The information about two sets of primers for bovine and porcine
used for PCR amplification is listed in Table 1. These primers
were published by Tartaglia et al. (1998) and Lahiff et al. (2001)
for bovine and porcine DNA, respectively. PCR amplification was
carried out using a master thermal cycler (Eppendorf, Germany).
The 20-ll reaction mixture was prepared in a PCR tube with 2 ll
of 10 PCR buffer (CinnaGen Co, Tehran, Iran), 0.2 mM of deoxyribonucleoside
triphosphates (dNTPs) (CinnaGen Co, Iran), 1.5 mM
MgCl2 (CinnaGen Co, Iran), 0.05 units of Taq DNA polymerase
(CinnaGen Co, Iran), 0.5 lM each of forward and reverse primers
listed in Table 1 (Eurofins MWG Operon, Germany), 10–100 ng of
DNA template, and nuclease-free water to adjust the volume
(CinnaGen Co, Iran).
The PCR program used for amplification of the target genes is as
follows: initial denaturation at 94 C for 4 min followed by 35 cycles
of denaturation at 94 C for 30 s, annealing at 58 C for 40 s, and
extension at 72 C for 30 s. Then final extension was conducted at
72 C for 5 min. The amplified products of PCR were analyzed using
2% agarose gel in TBE (Tris–borate–ethylenediaminetetraacetic
acid) 0.5 buffer stained with DNA safe stain (CinnaGen Co, Iran)
as a visualizing agent and run for 45 min at 100 V.
ข้อมูลเกี่ยวกับสองชุดของไพรเมอร์สำหรับวัวและหมู
ที่ใช้สำหรับการขยาย PCR แสดงไว้ในตารางที่ 1 ไพรเมอร์เหล่านี้
ถูกตีพิมพ์โดย Tartaglia et al, (1998) และ Lahiff et al, (2001)
สำหรับวัวหมูและ DNA ตามลำดับ ขยาย PCR ถูก
ดำเนินการโดยใช้ต้นแบบ Cycler ความร้อน (Eppendorf, เยอรมนี).
ผสมปฏิกิริยา 20 LL ถูกจัดทำขึ้นในหลอด PCR มี 2 LL
10? PCR บัฟเฟอร์ (CinnaGen Co, เตหะรานประเทศอิหร่าน) 0.2 มม deoxyribonucleoside
triphosphates (dNTPs) (CinnaGen Co, อิหร่าน), 1.5 มิลลิ
MgCl2 (CinnaGen Co, อิหร่าน), 0.05 หน่วย Taq DNA Polymerase
(CinnaGen Co, อิหร่าน), 0.5 LM แต่ละข้างหน้าและย้อนกลับไพรเมอร์
ที่ระบุไว้ในตารางที่ 1 (Eurofins MWG Operon, เยอรมนี), 10-100 NG ของ
แม่แบบดีเอ็นเอและน้ำ Nuclease ฟรีเพื่อปรับระดับเสียง
(CinnaGen Co, อิหร่าน).
โปรแกรม PCR ที่ใช้สำหรับการขยายของ ยีนเป้าหมายเป็น
ดังนี้ denaturation เริ่มต้นที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 นาทีตามด้วย 35 รอบ?
ของ denaturation ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, การอบที่ 58 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 40 วินาทีและ?
ส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที? จากนั้นขยายสุดท้ายได้ดำเนินการที่
72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ผลิตภัณฑ์ขยายของ PCR ถูกวิเคราะห์โดยใช้
เจล agarose 2% ใน TBE (Tris-borate-Ethylenediaminetetraacetic
Acid) 0.5? บัฟเฟอร์ย้อมด้วยดีเอ็นเอคราบปลอดภัย (CinnaGen Co, อิหร่าน)
เป็นตัวแทนแสดงผลและการทำงานเป็นเวลา 45 นาทีที่ 100 โวลต์
การแปล กรุณารอสักครู่..
