Nucleic acidsCalf thymus (CT) DNA,

Nucleic acids
Calf thymus (CT) DNA, salmon sperm DNA and E. coli DNA were
purchased from Sigma Aldrich and purified as described (Stacey
et al., 2003). High molecular weight polyinosinic:polycytidylic
acid (poly(I:C)) was obtained from Invivogen. DNA concentrations
were either estimated by A260, or PicoGreen assay (Life Technologies)
that specifically measures dsDNA


Electroporation
Chicken BMMs and HD-11 cells were electroporated with
various nucleic acids in 400 ml of growth medium at 260 V, 500 mF
using a BioRad GenePulser MX. Mouse BMMs were electroporated
at 240 V, 1000 mF. Cells were incubated at room temperature with
nucleic acid for 10 min prior to electroporation, unless otherwise
stated.



Assessment of IFN induction by real time PCR
Cells were electroporated at 3.75 107 cells/ml, transferred into
15 ml of medium and split into four plates. Plates were incubated
for 1, 2, 4 and 6 h followed by RNA extraction and cDNA synthesis
with oligo(dT) priming as described (Roberts et al., 2009). Control
reactions omitting reverse transcriptase were always performed to
ensure lack of DNA contamination, since bird type I IFNs are single
exon genes. Expression of IFN-a, -b, STING, cGAS and GAPDH
mRNAs in samples were determined by real time PCR using DCt
analysis as described (Roberts et al., 2009). Primer sequences
designed to the indicated transcripts were:



siRNA-mediated gene knock-down
Cells were harvested and resuspended at 2.5 107 cells/ml.
siRNA against target or control genes (15 ml of 1 M siRNA) were
mixed with 400 ml of cells, incubated at room temperature for 5 min
and then electroporated as per Section 2.3. Cells were then washed
146 N. Vitak et al. / Developmental and Comparative Immunology 59 (2016) 145e152
with RPMI medium and incubated at 37
C for 24 h. To test induction
of type I IFNs cells were harvested and resuspended in
1.4 ml of RPMI, and 400 ml was electroporated with 3 mg of DNA or
the same volume of phosphate-buffered saline (PBS) or left untreated.
Cells were then plated in 2 ml of medium and incubated for
3.5 h at 37
C, followed by RNA extraction and cDNA synthesis.
Sequences of Stealth RNAi siRNA (Life Technologies) were:



MTT assay for viability
Cells were electroporated at 2.5 106 cells/ml and 100,000 cells
were then plated in quadruplicate in 96-well tissue culture plates
for viability measurement. Reduction of the tetrazolium dye MTT
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) to
an insoluble blue product was used as an indicator of cell viability
(Berridge and Tan, 1993). MTT was added to a final concentration
1 mg/ml, and cells were incubated for 1 h at 37
C. After incubation,
cells were solubilised overnight by adding an equal volume of 10%
Triton X-100 and 0.1 N HCl in isopropanol. Absorbance was
measured at 570 nm. To compensate for any cell number differences
between experiments, MTT assay data is presented normalised
to the control sample.




Flow cytometric analysis of cell death
Cells were electroporated at 1 106 cells in 375 ml of complete
RPMI-1640 with 25 mM HEPES and 25 ml of PBS containing nucleic
acid. Cells (300 ml) excluding floating cell debris generated by the
electrical pulse were rapidly transferred to 1.5 ml microfuge tubes
containing 950 ml of complete RPMI-1640 with 25 mM HEPES. For
DNA dose response, cells were incubated for 30 min at 37
C then a
final concentration of 1 mg/ml propidium iodide (PI) was added
prior to analysis by flow cytometry on a BD Accuri C6. For real-time
flow cytometry (Stacey et al., 2016), the 950 ml of complete RPMI-
1640 with 25 mM HEPES at 37
C or 4
C as indicated, was supplemented
with 1.5 mg PI prior to addition of cells. Cells were
maintained at 37
C on a heating block or in an ice/water bath, as
indicated, during analysis on a BD Accuri C6 flow cytometer.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

กรดนิวคลีอิกลูกต่อมไทมัส (CT) ดีเอ็นเอ แซลมอนสเปิร์มดีเอ็นเอและดีเอ็นเอของ E. coli ได้ซื้อจาก Sigma Aldrich และบริสุทธิ์เป็นอธิบาย (Staceyet al. 2003) Polyinosinic:polycytidylic น้ำหนักโมเลกุลสูงกรด (poly(I:C)) มาจาก Invivogen ความเข้มข้นของดีเอ็นเอมีการประเมิน โดย A260 หรือทดสอบ PicoGreen (ชีวิตเทคโนโลยี)โดยเฉพาะวัด dsDNA Electroporationไก่ BMMs และ HD 11 เซลล์ได้ electroporated ด้วยกรดนิวคลีอิกต่าง ๆ ในเชื้อที่ 260 V, 500 400 มล. mFใช้ MX GenePulser BioRad BMMs เมาส์ถูก electroporatedที่ 240 V, 1000 mF เซลล์ได้รับการกกที่อุณหภูมิห้องด้วยกรดนิวคลีอิกสำหรับ 10 นาทีก่อน electroporation เว้นแต่ว่ามิฉะนั้นระบุประเมินผลของการเหนี่ยวนำ IFN โดยเวลาจริง PCRElectroporated ที่ 3.75 107 เซลล์/มล. โอนย้ายไปเซลล์15 ml กลางและแบ่งเป็น 4 แผ่น แผ่นได้รับการกกสำหรับ 1, 2, 4 และ 6 ชั่วโมงตาม ด้วยการสังเคราะห์ cDNA และสกัด RNAมี oligo(dT) ด้วยเป็นอธิบาย (โรเบิร์ต et al. 2009) ควบคุมปฏิกิริยาที่ละเว้นปเทเสมอดำเนินการให้แน่ใจว่าไม่มีการปนเปื้อน DNA ตั้งแต่นกชนิด IFNs เดียวexon ยีน นิพจน์ของ IFN- -b ต่อย ซีจีเอเอส และ GAPDHmRNAs ในตัวอย่างที่ถูกกำหนด โดยเวลาจริง PCR ใช้ DCtการวิเคราะห์เป็นอธิบาย (โรเบิร์ต et al. 2009) ลำดับรองพื้นออกแบบมาเพื่อที่ระบุถูกบันทึก:มี siRNA ยีนเคาะลงเซลล์เก็บเกี่ยว และ resuspended ที่ 2.5 107 เซลล์/mlsiRNA against target or control genes (15 ml of 1 M siRNA) weremixed with 400 ml of cells, incubated at room temperature for 5 minand then electroporated as per Section 2.3. Cells were then washed146 N. Vitak et al. / Developmental and Comparative Immunology 59 (2016) 145e152with RPMI medium and incubated at 37
C for 24 h. To test inductionof type I IFNs cells were harvested and resuspended in1.4 ml of RPMI, and 400 ml was electroporated with 3 mg of DNA orthe same volume of phosphate-buffered saline (PBS) or left untreated.Cells were then plated in 2 ml of medium and incubated for3.5 h at 37
C, followed by RNA extraction and cDNA synthesis.Sequences of Stealth RNAi siRNA (Life Technologies) were:MTT assay for viabilityCells were electroporated at 2.5 106 cells/ml and 100,000 cellswere then plated in quadruplicate in 96-well tissue culture platesfor viability measurement. Reduction of the tetrazolium dye MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) toan insoluble blue product was used as an indicator of cell viability(Berridge and Tan, 1993). MTT was added to a final concentration1 mg/ml, and cells were incubated for 1 h at 37
C. After incubation,cells were solubilised overnight by adding an equal volume of 10%Triton X-100 and 0.1 N HCl in isopropanol. Absorbance wasmeasured at 570 nm. To compensate for any cell number differencesbetween experiments, MTT assay data is presented normalisedto the control sample.Flow cytometric analysis of cell deathCells were electroporated at 1 106 cells in 375 ml of completeRPMI-1640 with 25 mM HEPES and 25 ml of PBS containing nucleicacid. Cells (300 ml) excluding floating cell debris generated by theelectrical pulse were rapidly transferred to 1.5 ml microfuge tubescontaining 950 ml of complete RPMI-1640 with 25 mM HEPES. ForDNA dose response, cells were incubated for 30 min at 37
C then afinal concentration of 1 mg/ml propidium iodide (PI) was addedprior to analysis by flow cytometry on a BD Accuri C6. For real-timeflow cytometry (Stacey et al., 2016), the 950 ml of complete RPMI-1640 with 25 mM HEPES at 37
C or 4
C as indicated, was supplementedwith 1.5 mg PI prior to addition of cells. Cells weremaintained at 37
C on a heating block or in an ice/water bath, asindicated, during analysis on a BD Accuri C6 flow cytometer.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

กรดนิวคลีอิกต่อมไทมัสน่อง ( CT ) ดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอของอสุจิปลาแซลมอนและ E . coli ดีเอ็นเอคือซื้อจากซิกม่า Aldrich และบริสุทธิ์ตามที่อธิบายไว้ ( Staceyet al . , 2003 ) polyinosinic : polycytidylic น้ำหนักโมเลกุลสูงกรด ( poly ( i : C ) ได้จาก invivogen . ปริมาณดีเอ็นเอมีทั้ง a260 โดยประมาณ หรือ picogreen assay ( เทคโนโลยี )ที่โดยเฉพาะมาตรการ dsdnaelectroporationbmms ไก่และ hd-11 cells electroporated กับต่างๆกรดนิวคลีอิกใน 400 มิลลิลิตรอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 260 5 , 500 จ.ใช้ biorad genepulser MX . bmms electroporated เมาส์คือที่ 240 V , 1000 MF . เซลล์ที่ถูกบ่มที่อุณหภูมิห้องด้วยกรดนิวคลีอิก 10 นาทีก่อน electroporation เว้นแต่ระบุการประเมินโดยวิธี PCR แบบเรียลไทม์ อินเตอร์เฟียรอนเซลล์มี electroporated ที่ 3.75 107 เซลล์ / มิลลิลิตร โอนเข้ามา15 ml . ขนาดกลางและแบ่งออกเป็นสี่แผ่น จานถูกบ่ม1 , 2 , 4 และ 6 ชั่วโมงตามด้วยการสกัดอาร์เอ็นเอและดีเอ็นเอสังเคราะห์กับโอลิโก ( DT ) รองพื้นไว้ ( โรเบิร์ต et al . , 2009 ) การควบคุมผลจากปฏิกิริยา reverse transcriptase มักจะแสดงให้ให้แน่ใจว่าไม่มีการปนเปื้อนดีเอ็นเอ เพราะนกผมเฟียรอนชนิดเดียวล้อหน้าคู่ การแสดงออกของ ifn-a , - B และ cgas gapdh ต่อยรหัสในตัวอย่างโดยวิธี PCR โดยใช้ข้อมูลเวลาจริงการวิเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ ( โรเบิร์ต et al . , 2009 ) หลักลำดับที่ออกแบบมาเพื่อแสดงหลักฐาน ได้แก่บริษัทยีนเคาะลง )เซลล์เก็บ resuspended 2.5 107 เซลล์ / มิลลิลิตรบริษัทกับเป้าหมายหรือการควบคุมยีน ( 15 ml 1 M ของบริษัท ) คือ400 มิลลิลิตรผสมกับเซลล์ที่บ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาทีแล้ว electroporated ตามมาตรา 2.3 เซลล์ แล้วล้าง146 . vitak et al . การพัฒนาและเปรียบเทียบ / 59 ( 2016 ) 145e152 วิทยาภูมิคุ้มกันด้วย RPMI ขนาดกลางและบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เพื่อทดสอบการประเภทเซลล์เก็บ resuspended เฟียรอนใน1.4 กรัม RPMI และ 400 ml เป็น electroporated 3 มิลลิกรัมของดีเอ็นเอ หรือระดับเสียงเดียวกันของฟอสเฟตในน้ำเกลือ ( PBS ) หรือซ้ายไม่ถูกรักษาเซลล์แล้วชุบ 2 มิลลิลิตร และ บ่มกลางสำหรับ3.5 H ที่ 37 องศาเซลเซียส รองลงมาคือ การสกัด DNA และสังเคราะห์ cDNA .ลำดับของตัวบริษัท ( เทคโนโลยี RNAi ชีวิต ) ได้แก่การทดสอบยาสำหรับชีวิตเซลล์มี electroporated 2.5 106 เซลล์ / มิลลิลิตร และ 100000 เซลล์แล้วชุบประกอบด้วยสี่ส่วนใน 96 ดีจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อการวัด 1 . การลดลงของ tetrazolium MTT ย้อม( 3 - ( 4,5-dimethylthiazol-2-yl ) - 2,5-diphenyltetrazolium bromide )ผลิตภัณฑ์สีฟ้าน้ำถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้ของเซลล์( แบร์ริจ และ ตัน , 1993 ) MTT ได้เพิ่มความเข้มข้นสุดท้าย1 mg / ml และเซลล์ถูกบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงหลังจากระยะเวลาเซลล์มี solubilised ค้างคืน โดยการเพิ่มปริมาณเท่ากัน 10%Triton X-100 และ 0.1 N HCl ในกระแส . การดูดกลืนแสง คือวัดที่ 570 นาโนเมตร เพื่อชดเชยความแตกต่างของจำนวนเซลล์ใด ๆระหว่างการทดลอง โดยจะนำเสนอการให้ข้อมูลยากับตัวอย่างควบคุมลักษณะการไหลผ่านวิเคราะห์การตายของเซลล์เซลล์มี electroporated 1 106 เซลล์ใน 375 ml ของสมบูรณ์rpmi-1640 25 มม. และ 25 มิลลิลิตรของ PBS ฮีเปสประกอบด้วยกรดนิวคลีอิกกรด เซลล์ ( 300 มล. ) ยกเว้นลอยเศษเซลล์ที่สร้างขึ้นโดยชีพจรไฟฟ้าได้อย่างรวดเร็วโอน 1.5 ml microfuge ท่อประกอบด้วย 950 มิลลิลิตร rpmi-1640 สมบูรณ์ 25 ฮีเปสมิลลิเมตร สำหรับการตอบสนองปริมาณดีเอ็นเอ เซลล์ถูกบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีแล้วความเข้มข้นสุดท้าย 1 mg / ml propidium ไอโอไดด์ ( PI ) คือเพิ่มก่อนการวิเคราะห์ด้วยเครื่องนับเซลล์ใน BD accuri C6 . - เวลาเครื่องนับเซลล์ ( Stacey et al . , 2016 ) , 950 มิลลิลิตร - RPMI ที่สมบูรณ์26 25 ฮีเปสมิลลิเมตรที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส หรือ 4 เสริมตามที่ระบุกับ 1.5 ปี่มก. ก่อนเพิ่มเซลล์ เซลล์คือรักษาที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในบล็อคความร้อนหรือน้ำแข็ง / น้ำร้อน ,ใช้ในการวิเคราะห์ใน BD accuri C6 ไหลใช้โมโน .