พร้อมด้วยเครื่องดูดฝุ่นให้เข้าที่จุกปิดที่ vials โดยใช้แผ่น stoppering /กลไก วางเครื่องดูดฝุ่นให้ถอด vials ได้และยังมีระบบรักษาความ ปลอดภัย ยาง bungs /ตัวยึดที่พร้อมด้วยแผ่นฟอยล์จีบแมวน้ำ เป็นสิ่งที่ดีที่สุดในการจัดเก็บ vials ที่ 4 ° C ในที่มืด.

การทดสอบแบคทีเรียแห้งแช่แข็งสำหรับความอยู่รอดเมื่อเทียบกับแบบเดิมวัฒนธรรม(ดูที่)ที่ นอกจากนี้ตรวจสอบความมั่นคงที่/ความอยู่รอดของแห้งแช่แข็งที่วัฒนธรรมโดยการทดสอบที่ 3090180 และ 365 วัน โปรโตคอลที่ดีจะให้ผลตอบแทนเกือบ 100% เซลล์ได้อะไรมากกว่า 50% ได้รับการพิจารณาให้เป็นที่ยอมรับของห้องแล็บจำนวนมาก นมพร่องจะยอมจำนน 10-20 10-20 10-20% แต่ถึงอย่างไรก็ตาม%แก้ปัญหาหลังจากแช่แข็งทำให้แห้งไม่ใช่สิ่งที่สำคัญที่สุดที่จะเป็นหมายเลขที่ได้การจัดเก็บข้อมูลต่อไปนี้: หากความอยู่รอดจะเริ่มลดลงอย่างรวดเร็วโดยล็อกอินเข้าสู่หรือมากกว่าต่อเดือนแล้วการปรับเปลี่ยนโปรโตคอลที่มีความจำเป็นอาจจะ บันทึกไว้ด้วยว่าพันธุ์บางอย่างจะเรียบง่ายเป็นอย่างมากยากที่จะแช่แข็งแห้งและไม่มีเรื่องอะไรสิ่งเหล่านี้อาจจะตายปิด lyophilization ได้อย่างรวดเร็วต่อไปนี้: