Quantitative real-time PCR The mRNA

Quantitative real-time PCR
The mRNA levels in each sample were measured on the Applied Biosystems Instrument in a final volume of 20 μl. Each reaction was performed using reagents from the SYBR Green Quantitative RT-PCR kit (Aldrich, St. Louis, MO USA), with 0.3 μM of primer, 20 U of RNasin RNase inhibitor (Promega, Madison, WI USA), and 10 ng total RNA. Amplification consisted of 50 cycles of denaturation at 94°C for 10 seconds, annealing at 50°C - 60°C, depending on the primer pair, for 10 seconds, and extension at 72°C for 40 seconds. Appendix A. shows the sequence of primer pairs (purchased from Operon, Hawthorne, NY USA) and the sources for their design. . After the processes were completed, the real-time PCR results were automatically reported by Applied Biosystme software version 7500 and analyzed by relative quantification method (comparative Ct method).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ ระดับ mRNA ในแต่ละตัวอย่างที่วัดบนหน้าปัด Biosystems ใช้ในปริมาตรสุดท้ายของ 20 μl ปฏิกิริยาแต่ละที่ดำเนินการด้วย reagents จากชุด SYBR Green เชิงปริมาณ RT-PCR (Aldrich, St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา), μM 0.3 พื้น U RNasin RNase 20 ผล (Promega เมดิสัน WI สหรัฐอเมริกา), และ 10 ng รวมอาร์เอ็นเอ ขยายประกอบด้วย 50 รอบของ denaturation ที่ 94° C 10 วินาที การอบเหนียวที่ 50° C - 60° C ขึ้นอยู่กับคู่รองพื้น 10 วินาที และ 72 ° C 40 วินาที ภาคผนวก A. แสดงลำดับของคู่รองพื้น (ซื้อจาก Operon, Hawthorne, NY USA) และแหล่งมาสำหรับการออกแบบ . หลังจากเสร็จสิ้นกระบวนการ ผล PCR แบบเรียลไทม์ได้รายงาน โดยใช้ Biosystme ซอฟต์แวร์รุ่น 7500 โดยอัตโนมัติ และวิเคราะห์ โดยวิธีการนับญาติ (เปรียบเทียบ Ct วิธี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เชิงปริมาณแบบ real-time PCR
ระดับ mRNA ในแต่ละตัวอย่างถูกวัดบนหน้าปัดแอพพลายด์ในปริมาณสุดท้ายของ 20 ไมโครลิตร ปฏิกิริยาแต่ละคนได้ดำเนินการโดยใช้น้ำยาจาก SYBR สีเขียวเชิงปริมาณชุด RT-PCR (ดิช, เซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา) กับ 0.3 ไมครอนของไพร, 20 U ของ RNasin ยับยั้ง RNase (Promega เมดิสันวิสคอนซินสหรัฐอเมริกา) และ 10 นาโน อาร์เอ็นเอทั้งหมด ขยายประกอบด้วย 50 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94 ° C เป็นเวลา 10 วินาที, การอบที่ 50 ° C - 60 ° C, ขึ้นอยู่กับคู่ไพรเมอร์, 10 วินาทีและนามสกุลที่ 72 ° C เป็นเวลา 40 วินาที ภาคผนวก A แสดงลำดับของคู่ไพรเมอร์ (ซื้อจาก Operon, ฮอว์ ธ , นิวยอร์กประเทศสหรัฐอเมริกา) และแหล่งที่มาสำหรับการออกแบบของพวกเขา . หลังจากกระบวนการเสร็จสมบูรณ์แบบ real-time PCR ผลที่ได้รับรายงานโดยอัตโนมัติโดยประยุกต์ Biosystme ซอฟต์แวร์รุ่น 7500 และวิเคราะห์โดยวิธีวิเคราะห์ที่ญาติ (วิธีการเปรียบเทียบกะรัต)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เชิงปริมาณแบบ PCR
ของระดับในแต่ละตัวอย่างถูกวัดใน Applied Biosystems เรียบเรียงในเล่มสุดท้ายของ 20 μ L แต่ละปฏิกิริยาการใช้สารเคมีจาก SYBR กรีนปริมาณ 4 ชุด ( Aldrich St . Louis , MO USA ) , 0.3 μ M ของไพรเมอร์ 20 U ของ rnasin inhibitor ( promega เลส , Madison , WI , USA ) และ 10 นาโนกรัมรวม RNAการเพิ่มจำนวน 50 รอบ ( ที่ 94 ° C เป็นเวลา 10 วินาที annealing ที่ 50 ° C - 60 ° C ขึ้นอยู่กับไพรเมอร์คู่ , 10 วินาที และนามสกุลที่ 72 องศา C นาน 40 วินาที ภาคผนวก ก. แสดงลำดับของไพรเมอร์คู่ ( ซื้อมาจากโอเปอร์รอน Hawthorne , NY , USA ) และแหล่งข้อมูลสำหรับการออกแบบของพวกเขา หลังจากกระบวนการเสร็จสมบูรณ์ผล PCR แบบเรียลไทม์ได้โดยอัตโนมัติรายงานโดยประยุกต์ biosystme ซอฟแวร์รุ่น 7500 และวิเคราะห์โดยวิธีปริมาณสัมพัทธ์ ( วิธี CT
เปรียบเทียบ )