PCR products were cleaned by precip

PCR products were cleaned by precipitation before use in sequencing reaction and was quantified using NanoDrop ND-1000 (Wilmington, DE, USA). Sequencing reactions consisted of 5.5μl of nuclease-free water, 0.5μl of (40 ng/μl) 685R primer and 1μl of (100 ng/μl) of DNA template, BD terminator (ABI) and were run with an Eppendorf Master Cycler Gradient 22331 (Eppendorf, Foster City, CA, USA) using the following thermocycling protocol: an initial denaturation at 96 °C for 1 minute followed by 25 cycles of 96 °C for 10 seconds, 50 °C for 5 seconds and 60 °C for 4 minutes, with annealing period of 10 seconds during the final cycle. The resulting reaction products were analyzed with 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) and the resulting sequences edited using Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor MI, USA). BLAST searches were used to identify the nearest neighbor actinomycete sequences from Genbank and these were aligned with the newly generated sequences using CLUSTAL W (Thompson et al., 1994). The alignment was then processed with the DNADIST program of PHYLIP to generate a distance matrix, which was used as an input file for DOTUR (Schloss et al., 2005). Using this program allowed us to group sequences into Operational Taxonomic Units (OTUs) dependent on different sequence similarity cutoffs. To discriminate between sequences of the same species a 97% cutoff was used and a 95% cutoff was used to distinguish between different genera of actinomycetes. We were then able to estimate the number of species and genus of actinomycetes observed in each individual site and among the different species of sponges with the bias-corrected Chao1 estimator. In addition, DOTUR allowed us to compare the Simpson, and Shannon index. With these tools we were able to construct a phylogenetic tree with MEGA 4.0 (Gene Codes Coporation, Ann Arbor, MI, USA) by grouping sequences that were

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ผลิตภัณฑ์ PCR ได้ถูกล้างไวรัส โดยฝนก่อนที่จะใช้ในปฏิกิริยาลำดับ และถูก quantified ใช้ NanoDrop ND-1000 (วิลมิ DE สหรัฐอเมริกา) ลำดับปฏิกิริยาประกอบด้วย 5.5μl น้ำฟรี nuclease, 0.5μl พื้น 685R (40 ng/μl) และ 1μl (100 ng/μl) ของดีเอ็นเอต้นแบบ BD เทอร์มิเนเตอร์ (ABI) และถูกเรียกใช้ ด้วยการ Eppendorf หลัก Cycler ไล่ระดับ 22331 (Eppendorf ฟอสเตอร์ City, CA, USA) ใช้โพรโทคอล thermocycling ต่อไปนี้: denaturation เป็นเริ่มต้นที่ 96 ° C เวลา 1 นาทีตาม ด้วยรอบ 25 ของ 96 ° C 10 วินาที, 50 ° C 5 วินาที และ 60 ° C สำหรับ 4 นาที มีการอบเหนียวเวลา 10 วินาทีในระหว่างรอบสุดท้าย ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาได้ถูกวิเคราะห์วิเคราะห์พันธุกรรม 3130xl (Biosystems ใช้ ฟอสเตอร์ City, CA, USA) และลำดับที่ได้แก้ไขโดยการใช้ Sequencher (ยีนรหัส บริษัท Ann Arbor MI สหรัฐอเมริกา) ค้นหาระเบิดที่ใช้ในการระบุลำดับ actinomycete เพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุดจาก Genbank และเหล่านี้ได้สอดคล้องกับลำดับที่เพิ่งสร้างขึ้นโดยใช้ CLUSTAL W (ทอมป์สันและ al., 1994) จัดตำแหน่งจากนั้นประมวลผล ด้วยโปรแกรม DNADIST ของ PHYLIP เพื่อสร้างเมทริกซ์ระยะ ซึ่งถูกใช้เป็นแฟ้มอินพุตสำหรับ DOTUR (ลอทท์ et al., 2005) ใช้โปรแกรมนี้สามารถเราลำดับกลุ่มเป็นการดำเนินงานหน่วยอนุกรมวิธาน (OTUs) ขึ้นอยู่กับ cutoffs ลำดับที่แตกต่างความคล้ายคลึงกัน ถือเขาถือเราระหว่างลำดับของชนิดเดียวกันที่ใช้ 97% ตัดยอดและตัดยอด 95% ถูกใช้เพื่อแยกความแตกต่างระหว่างสกุลอื่นของ actinomycetes เราเคยแล้วได้ประเมินจำนวนชนิดและสกุลของ actinomycetes สังเกต ในแต่ละไซต์แต่ละราย และ ระหว่างต่างชนิดของฟองน้ำ มีประมาณ Chao1 แก้ไขความโน้มเอียง นอกจากนี้ DOTUR ให้เราเปรียบเทียบซิมป์สัน และแชนนอนดัชนี เครื่องมือเหล่านี้เราไม่สามารถสร้างต้นไม้ phylogenetic กับร็อค 4.0 (ยีนรหัส Coporation, Ann Arbor, MI สหรัฐอเมริกา) โดยจัดกลุ่มลำดับที่ < 1% เหมือนกันและใกล้เคียงเข้าร่วมวิธีการวิเคราะห์เริ่มต้นระบบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ได้รับการทำความสะอาดโดยการตกตะกอนก่อนที่จะใช้ในการทำปฏิกิริยาลำดับและได้รับการวัดโดยใช้ NanoDrop ND-1000 (Wilmington, DE, USA) ปฏิกิริยาลำดับประกอบด้วย5.5μlน้ำ nuclease ฟรี0.5μlของ (40 ng / ไมโครลิตร) 685R สีรองพื้นและ1μlของ (100 ng / ไมโครลิตร) ของแม่ดีเอ็นเอ, เทอร์มิ BD (ABI) และได้รับการทำงานกับ Eppendorf โท Cycler ไล่โทนสี 22331 (Eppendorf, ฟอสเตอร์ซิตี้, CA, USA) โดยใช้โปรโตคอลเทอร์โมต่อไปนี้: denaturation เริ่มต้นที่ 96 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีตามด้วย 25 รอบจาก 96 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 วินาที, 50 ° C เป็นเวลา 5 วินาทีและ 60 องศาเซลเซียส 4 นาทีโดยมีระยะเวลาการหลอม 10 วินาทีในระหว่างรอบสุดท้าย ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาผลที่ได้มาวิเคราะห์ทางพันธุกรรมกับ 3130xl วิเคราะห์ (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี้, CA, USA) และลำดับที่เกิดขึ้นแก้ไขได้โดยใช้ SEQUENCHER (ยีนรหัสคอร์ปอเรชั่น Ann Arbor MI, USA) ค้นหาระเบิดถูกนำมาใช้เพื่อระบุลำดับเพื่อนบ้านใกล้ที่สุด actinomycete จาก Genbank และสิ่งเหล่านี้สอดคล้องกับลำดับที่สร้างขึ้นใหม่โดยใช้ Clustal วัตต์ (ธ อมป์สัน et al., 1994) การจัดตำแหน่งที่ได้รับการประมวลผลแล้วกับโปรแกรม DNADIST ของ PHYLIP เพื่อสร้างเมทริกซ์ทางไกลซึ่งถูกใช้เป็นแฟ้มข้อมูลสำหรับ DOTUR (Schloss et al., 2005) การใช้โปรแกรมนี้ช่วยให้เราสามารถลำดับกลุ่มเป็นหน่วยอนุกรมวิธานการดำเนินงาน (Otus) ขึ้นอยู่กับการแต่งตัวเหมือนลำดับที่แตกต่างกัน เพื่อให้เห็นความแตกต่างระหว่างลำดับของสายพันธุ์เดียวกันตัด 97% ถูกนำมาใช้และตัด 95% ถูกใช้ในการแยกแยะความแตกต่างระหว่างจำพวกที่แตกต่างกันของแอคติโนมัย เราก็สามารถที่จะประเมินจำนวนของชนิดและประเภทของ actinomycetes สังเกตในแต่ละเว็บไซต์ของแต่ละบุคคลและในหมู่สายพันธุ์ที่แตกต่างกันของฟองน้ำที่มีอคติการแก้ไขประมาณ Chao1 นอกจากนี้ DOTUR ให้เราเพื่อเปรียบเทียบซิมป์สันและดัชนีแชนนอน ด้วยเครื่องมือเหล่านี้เราสามารถที่จะสร้างต้นไม้สายวิวัฒนาการกับ MEGA 4.0 (ยีนรหัส Coporation, Ann Arbor, MI, USA) โดยการจัดกลุ่มลำดับที่มี <1% เหมือนกันเข้าด้วยกันและใช้วิธีการเข้าร่วมเพื่อนบ้านที่มีการวิเคราะห์บูต

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกล้างโดยการตกตะกอนก่อนใช้ในปฏิกิริยาและปริมาณการใช้ nanodrop nd-1000 ( Wilmington , DE , USA ) ลำดับปฏิกิริยาประกอบด้วยμ 5.5 ลิตรนิวเคลียสน้ำฟรี , μ 0.5 ลิตร ( 40 กรัม / μ L ) 685r ไพรเมอร์ 1 μลิตร ( 100 ng / μ L ) ของแม่แบบดีเอ็นเอ BD Terminator ( ABI ) และถูกเรียกใช้กับเพนดอร์ฟอาจารย์บ้าลาด 22331 ( เพนดอร์ฟ ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา ) โดยใช้โปรโตคอลดังต่อไปนี้ : ผื่นแดง ( เริ่มต้นที่ 96 ° C เป็นเวลา 1 นาที ตามด้วย 25 รอบ 96 ° C เป็นเวลา 10 วินาที , 50 ° C เป็นเวลา 5 วินาที และ 60 ° C เป็นเวลา 4 นาที กับการอบระยะเวลา 10 วินาที ในรอบสุดท้าย ผลปฏิกิริยาผลิตภัณฑ์วิเคราะห์ด้วย 3130xl พันธุกรรมวิเคราะห์ ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา ) และลำดับให้แก้ไขโดยใช้ sequencher ( รหัสยีน Corporation , Ann Arbor MI , สหรัฐอเมริกา ) ค้นหาระเบิดถูกใช้เพื่อระบุลำดับจากเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุดและแอคติโนมัยซีทขนาดเหล่านี้สอดคล้องกับลำดับการสร้างขึ้นใหม่ clustal W ( Thompson et al . , 1994 ) ตำแหน่งแล้ว ประมวลผลด้วยโปรแกรม dnadist phylip สร้างระยะห่างเมทริกซ์ซึ่งใช้เป็น input file dotur ( ปราสาท et al . , 2005 ) การใช้โปรแกรมนี้ทำให้เราเป็นหน่วยปฏิบัติการกลุ่มลำดับอนุกรมวิธาน ( ใน ) ขึ้นอยู่กับลำดับต่าง ความเหมือน cutoffs . ที่จะแยกแยะระหว่างลำดับของสายพันธุ์เดียวกัน 97% นี้ถูกใช้และ 95% ตัวถูกใช้เพื่อแยกความแตกต่างระหว่างสกุลต่าง ๆ ของแอคติโนมัยซีส .เราจึงสามารถประมาณการจำนวนของชนิดและสกุลด้วยกัน สังเกตในแต่ละเว็บไซต์แต่ละบุคคลและแตกต่างกันชนิดของฟองน้ำกับอคติการแก้ไข chao1 ประเมินราคา นอกจากนี้ dotur ให้เราเปรียบเทียบ ซิมป์สัน และ แชนน่อน ดัชนี เครื่องมือเหล่านี้เราสามารถที่จะสร้าง phylogenetic ต้นไม้กับร็อค 4.0 ( รหัสยีน คอร์ปอเรชั่น แอนน์อาร์เบอร์ มาสหรัฐอเมริกา ) โดยการจัดกลุ่มลำดับที่ < 1 % เหมือนกัน และใช้วิธีบูตสแตรปเพื่อนบ้านร่วมกับการวิเคราะห์ .